Japan Advanced Institute of Science and Technology
JAIST Repository
https://dspace.jaist.ac.jp/Title
細胞サイズリポソームの新しい作製法とその応用
Author(s)
山田, 彩子; 濱田, 勉; 吉川, 研一
Citation
生物物理, 49(5): 256-259
Issue Date
2009
Type
Journal Article
Text version
author
URL
http://hdl.handle.net/10119/9889
Rights
Copyright (C) 2009 日本生物物理学会. 山田彩子, 濱
田勉, 吉川研一, 生物物理, 49(5), 2009, 256-259.
http://dx.doi.org/10.2142/biophys.49.256
Description
CiNiiへのリンク
http://ci.nii.ac.jp/naid/10025975941
A novel way to make giant liposomes: the spontaneous transfer method Ayako Yamada1, Tsutomu Hamada2, and Kenichi Yoshikawa3
1
Department of Chemistry, Ecole Normale Superieure,
2
School of Materials Science, Japan Advanced Institute of Science and Technology,
3
Department of Physics, Kyoto University 1. は じ め に 両親媒性の リ ン 脂質分子が シ ー ト 状にず ら り と 並 び ， それが二枚 ， 疎水部 を 内側に ， 親水部 を 外側に し て サ ン ド イ ッ チ状の向か い合わせに な っ た も の が ， リ ン 脂質二分子膜 （ 厚 さ は約5 nm ） で あ る ． こ の構造が ， 細胞膜やオル ガ ネ ラ 膜の主要 な 構成要素 で あ り ， 細胞お よ び細胞器官の内外 を 隔 て る 役割 を し ， 膜 タ ン パ ク 質が動 き 回 る 流動的 な 場 を 提供 し て い る ． こ の リ ン 脂質二分子膜が ， 水中で nmm ス ケ ールの小胞 と な っ た も の を リ ポ ソ ー ム と よ ぶ ． 中 で も 特大サ イ ズ （ 直径 1-100 m 程度 ） の ジ ャ イ ア ン ト ・ リ ポ ソ ー ム は ， 細胞 と 同程度の大 き さ の閉 じ た 微小空間で あ り ， 最 も 単純 な 細胞モデル ， あ る い は ， 細胞モデルの “ 器 ” と し て 長 く 興味 を ひ き つけ て き た1) ． し か し ， 特に生理学的 な 溶液条件下で は ， 細胞サ イ ズ の リ ポ ソ ー ム 作製には時間 と 手間が か か り ， 生成効率 も 総 じ て 高い と はい え な か っ た た め ， 細胞機能 を 模倣す る モデル と し て はか な り 単純 な も の に と ど ま っ て い た ． と こ ろ が近年 ， 新 た な 手 法が続々 と 試 さ れ ， DNA や タ ン パ ク 質な ど を 任意 に封入す る こ と が可能 と な り ， こ れ を 利用 し て 細胞 機能 を 人工的に再構成す る 試みが発展 し つつ あ る ． 本稿で は ， 筆者 ら の も の を 中心に ， こ れ ら の手法に つい て 紹介 し た い ． 2. 新 た な 方 向 性 従来 ， ジ ャ イ ア ン ト ・ リ ポ ソ ー ム は ， 有機溶媒 を 揮発 さ せ た あ と に形成 さ れ る リ ン 脂質の乾燥 フ ィ ル ム を ， 自発的に ， あ る いは交流電場 を か け な が ら ， 水和 ・ 膨潤 さ せ て 得 る の が主流で あ っ た ． し か し 近 年 ， Pautot ら が ， リ ン 脂質 を 溶か し た油中に水 を 分 散 さ せ て ， 界面が リ ン 脂質に覆われ た 微小 な 油中水 滴 を 得 ， こ れ を 遠心力で マ ク ロ な 水相に落 と し 込む こ と で ， ジ ャ イ ア ン ト ・ リ ポ ソ ー ム の作製に成功 し た2) ． 同手法 を 用い て ， Noireaux ら は内部で膜 タ ン パ ク 質 を 発現 し ， 機能 さ せ る リ ポ ソ ー ム の作製3) ， ま た Pontani ら は リ ポ ソ ー ム 内部で の ア ク チ ン コ ル テ ッ ク ス の形成 を 実現 し て い る 4) ． こ れ ら の例におい て 膜 タ ン パ ク 質-hemolysinが機能 し て い る こ と か ら ， 得 ら れ た 二分子膜の実用性が確認 さ れ て い る ． さ ら に ， サ イ ズ 制御 を 目的 と し て ， マ イ ク ロ 流路 を 用い た 研究 も 活発化 し た ． Funakoshi ら は ， リ ン 脂質 に覆われ た 油水界面同士 を 接触 さ せ ， そ こ に形成 さ れ る 二分子膜に ジ ェ ッ ト 水流 を 吹 き つ け る こ と で ， 均一サ イ ズ の ジ ャ イ ア ン ト ・ リ ポ ソ ー ム を 作製 し て い る 5) ． ま た ， Sugiura ら は ， 均一サ イ ズ の油中水滴 を 流路 を 用い て 効率 よ く 生成 し ， 内部 を 凍結 さ せ た の ち ， 界面活性剤 を リ ン 脂質へ ， 油相 を 水相へ ， そ れぞれ置換 し て ジ ャ イ ア ン ト ・ リ ポ ソ ー ム を 得 る 手 法 を 開発 し た 6) ． 上に挙げ た 手法に共通す る のは ， リ ン 脂質二分子 膜 を 得 る 過程で油水界面 を 援用 し て い る と い う 点で あ り ， ジ ャ イ ア ン ト ・ リ ポ ソ ー ム 作製の新 た な 方向 性 と 言 え る だ ろ う ． 筆者 ら は ， Pautot ら と 同 じ く リ ン 脂質に覆われ た 油中水滴 を リ ポ ソ ー ム の テ ン プ レ ー ト と し て い る が ， 遠心力 を 用い な い最 も 簡便 な 手 法 を 用い て い る ． 次節に概要 を 述べ る の で ， 興味 を 持 た れ た 読者はぜひ試 さ れ た い ． 3. 液 滴 か ら リ ポ ソ ー ム へ の 自 発 的 転 移 現 象
理論／実験 技術
細胞サイズリポソームの新しい作成法とその応用
山田彩子
1，濵田勉
2，吉川研一
3 1フランス高 等 師 範 学 校 化 学 研 究 科 2北 陸 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学マテリアルサイエンス研 究 科 3京 都 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科筆者 ら の手法で は ， 顕微鏡観察下 ， 油中水滴 を 自 発的に水相へ と 移行 さ せ て リ ポ ソ ー ム を 得 る こ と が で き る 7) ． 実験の概要図 を 図 1 に示す ． 厚 さ 5 mm 程度の poly-(dimethylsiloxane) （ PDMS ） シ ー ト に直径 4 mm 程度の穴 を 開 け ， カ バー ガ ラ ス に密着 さ せ た も の を チ ャ ン バー と し て 用い ， ま ず ， こ の中に水平 な 油水界面 を 形成 さ せ る （ 図 1 左 ） ． こ の と き ， 油 相に リ ン 脂質 を 溶解 さ せ て お く こ と に よ り ， 油水界 面は直 ち に リ ン 脂質膜に覆われ る ． 次い で ， リ ポ ソ ー ム 内に封入 し た い溶液数l を ， エ ッ ペ ン チ ュ ーブ 内 な ど で リ ン 脂質 を 含む油中に滴下 し て 乳化 さ せ ， 細胞サ イ ズ の油中水滴 を 得 る ． こ の油中水滴相 を 顕 微鏡観察下 ， チ ャ ン バー内の油水界面上に滴下す る と ， 油中水滴が重力に よ っ て 油水界面に到達 し ， 自 発的に界面 を 越 え ， 水相へ と 移行 し て リ ポ ソ ー ム を 形成す る （ 図 1 右 ） ． すな わ ち ， チ ャ ン バー内に あ ら か じ め静置 さ れ た 水相が リ ポ ソ ー ム の外部 を 満 た す溶液相 と な り ， 油中水滴に封入 さ れ た 溶液が そ の ま ま リ ポ ソ ー ム 内部 と な る ． 本手法で は ， 生理学的 な 塩濃度の溶液で あ っ て も リ ポ ソ ー ム 内に容易に封入す る こ と が で き ， リ ポ ソ ー ム 内外の溶液は ， 浸透圧 さ え 等 し け れば自在に選 ぶ こ と が で き る ． ま た ， リ ポ ソ ー ム に封入す る サ ン プル量は数l と 少量で よ い と い っ た利点が あ る ． さ ら に ， 乳化か ら リ ポ ソ ー ム 形成に要す る 時間は数分 程度 と 短い た め ， 生化学反応系 を 封入 し た 場合 な ど ， 反応開始直後か ら の観察が可能で あ る ． 本手法 に よ っ て 得 ら れ る リ ポ ソ ー ム は ， 上部が油水界面に 接着 し て い る た め ， 多数の リ ポ ソ ー ム が同時に観察 さ れ ， 各々の リ ポ ソ ー ム の時間変化 を 追 う こ と が可 能 と な る ． ま た ， 内外溶液の比重 を 変 え れば ， 重力 に よ っ て 自発的に油水界面か ら 引 き 剥がす こ と も で き る 8) ． さ ら に ， 次節に述べ る よ う に ， チ ャ ン バー 内の油水界面 を 覆 う リ ン 脂質 ， 油中水滴表面 を 覆 う リ ン 脂質に ， それぞれ別の も の を 用いれば ， リ ポ ソ ー ム の内 ・ 外層膜の脂質組成が異 な る 「 非対称 リ ポ ソ ー ム 」 を 作製す る こ と が で き る ． こ の よ う に ， 本手法に よ っ て ， 従来法で は困難で あ っ た 様々 な 条件の ジ ャ イ ア ン ト ・ リ ポ ソ ー ム を 得 る こ と が で き る ． し か し な が ら ， 膜間に わずかに油 が残存 し て い る 可能性が排除で き な い こ と か ら ， 目 的に よ っ て は適 さ な い こ と も あ る だ ろ う ． 改良の余 地は多分に あ り ， ま た 従来法 も ， 着々 と 工夫が重ね ら れ て き て い る ． 様々 な 手法 を 比較 し て ， 目的に適 っ た も の を 選ばれ た い （ オ ン ラ イ ン ジ ャ ーナル電子 付録の比較表参照 ） ． 4. 応 用 4.1 非 対 称 な “ 脂 質 組 成 ” を 有 す る リ ポ ソ ー ム 上 で の 膜 ミ ク ロ ド メ イ ン 形 成 筆者 ら は ， 本手法の原理 を 利用 し て ， リ ポ ソ ー ム の内層膜 と 外層膜 と の脂質組成が異 な る 細胞サ イ ズ 非対称 リ ポ ソ ー ム を 作製 し ， 非対称膜上で の ミ ク ロ ド メ イ ン 観察に成功 し て い る 8) ． 図 1 に示 し た よ う に ， 本手法で は ， 油水界面の単分子膜が油中液滴 を 覆 っ て い た 単分子膜 と 結合 し ， 二分子膜で あ る リ ポ ソ ー ム が形成 さ れ る ． よ っ て ， 異 な る 脂質組成の単 分子膜 を 用意す る こ と で ， 非対称 な 二分子膜 を 備 え た リ ポ ソ ー ム を 作 り 出す こ と が で き る ． 図 2 は外層 膜が単一脂質 ， 内層膜が 3 成分脂質 （ 飽和脂質 ， 不 飽和脂質 ， コ レ ス テ ロ ール ） か ら 成 る 非対称 リ ポ ソ ー ム の蛍光像で あ る ． こ の 3 成分系では ， 相分離に よ り 膜 ミ ク ロ ド メ イ ン が形成 さ れ る ． 生細胞膜で は ， 受容体 タ ン パ ク 質等が膜 ミ ク ロ ド メ イ ン （ 例 え ば脂質 ラ フ ト ） に集積 し ， シ グ ナル伝達の場 と し て 図 1 実 験 の 概 要 図 ． PDMS に 直 径 4 mm 程 度 の 穴 を 開 け た チ ャ ン バ ー 内 に ， 油 水 界 面 を 形 成 さ せ ， 細 胞 サ イ ズ の 油 中 水 滴 を 加 え る （ 左 図 ） ． 油 中 水 滴 は 重 力 に よ っ て 油 水 界 面 ま で 達 し ， 自 発 的 に 水 相 へ と 移 行 す る ． 油 水 界 面 は あ ら か じ め 油 中 に 溶 解 し た リ ン 脂 質 に よ っ て 覆 わ れ て お り ， 水 相 内 で リ ポ ソ ー ム を 形 成 す る （ 右 図 ， 左 は 位 相 差 顕 微 鏡 像 ） ． 図 2 非 対 称 リ ポ ソ ー ム の 相 分 離 ． 外 層 膜 の み （ Ａ ） お よ び 内 層 膜 の み （ Ｂ ） に ， 蛍 光 色 素 を 加 え て ド メ イ ン 構 造 を 可 視 化 し て い る ． 染 色 に は ， 流 動 性 の 低 い ド メ イ ン 領 域 を 避 け て 膜 内 に 分 布 す る 蛍 光 色 素 を 用 い た ． （ 図 は ACS ， J. Phys. Chem. B よ り 許 可 を 得 て 改 変 ． Copyright 2008 American Chemical Society ）
機能す る と 考 え ら れ て い る ． 外層膜のみ （ 図 2A ） お よ び内層膜のみ （ 図 2B ） に蛍光色素 を 加え た顕 微観察か ら ， 内層膜に のみ ド メ イ ン 構造が形成 さ れ て い る こ と が確認で き る ． こ の よ う に本手法 を 用い て ， 細胞膜内外層の 「 縦 」 の非対称性 と ， 膜 ミ ク ロ ド メ イ ン に代表 さ れ る 「 横 」 の非対称性 を 同時に再 構成す る こ と に成功 し た ． 細胞膜 イ ン タ ー フ ェ イ ス にお け る シ グ ナル変換プ ロ セ ス が機能す る には ， 非 対称 な 脂質組成の内 ・ 外層膜で形成 さ れ る 膜 ド メ イ ン が協同的に働 く 必要が あ る ． 縦横の非対称性の カ ッ プ リ ン グ 機構の解明は ， 今後の重要 な 課題で あ る ． ま た ， こ れ ま で困難で あ っ た ， 非対称 リ ポ ソ ー ム の力学的性質や膜ダ イ ナ ミ ク ス の解析実験が可能 と な る こ と で ， 複雑 な 生細胞膜の物性理解の進展が 期待 さ れ る ． 4.2 ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト と HMMの 共 封 入 細胞骨格の主要 な 構成要素の一つで あ る ア ク チ ン は ， 細胞が形作 ら れ ， 変形 し ， 動 く た め に ， モー タ ー タ ン パ ク 質 と 協同 し て 重要 な 役割 を 担 っ て い る こ と が知 ら れ て い る ． 種々の複雑 な 細胞機能か ら こ の 機構のみ を 抽出 し て 理解す る た め には ， 最小限の要 素 を 封入 し た 細胞サ イ ズ リ ポ ソ ー ム を モデル と し た ， 構成論的 な ア プ ロ ーチが有効で あ る と 考 え ら れ る ． そ こ で ， Takiguchi お よ び筆者 ら は ， 従来は困難 で あ っ た ， 高濃度の ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト と モー タ ー タ ン パ ク 質の同時封入 を ， 本手法 を 用い て 試み た （ 図 3 ） 9) ． そ の結果 ， 5 mM MgCl 2 ・ 50 mM KCl 存在下 ， 細胞内 と 同程度の濃度 （ 200 µM ） の ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト を 封入す る こ と が で き た だ け で な く ， ミ オ シ ン II か ら 得た モー タ ー タ ン パ ク 質 heavy meromyosin （ HMM ） お よ び S-1 を 同時封入す る こ と に成功 し た ． ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト のみ封入 し た リ ポ ソ ー ム 内で は ， ア ク チ ン は均一に分布 し ， リ ポ ソ ー ム の変形は見 ら れ な か っ た （ 図 3A ） ． ま た ， ア ク チ ン 結合部位 を 一つ し か持 た な い S-1 を 過剰に 加 え て 封入 し た 場合に も ， 同様に変化は見 ら れ な か っ た （ 図 3B ） ． それに対 し ， ア ク チ ン 結合部位 を 二つ有す る HMM を 共に封入 し た場合には ， ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト の束化が起 こ り ， それに伴 っ て リ ポ ソ ー ム の変形が引 き 起 こ さ れ た （ 図 3C ） ． こ の系 を 足が か り と し ， リ ポ ソ ー ム の変形だ け に と ど ま ら ず ， モー タ ー タ ン パ ク 質 を 駆動 さ せ る こ と に よ る 自 発的 な 運動 な ど ， さ ら な る 細胞骨格 ・ 細胞運動の モ デルへの発展が期待 さ れ る ． 4.3 遺 伝 子 発 現 キ ネ テ ィ ク ス の リ ア ル タ イ ム 観 察 本手法で は リ ポ ソ ー ム への試料封入に要す る 時間 が短 く ， 同時に多数の リ ポ ソ ー ム を 観察す る こ と が で き る ． こ の特長 を 生か し ， Saitoお よ び筆者 ら は ， 多数の リ ポ ソ ー ム 内で の遺伝子発現 キ ネ テ ィ ク ス を ， 反応開始直後か ら リ ア ル タ イ ム で計測す る こ と に成功 し て い る （ 図 4 ） 10)． 必要最小限の要素 を 精 製 ・ 再構成 し た 無細胞発現系 を 用い ， DNA お よ び mRNA を テ ン プ レ ー ト と し て ， 発現お よ び翻訳反応 それぞれについ て ， キ ネ テ ィ ク ス を 多数の リ ポ ソ ー ム か ら 同時に得 ， 比較検討 を 行 う こ と が初め て 可能 と な っ た ． そ の結果 ， 全体平均で は ， バル ク 中で の 反応 と 同様の キ ネ テ ィ ク ス を 示すが ， m ス ケール 図 3 （ 上 ） モ ー タ ー タ ン パ ク 質 ミ オ シ ン II お よ び 本 実 験 に 用 い ら れ た 部 位 HMM ， S-1 と ア ク チ ン フ ィ ラ メ ン ト （ FA ） の 模 式 図 ． （ 下 ） FA の み （ A ） ， FA と S-1 を 同 時 封 入 し た リ ポ ソ ー ム （ B ） で は ， 内 部 の FA が 均 一 に 分 布 し ， リ ポ ソ ー ム 像 も 円 形 を 保 っ た ま ま で あ る の に 対 し ， FA と HMM を 共 に 封 入 し た リ ポ ソ ー ム （ C ） 内 で は ， FA が 不 均 一 に 束 化 し ， リ ポ ソ ー ム の 変 形 が 認 め ら れ た ． 並 列 し た 画 像 左 は ア ク チ ン の 蛍 光 顕 微 鏡 像 ， 右 は 透 過 光 像 ． ス ケ ー ル バ ー は 10 µm ． （ 図 は ACS ， Langmuir よ り 許 可 を 得 て 改 変 ． Copyright 2008 American Chemical Society ）
で個々の リ ポ ソ ー ム につい て 見 る と ， 広いば ら つ き が あ る こ と が明 ら か と な っ た ． 5. お わ り に 本稿で は ， 細胞サ イ ズ リ ポ ソ ー ム の新 し く 簡便 な 作製法 を 紹介 し た ． 本稿が ， 細胞モデル構築 ， ひい て は細胞機能の構成論的研究の一助 と な れば幸い で あ る ． 近年 ， 国際的に見 て ， こ う し た 試みが非常に 活発に な っ て お り ， よ り “ 細胞 ら し い ” 構造や機能 を 持つモデルが構築で き る よ う な 時代に来 て い る と 思われ る ． 今後の進展が楽 し みで あ る ． 謝 辞 本稿で紹介 し た 研究成果の共同研究者で あ る 名古 屋大学の瀧口金吾博士 ， 瀧口陽子博士 ， 京都大学の 齋藤博英博士 ， 根岸真紀子氏 ， 山中透氏 ， 長谷政彦 氏 ， 北陸先端科学技術大学院大学の高木昌宏教授に 深 く 感謝の意 を 表す る ． ま た ， 日頃 よ り 貴重 な 議論 を し て い た だ い て い る フ ラ ン ス 高等師範学校の Damien Baigl 博士 ， 京都大学の野村 M. 慎一郎博 士 ， 本稿 を 精読 く だ さ っ た 京都大学の柳沢実穂博 士 ， 辻明彦博士に感謝申 し 上げ る ． 本研究は ， JST の ICORP プ ロ ジ ェ ク ト ， 科研費学術創成お よ び特定 領域研究助成の下行われ た ． 文 献 1) 野 村 M. 慎 一 郎 , 山 田 彩 子 , 吉 川 研 一 生 物 物 理 48, 174-179, お よ び そ の 引 用 文 献 ．
2) Pautot, S., Frisken, B. J. and Weitz, D. A. (2003) Langmuir 19, 2870-2879.
3) Noireaux, V. and Libchaber, A. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 101, 17669-17674.
4) Pontani, L.-L., van der Gucht, J., Salbreux, G., Heuvingh, J., Joanny, J.-F. and Sykes, C. (2009) Biophys. J. 96, 192-198. 5) Funakoshi, K., Suzuki, H. and Takeuchi, S. (2007) J. Am.
Chem. Soc. 129, 12608–12609.
6) Sugiura, S., Kuroiwa, T., Kagota, T., Nakajima, M.,Walde, P., Sato, S., Mukataka, S. and Ichikawa, S. (2007) Langmuir 24, 4581-4588.
7) Yamada, A., Yamanaka, T., Hamada, T., Hase, M., Yoshikawa, K. and Baigl, D. (2006) Langmuir 22, 9824-9828. 8) Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y.,
Vestergaard, M. and Takagi, M. (2008) J. Phys. Chem. B 112, 14678–14681.
9) Takiguchi, K., Yamada, A., Negishi, M., Tanaka-Takiguchi, Y. and Yoshikawa, K. (2008)Langmuir 24, 11323-11326.
10) Saito, H., Kato, Y., Le Berre, M., Yamada, A., Inoue, T., Yosikawa, K. and Baigl, D. ChemBioChem in press.
山 田 彩 子 （ や ま だ あ や こ ） 日 本 学 術 振 興 会 海 外 特 別 研 究 員 2008 年 京 都 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 博 士 課 程 修 了 ． 理 学 博 士 ． 06-07 年 度 日 本 学 術 振 興 会 特 別 研 究 員 ． 研 究 内 容 ： 構 成 論 的 手 法 に よ る 動 的 細 胞 機 能 の 研 究
連 絡 先 ： Department of Chemistry, Ecole Normale Superieure, 24 rue Lhomond, 75005 Paris, France E-mail ： [email protected] 濵 田 勉 （ は ま だ つ と む ） 北 陸 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学 マ テ リ ア ル サ イ エ ン ス 研 究 科 助 教 2006 年 京 都 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 博 士 課 程 修 了 ． 理 学 博 士 ． 04-05 年 度 日 本 学 術 振 興 会 特 別 研 究 員 を 経 て ， 06 年 よ り 現 職 ． 研 究 内 容 ： 細 胞 モ デ ル 小 胞 の 秩 序 構 造 形 成 と 動 的 膜 挙 動 連 絡 先 ： 〒 923-1292 石 川 県 能 美 市 旭 台 １ 丁 目 １ 番 地 E-mail ： [email protected] http://www.jaist.ac.jp/~t-hamada/index.html 吉 川 研 一 （ よ し か わ け ん い ち ） 京 都 大 学 大 学 院 理 学 研 究 科 教 授 1976 年 京 都 大 学 大 学 院 工 学 研 究 科 博 士 課 程 修 了 ． 工 学 博 士 ． 徳 島 大 学 ， 名 古 屋 大 学 を 経 て ， 98 年 よ り 現 職 ． 研 究 内 容 ： 生 命 現 象 の 物 理 学 ・ 非 線 形 科 学 連 絡 先 ： 〒 606-8502 京 都 市 左 京 区 北 白 川 追 分 町 E-mail ： [email protected] http://www.yklab.jp/ 図 4
多 数 の リ ポ ソ ー ム 内 で の EGFP (enhanced green fluorescent protein) 発 現 の 同 時 観 察 ． 発 現 反 応 開 始 か ら ， リ ポ ソ ー ム へ の 封 入 ， 観 察 を 始 め る ま で に 要 す る 時 間 は 数 分 程 度 で あ り , 個 々 の リ ポ ソ ー ム 内 で の 発 現 キ ネ テ ィ ク ス を 追 う こ と が で き る ． 画 像 は ， 反 応 開 始 か ら 135 分 後 の 共 焦 点 蛍 光 顕 微 鏡 像 ． ス ケ ー ル バ ー は 100 µm ．
Appendix
ジャイアント・リポソーム作製法の比較
文 献
1) Bangham, A. D., Standish, M. M. and Watkins, J. C. (1965) J. Mol. Biol. 13, 238-252. 2) Angelova, M. I. and Dimitrov, D. S. (1986) Faraday Discuss. Chem. Soc. 81, 303-311.
3) (a) Pautot, S., Frisken, B. J. and Weitz, D. A. (2003) Langmuir 19, 2870-2879 . (b) 手法の初出は，ナノメートルサイズのリポソーム作製における Zhang, L., Hu, J. and Lu, Z. (1997) J. Colloid Interface Sci. 190, 76-80.
4) Yamada, A., Yamanaka, T., Hamada, T., Hase, M., Yoshikawa, K. and Baigl, D. (2006) Langmuir 22, 9824-9828.
作製法
Natural swelling1 Electro‐formation2 Centrifugation3 Spontaneous transfer4
（本手法） Microfluidics5 概要 リン脂質乾燥フィルムに 試料溶液を加え，静置す る． リン脂質乾燥フィルムに 試料溶液を加え，交流電 場をかける． リン脂質に覆われた油中 水滴をテンプレートと し，遠心力で水相へ落と し込む． リン脂質に覆われた油中 水滴をテンプレートと し，自発的に油水界面を 越えさせる． マイクロ流路を用いて均 一サイズのリポソーム， あるいはテンプレートと なるダブルエマルション や油中水滴を作成する． 難易度 易 易 易 易 難 試料封入に要する時間 長 やや長 短 短 やや短 試料の必要量 数 10 ‐ 100 µl 数 10 ‐ 100 µl 数 µl 数 µl 数 10 ‐ 100 µl 生理学的塩濃度での作成 やや難6 難7 易 易 易 内外で異なる溶液組成 不可（要外液交換） 不可（要外液交換） 可 可 可 非対称膜リポソーム 不可 不可 可8 可9 不可 サイズ制御 不可 やや可10 不可 やや可9 可 その他 細胞モデル研究に最もよ く使われ，広く適用可能 な手法．高塩濃度では生 成効率が低かったが， 種々の新手法が開発され ている6．多重膜になりや すい． 一重膜のリポソームが多 量に得られる．塩濃度が 10 mM 以上になると作製 が困難だが，様々な工夫 がなされている7． 試料の封入が短時間で簡 単にできる．リポソーム が溶液中に分散されるた め，観察視野内に得られ るリポソーム数は少な い．膜間に油残存の可能 性あり． 試料の封入が短時間で簡 単にできる．多数のリポ ソームが油水界面に接着 しており，作製直後から のリアルタイム観察が可 能．内外溶液の比重を変 え，重力で油水界面から 剥がすことも可能9．膜間 に油残存の可能性あり． 均一サイズのリポソーム が得られる．マイクロ流 路技術が必要．膜間に油 残存の可能性あり．
Appendix
5) (a) Funakoshi, K., Suzuki, H. and Takeuchi, S. (2007) J. Am. Chem. Soc. 129, 12608–12609. (b) Shum, H. C., Lee, D., Yoon, I., Kodger, T. and Weitz, D. A. (2008) Langmuir 24, 7651-7653 (c) Sugiura, S., Kuroiwa, T., Kagota, T., Nakajima, M.,Walde, P., Sato, S., Mukataka, S. and Ichikawa, S. (2007) Langmuir 24, 4581-4588.
6) (a) Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R. and Mayer, M. (2009) J. Am. Chem. Soc. 131, 1810-1819. (b) Yamashita, Y., Oka, M., Tanaka, T. and Yamazaki, M. (2002) Biochim. Biophys.Acta 1561, 129–134.
7) (a) Pott, T., Bouvrais, H. and Meleard, P. (2008) Chem. Phys. Lipids 154, 115-119. (b) Estes, D. J. and Mayer, M.(2005) Biochim. Biophys. Acta 1712, 152–160. 8) Pautot, S., Frisken, B. J. and Weitz, D. A. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10718-10721.
9) Hamada, T., Miura, Y., Komatsu, Y., Kishimoto, Y., Vestergaard, M. and Takagi, M. (2008) J. Phys. Chem. B, 112, 14678–14681. 10) Diguet, A., Le Berre, M., Chen, Y. and Baigl, D. (2009) Small, in press. (doi : 10.1002/smll.200900368)
