混合糞便からの直接 PCR による食中毒菌核酸検査に向けた検討 1）

(1)

混合糞便からの直接 PCR による食中毒菌核酸検査に向けた検討

1）

株式会社島津製作所分析計測事業部，

^2）

財団法人東京顕微鏡院食と環境の科学センター

西村直行

^１）

高岡直子

^１）

馬場洋一

^２）

林田瑞穗

^２）

伊藤武

^２）

（平成 24 年 4 月 3 日受付）

（平成 24 年 8 月 3 日受理）

Key words : PCR, foodborne, feces

要旨

混合糞便検体からの直接 PCR で食中毒 3 菌種（ベロ毒素産生菌，サルモネラ属菌，赤痢菌）の同時検出を試みた．蒸留水で約 2.5％の濃度に調製した検便懸濁液を 95℃5 分間熱処理した後の遠心上清 5 μ L を 45 μ L の PCR master mixture に添加して PCR を実施し，MCA（Melting Curve Analysis）で検出した．その結果，50 混合糞便検体に混入させた 1 つの食中毒菌陽性糞便を個別培養法と同等の検出感度で検出することができた．本方法は大量の糞便検体から迅速，確実，さらに感度良く腸管系病原菌検出が行える方法であるので，食品取り扱い従事者からの検便検査など一度に大量の検体を処理しなければならない検査においては極めて有用な方法と考えられた．

〔感染症誌 86：741〜748，2012〕

序文

食の安全・安心を確保するには，食品そのものが食中毒菌に汚染されていないだけでなく，食品取り扱い従事者が保菌していないことも重要である．そのため，

「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律」（感染症法）

^１）

，「大量調理施設衛生管理マニュアル」

^２）

や「学校給食衛生管理基準」（学校給食法）

^３）

で，

食品取り扱い従事者の腸内細菌検査（検便）の実施が義務づけられている．通常検便検査は腸管出血性大腸菌，サルモネラ属菌，赤痢菌の培養検査をベースに行われているが，他の食中毒菌や冬季にはノロウイルス検査などが追加で実施されることも多くなってきている．

検便検査においては，通常，検査対象者が採便した検体が検査機関に輸送され，検査現場においてそれぞれ菌の培養に適した選択培地への直接塗抹により分離培養が行われる．培養後に形成された菌コロニーの形態，色などを指標に検査員が食中毒菌疑いコロニーと認めた場合には，各食中毒菌の確認培地に接種する．

確認培養後，性状が当該の食中毒菌と一致した場合に

は血清型別判定を行う．さらに，食中毒菌が腸管出血性大腸菌疑いの場合にはさらにベロ毒素産生試験やベロ毒素遺伝子の検出などが必要となる．このように培養による食中毒菌検査は煩雑かつ長時間を要するのみならず，初期判定は培養後に出現した菌コロニーの性状を検査員が目視によって行うため検査員の熟練度によっては一次判定に差が出る危険性もあり，改善の余地が存在している．

一方，個々生物種に固有の遺伝子を特異的に増幅して検出する核酸増幅検査（NAT：Nucleic acid Ampli- fication Test）法は感度，特異性，定量性，迅速性などに優れた方法であるため，食材中の食中毒菌検査

^４）

や細菌性食中毒発生時における感染疑い者の検便検

査

^{５）〜７）}

，培養が不可能なノロウイルスなどの食中毒原

因ウイルス検査

^８）

など，食の安全・安心検査にも広く使用されるようになってきた．しかし，食品取り扱い従事者検便中の食中毒菌スクリーニングにおいては検査すべき検体数が膨大であるため，個々の検体から核酸を抽出・精製して NAT を行うことが物理的に不可能などから導入が遅れていた．

検体からの核酸の抽出・精製については，我々は核酸増幅反応を阻害する生体由来物質に結合しその働きを中和する物質群を見出し，生体試料から直接 PCR

（Polymerase Chain Reaction）を可能とする試薬を 10

原著

別刷請求先：（〒604―8511）京都府京都市中京区西ノ京桑原町 1

株式会社島津製作所分析計測事業部

西村直行

(2)

年以上前に製品化（Ampdirect：島津製作所）しており

^９）

，検便からも核酸の抽出・精製することなしに直接，大腸菌 O-157 の DNA

^７）

やノロウイルスの RNA

^８）

を増幅・検出できることを示している．それでも，食品取り扱い従事者の検便検査を実施する大手検査センターの 1 日あたりの取り扱い検体数が通常数千以上であることから，検体から直接 PCR が行えるとしても個々の検体から NAT を行うことはなお極めて困難であることに変わりはない．他方，検査対象が同じく大規模な献血中の B 型肝炎ウイルス（HBV），C 型肝炎ウイルス（HCV），後天性免疫不全症候群ウイルス

（HIV）などのウイルス検出においては，数十の献血液を集めたバッチでの遺伝子検査が日常的に行われている

^１０）^１１）

．よって，食中毒菌を検査対象とした検便検査においても予め数十検体を混合したバッチでの検査が有効と考えたので，著者らは混合糞便からの直接 PCR 法による 3 種食中毒菌（ベロ毒素産生菌，サルモネラ属菌，赤痢菌）同時増幅・検出法を開発し，評価したので，ここに報告する．

材料と方法

1．検出感度検討のための DNA 調製

当施設保有の VT（Vero toxin）2 型産生大腸菌（Es- cherichia coli O157），サルモネラ属菌（Salmonella ty- phimurium），赤痢菌（Shigella flexneri）を培養後，フェノール ! クロロフォルムでの抽出，エタノール沈殿，蒸留水への再懸濁でそれぞれ菌の精製 DNA を取得した．精製 DNA の濃度と純度は 260nm と 280nm の吸光度から算出し，反応液あたり 1 から 10,000 コピーの DNA となるように添加して PCR を行い，反応系の検出感度評価に使用した．

2．PCR および検出

PCR および検出は「腸管系病原菌遺伝子検出キット（島津製作所）」を使用して行った．なお，本キットにおいては，ベロ毒素産生大腸菌検出に VT 遺伝子を共通に識別できるプライマー，サルモネラ属菌検出にエンテロトキシン遺伝子識別プライマー，赤痢菌検出に ipaH 遺伝子識別プライマーと内部コントロール

（IC）が混合されている．また，PCR 後に Melting Curve Analysis（MCA）を行う際には反応液に SYBR Green I 核酸ゲル染色液（Invitrogen）を 4,000 倍希釈で添加している．PCR は 95℃ 10min のプレヒーティング後に 95℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 60sec の 45 cycles で行った．その後 72℃ 7min，95℃ 1 min，70℃ 1min 反応させた後，0.5℃ 10sec 刻みで 95℃ まで温度を上昇させ，その間の MCA を行った．

また，一部アガロース（4％）電気泳動での解析も行った．なお，PCR および MCA は iCycler iQ リアルタイム PCR または MiniOpticon リアルタイム PCR 装置

（BIO-RAD）を使用して行った．

3．糞便添加可能量の検討

10 人のボランティアから採取した糞便を蒸留水で 20％濃度になるように懸濁，95℃ 5 分間熱処理後，

卓上の微量遠心機で 10,000rpm 3 分間遠心し，その上清を回収した．回収した上清を蒸留水で 2.5％まで 2 倍段階希釈して，その 5 μ L を 45 μ L の上記キットで作製した PCR master mixture に添加して PCR を行い，

IC 由来の PCR 産物を MCA およびアガロース電気泳動で検出した．

4．混合陰性糞便に混入させた陽性糞便からの食中毒菌関連遺伝子の検出

採便スティック（Procanal

^TM

-2 東京顕微鏡院）に付着した糞便をそれぞれ菌に適した選択培地へ直接塗抹し，分離培養を行った．培養後に各食中毒菌疑いのコロニーをカウント後，当該コロニーを確認培地へ塗抹，血清型別判定での確定を行った．血清型別などで最終的に食中毒菌と確認された感染者糞便の中から，

選択培地上でのコロニー数を指標にベロ毒素産生大腸菌陽性糞便とサルモネラ属菌陽性糞便から各 3 サンプルを選択した．また，培養で陰性であった糞便からランダムに 196 検体を選択した．それぞれの糞便検体を採取したスティック先端を 1.5mL チューブに分注した 50 μ L の蒸留水に浸漬，攪拌，蓋を閉めた後，ボルテックスにて糞便懸濁液（概ね 2.5％濃度）を作製した．各懸濁液は卓上の微量遠心機でフラッシュ，95℃

5 分間熱処理後，微量遠心機で 10,000rpm 3 分間遠心した．各陰性糞便検体の遠心上清 25μL を 49 検体分混ぜたものを 4 組作製した．陽性糞便検体からの遠心上清は沈渣を吸わないよう回収し，個別のチューブに滴下した．各陽性検体の上清 1μL を 49μL のそれぞれ 4 組の混合陰性糞便検体上清に添加し十分混合したもの（各菌種毎で合計 12 組）を陽性混合検体とした．

さらに各陽性混合検体を同一の混合陰性検体で 10 倍希釈（陽性検体混合比：1! 500），100 倍希釈（陽性検体混合比：1! 5,000）したものも作製した．各陽性混合検体およびその希釈検体と混合陰性検体のそれぞれ 5 μ L を 45 μ L の PCR master mixture に添加して PCR・MCA を行った．

5．個別陰性糞便検体からの PCR・MCA

混合陰性検体作製に使用した各陰性糞便懸濁液の加熱・遠心上清の 5μL を 45μL の PCR master mixture に添加して PCR・MCA を行った．

成績

1．検出感度試験

ベロ毒素産生大腸菌，サルモネラ属菌，赤痢菌の各

細菌株から抽出した DNA を反応液あたり 10,000 から

1 コピーとなるように添加して PCR を実施，MCA と

(3)

Fig. 1 Sensitivity of mixed primers for detecting VT gene/E.coli, enterotoxin gene/Salmonella and ipaH gene/Shigella by serially diluting DNA purified from (A) VT2-toxin-producing E. coli O157, (B) Salmonella typhimurium and (C) Shigella flexneri. Upper data showed results of MCA and lower data results of 4%

agarose gel electrophoresis, each after PCR. Lanes and symbols: Lane1/○ : 10,000; Lane2/● : 1,000;

Lane3/□ : 100; Lane4/■ : 10; Lane5/△ : 1; Lane6/▲ : 0 (copies/test); LaneM: Hinc-II-digested ϕX174 RF DNA. PCR products specific to each bacteria and internal control DNA are indicated by arrows ( ▼ and ▽ ).

Table 1 Fecal concentration determined with- out PCR inhibition. using 5 μL of fecal superna- tant (0%, 2.5%, 5%, 10%, 20%) from 10 healthy subjects (A−J). Fecal suspension was heated and centrifuged, and poured into a 45 μL PCR mixture. ＋ : positive IC−specific product de- tection. − : negative IC−specific product de- tection at MCA and agarose gel electrophore- sis.

Healthy subjects ID

Feces supernatant (%)

0 2.5 5 10 20

A ＋＋＋＋＋

B ＋＋＋＋ −

C ＋＋＋＋＋

D ＋＋＋＋ −

E ＋＋ − − −

F ＋＋＋＋ −

G ＋＋＋＋ −

H ＋＋＋＋＋

I ＋＋＋＋＋

J ＋＋＋＋＋

アガロース電気泳動で検出した結果を Fig. 1に示した．図に示す通り，PCR 後の MCA における melting temperature（Tm）は VT 遺伝子由来産物が 86℃，

サルモネラ属菌エンテロトキシン遺伝子由来産物が 89℃，赤痢菌 ipaH 遺伝子由来産物が 91℃，IC が 81℃

に検出できた．また，電気泳動においても，VT 遺伝

子，サルモネラ属菌エンテロトキシン遺伝子，赤痢菌 ipaH 遺伝子，IC 由来産物がそれぞれ 171bp，264bp，

242bp，540bp に相当する位置に検出できた．さらに，

何れの解析法での何れの菌種由来 DNA 検出においても 10 コピーが検出できた．

2．糞便添加可能量の検討

10 人のボランティアから採取した各糞便（A-J）を蒸留水で 20％になるように懸濁した液の熱処理後の遠心上清および蒸留水でのその 2 倍段階希釈液を反応液に 1! 10 量添加して PCR を実施，IC 由来の PCR 産物を MCA とアガロース電気泳動で検出した結果を纏めたのが Table 1である．Table 1に示す通り，2.5％

糞便を添加した場合は全ての検体で，5％および 10％

糞便では 9! 10，20％糞便では 5! 10 検体で PCR 産物が検出できた．

3．陽性混合糞便検体からの食中毒菌関連遺伝子の検出

選択培地での分離培養で数個から数百個検出されたベロ毒素産生大腸菌もしくはサルモネラ属菌陽性糞便の各 3 サンプルと 49 混合陰性糞便との組み合わせ（陽性検体混合比：1! 50），さらには同一ロットの混合陰性糞便での 10 倍希釈（1 段階希釈），100 倍希釈（2 段階希釈）したものからの PCR・MCA の結果を Fig.

2に示した．さらに混合陰性糞便 4 ロット分での検討

結果を纏めたのが Table 2である．

(4)

Fig. 2 MCA data after direct PCR from supernatant of 50 mixed feces. Direct PCR was performed with mixture of 1 volume of VT positive E. coli (A) or Salmonella (B) positive fecal sample (3 kinds each) and 49 volume of mixed 49 negative fecal sample (×50). These samples were diluted with the same nega- tive mixed ones (×500 and ×5,000) in addition. Symbols: ○ ; 2, ● ; 30, □ ; several hundreds colonies of VT positive E. coli, ■ ; 5, ▲ ; 50, ◇ ; several hundreds colonies of Salmonella and × ; mixed negative fe- cal sample. The specific products of PCR for each bacteria and internal control DNA are indicated by arrows ( ▼ and ▽ ).

Fig. 2で示される通り，反応陽性の場合は IC とともに VT 遺伝子またはサルモネラ属菌エンテロトキシン遺伝子に特異的な Tm ピークが，反応陰性の場合は IC 特異的な Tm ピークのみが検出できた．さらには，Table 2より，培養で 2 コロニーが検出されたベロ毒素産生大腸菌陽性検体では混合陰性糞便との混合で 4 組中 3 組（A，B，D）に，30 コロニーが検出された陽性検体では混合陰性糞便との混合の全てと 1 段階希釈の 2! 4 組（A，B）に，培養で数百コロニーが検出された陽性検体では 2 段階希釈を含む全てに，VT 特異的な PCR 産物を検出した．同様に，サルモネラ属菌検出においては，培養で 5 コロニーが検出されたサルモネラ属菌陽性検体では混合陰性糞便との混合の全てに，50 コロニーが検出された陽性検体では混合陰性検体との混合および 1 段階希釈の全てと 2 段階希釈の 4 組中 2 組（B，D）に，培養で数百コロニーが検出された陽性検体では 2 段階希釈を含む全てに，サルモネラ属菌エンテロトキシン特異的な PCR 産物が検出できた．

4．陰性糞便検体を使用した特異性の検討

混合陰性糞便作製に使用した全ての糞便（49x4：

196 検体）を本反応系に当てて個別に検討した結果が Fig. 3である．図では，49 検体ずつ纏めての PCR・

MCA の結果（A-D 群）を示しているが，大部分の検体からは VT 産生大腸菌，サルモネラ属菌，赤痢菌特異的な PCR 産物の Tm と同一のピークを検出しなかったが，一部〔VT においては 5! 196（2.6％）；A 群 1 検体，B 群 3 検体，D 群 1 検体，ipaH においては 2! 196（1.0％）；A 群 1 検体，B 群 1 検体〕に比較的少量ながらも疑わしい PCR 産物が得られた．また，

IC が検出できない検体が一部〔6! 196（3.1％）；A 群 2 検体，B 群 3 検体，D 群 1 検体〕存在した．これら一部検体については，検体調製，PCR のし直し後 MCA で再度解析したところ，Fig. 3で VT 疑い PCR 産物が検出された 5 検体のうち 2 検体で再度類似の PCR 産物が得られた（Fig. 4A）が，ipaH 疑い PCR 産物が検出された 2 検体は何れも陰性化した（Fig. 4B）．

また IC が検出できなかった 6 検体のうち 1 検体で IC 不検出が再現した（Fig. 4C）．

考察

通常，プライマーを混合したマルチプレックス PCR

においては，個別プライマーでの PCR に比べ感度，特

(5)

Fig. 3 Specificity of direct PCR using food-borne bacteria negative samples [49×4 (A-D)＝196 samples] from which negative mixed sample was made at Fig. 2 and Table 2. Approximate 2.5 % of each fecal sample (5 μL) was poured into PCR mixture (45 μL). The specific products of PCR for VT gene/E.coli, enterotoxin gene/Sal- monella, ipaH gene/Shigella and internal control DNA are indicated by arrows ( ▼ and ▽ ).

Table 2 Comparison of sensitivity between direct PCR from mixed feces and individual cultivation. Direct PCR followed with MCA was performed from various dilutions (×50, 500, and 5,000) of one sample containing VT positive E.coli or Salmonella with 4 sets of 49 mixed negative sample each (A−D).

Symboles: ＋ ; detection of target specific band, − ; detection of IC specific band only.

49 mixed negative fecal

sample ID

diluted with mixed negative sample

food-borne bacteria detected/

the number of colonies per plate VT−positive E. coli Salmonella

2 30 several

hundred 5 50 several hundred

A ×50 ＋＋＋＋＋＋

×500 − ＋＋ − ＋＋

×5000 − − ＋ − − ＋

B ×50 ＋＋＋＋＋＋

×500 − ＋＋ − ＋＋

×5000 − − ＋ − ＋＋

C ×50 − ＋＋＋＋＋

×500 − − ＋ − ＋＋

×5000 − − ＋ − − ＋

D ×50 ＋＋＋＋＋＋

×500 − − ＋ − ＋＋

×5000 − − ＋ − ＋＋

異性が低下するのが一般的な現象であるので，まずは本キットでの検出感度，特異性をベロ毒素産生大腸菌，

サルモネラ属菌，赤痢菌の各細菌株から抽出した

DNA を用いて検討した．これら 3 菌種検出用のプラ

(6)

Fig. 4 Retest of positive and non-reactive samples in the test shown in Fig 3. The same method was used and the results are indicated in the same way as the test shown in Fig 3.

A: Retest of VT-positive samples, B: Retest of ipaH-positive sam- ples, C: Retest of IC-non-detective samples.

イマーを個別で使用した場合は反応系あたり 10 コピーを検出限界とする（data not shown）が，混合して使用した場合もいずれの食中毒菌に対して反応系あたり 10 コピーの検出感度を維持していた．さらに PCR 後の MCA，アガロース電気泳動いずれの解析においても，VT 遺伝子，サルモネラ属菌エンテロトキシン遺伝子，赤痢菌 ipaH 遺伝子，IC に由来する全ての PCR 産物の分離，識別が可能であった．

本試薬キットには，生体物質由来による PCR 阻害を抑制する試薬（AmpdirectPlus：島津製作所）

^９）

が組み込まれているので検便からの直接 PCR が可能

^７）

であるが，その添加濃度の許容範囲を評価するために，10 人のボランティアから採取，熱処理した糞便懸濁液の遠心上清の 2 倍段階希釈（20〜2.5％）液を PCR 反応液に 1 ! 10 量添加して PCR を実施，MCA およびアガロース電気泳動で解析した結果，2.5％濃度で全員，5％

濃度で 10 名中 9 名の PCR が成功したことより，混合糞便検体作製時の各糞便濃度は 5％以下が妥当と判断した．

次に，陽性混合糞便検体に内在する食中毒菌検出を試みた．なお混合する糞便数は事前に行った検査センターへのインタビューなどから 50 が適当と判断した．

ベロ毒素産生菌感染者糞便とサルモネラ属菌感染者糞便の中から，それぞれ選択培地で数個，数十個，数百個のコロニーを形成した糞便を選択し，4 組の 49 人

分の混合陰性糞便の懸濁上清に 1 ! 50 量混合，さらには同じ混合陰性糞便懸濁上清で 10 倍希釈（1 段階希釈：陽性混合検体比＝1! 500），100 倍希釈（2 段階希釈：陽性混合検体比＝1! 5,000）して PCR を行った．

結果，Table 2に示された通り，数個レベルの陽性糞便を添加した場合には，混合陰性糞便との混合において 3! 4 組以上（VT：3! 4，サルモネラ：4! 4）で，数十個レベルの陽性糞便を添加した場合には 1 段階希釈の 2! 4 組以上（VT：1 段階希釈の 2! 4，サルモネラ：

2 段階希釈の 2! 4）で，数百個レベルの陽性糞便からは 2 段階希釈においていずれも 4 ! 4 組で検出できた．

以上の結果は，50 検体を混合して PCR を行った場合においても，個別培養で数個レベルの当該菌が検出できたことを示している．すなわち，本法はベロ毒素産生菌やサルモネラ属菌に感染した糞便検体を個別培養と同等以上の検出感度で検出できる能力を有していると判断できる．なお，今回は赤痢菌感染者糞便が入手できなかったので混合糞便からの赤痢菌検出の評価は実施できなかったが，Fig. 1に示す通り本菌検出用のプライマーがベロ毒素産生菌やサルモネラ属菌検出用プライマーと同等の検出感度，特異性を有していることより，同様の結果が得られるものと推測している．

次に，本検出キットに使用したプライマーの特異性

を検討するために，混合陰性糞便検体作製に使用した

全ての糞便（49x4：196 検体）を個別に本反応系に当

(7)

てて検討した結果，比較的少量ながらも 5 検体でベロ毒素遺伝子産物に類似した Tm を，2 検体で赤痢 ipaH 遺伝子産物と類似した Tm を検出し，さらに IC が検出できない検体が 6 検体存在した．そこで，これら 13 検体について検体調製，PCR を再度行い，MCA で解析したところ，1 回目で VT 疑い PCR 産物が検出された 5 検体のうち 2 検体で再度類似の PCR 産物が得られ，IC が検出できなかった 6 検体のうち 1 検体で再度の PCR 阻害が認められた．培養陰性検体で散発的に食中毒菌疑いの PCR 産物が得られた要因としては，糞便検体や採便部位，量の不均一性にも起因して少量の VNC（viable but non-culturable）菌や死菌を拾った可能性や非特異反応物が出現した可能性などが挙げられるが，今後の解析で解明していきたいと考えている．また，PCR 阻害については，阻害が生じた検体を蒸留水で 10 倍希釈して反応液に添加することで解消されることから，糞便中の阻害物質量が反応液中の中和物質の量を上回ったために起こった現象と捉えている．以上纏めると，個別検体の数％に培養で陰性，PCR・MCA で何れかの食中毒菌陽性疑い例が認められたが，陽性疑い例の PCR 産物量が比較的少量であることから，混合検体中では問題にならない程度まで希釈されたものと考えている．さらに，今回採用した採便法（採便スティック先端を 50μL の蒸留水に浸漬，攪拌）では個別検体の数％で PCR 阻害が認められるものの，大部分の検体で IC が検出されていることから，混合検体中では問題にならない程度まで阻害が希釈されたものと考えている．

核酸検査で陽性が出た場合は制度上個別検体に遡っての培養検査が必要になるが，まず混合糞便からの直接 PCR による核酸検査でのスクリーニングを行うことで，最初から個別に培養検査をする場合に比べて陰性判定が迅速に行える，廃棄物量がはるかに少なくて済むなどのメリットがある．さらに，培養後に出現した菌コロニーの性状を検査員が目視によって判断しなければならない培養法に比べて客観性が増すなどの利点もある．今後，実際の検便検査において培養法と併用で評価を行うなどで本検査法の実用化に向けた検証が必要であるが，本方法は大量の検便検体から迅速，

確実に食中毒菌を検出できる優れた方法になると考えている．

利益相反自己申告：申告すべきものなし

文献

1

）厚生労働省：感染症の予防及び感染症の患者に

対する医療に関する法律，法律第 114 号，公布平成 10 年 10 月 2 日.

2

）厚生労働省：大量調理施設衛生管理マニュアル，

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3

）文部科学省：学校給食衛生管理基準，告示第 64 号，平成 21 年 3 月 31 日.

4

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11

）横山繁樹：わが国の血液事業における核酸増幅

検査（NAT）の現状と血液事業への影響．日本

輸血学会誌 2002；48：279―85.

(8)

Direct PCR Detection of Food-borne Bacteria from Mixed Human Feces

Naoyuki NISHIMURA

^１）

, Naoko TAKAOKA

^１）

, Youichi BABA

^２）

, Mizuho HAYASHIDA

^２）

& Takeshi ITO

^２）

1)

Analytical & Measuring Instruments Division, Shimadzu Corporation,

2)

混合糞便からの直接 PCR による食中毒菌核酸検査に向けた検討 1）