Rokitamycinのin
vitro抗Chlamydia活
性 と実 験 的 マ ウ ス
Chlamydia
psittaci肺 炎 に お け る 治 療 効 果 の 検 討
二 木
芳 人 ・木 村
雅 司 ・窪 田
好 史 ・副 島
林 造
川崎医科大学呼吸器内科*
(平成6年8月24日
受付 ・平成6年9月28日
受理)
経 口16員 環 系 マ ク ロ ラ イ ド薬rokitamycin (RKM)の 呼 吸 甜 系 各 種Chlamydia感 染 症 に 対 す る有 用 性 を評 価 す る 目的 で,各 種Chlamydia標 準 株 に 対 す るMICを 測 定 し,あ わ せ て マ ウ スChlamydia psittaci肺 炎 モ デ ル を用 い た 感 染 治 療 実 験 を行 い 他 剤 と比 較 し た 。 そ の 結 果, RKMのMICは0.063∼0.125μg/mlと,erythromycin, roxithromycinに 勝 る優 れ た も の で あ っ た が,治 療 実 験 成 績 で は 他 剤 に 劣 る結 果 で あ っ た 。 さ ら に,RKM投 与 時 の マ ウス 血 漿 中 濃 度 を検 討 し た 結 果,RKMは 同 血 漿 中 で は速 や か に 抗 菌 活 性 の 低 い 代 謝 物 に 代 謝 され る こ とが 明 ら か とな り,MIC値 と治 療 効 果 に お け る 差 は こ れ に も と つ く もの と結 論 され た 。 ヒ ト に お け るRKMの 血 漿 中 代 謝 は 異 な る も の で あ り,ヒ トで の 臨 床 的 有 用 性 は 期 待 し う る もの で あ る と考 え られ た 。Key words: rokitamycin, C. psittdzci肺炎 モ デ ル,血 漿 中 濃 度,血 漿 中 代 謝 物
Chkmydia sp. は現在 までに Chlamydia Psittaci, Chlamy-dia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia pecorumの4種 が分 離確 認 され,こ の う ち,ヒ トの 呼吸 器 系 感 染 症 で は,前3者 の病 原 性 が 確 認 さ れ て い る。 特 に C. pneumoniaeは,最 近 の疫 学 調 査 で若 年 者 か ら高 齢 者 まで 幅広 く,咽 喉 頭 炎,気 管 支 炎,さ らに肺 炎 な ど様 々 な 感 染 を高頻 度 に原 因 す る こ とが 明 らか にな っ て お り,そ の 市 中感 染 症 に お け る重要 性 が再 認 識 され て い る。
Chlamydia感 染 症 の 治 療 に は,erythromycin (EM), minocycline (MINO), doxycycline (DOXY)な どが 第 一 選 択 と さ れ て き た が ,1980年 代 後 半 か ら登場 した rokitamycin (RKM)を 初 め とす るclarithromycin (CAM), roxithromycin (RXM)の いわ ゆ るニ ュ ーマ ク ロ ライ ドは, 抗Chlamydia活 性 の 向 上,体 内 動 態 の 改 善 な どが評 価 さ れ,そ の安 全性 も高 い こ とか ら,Chlamydia呼 吸器 感 染 症 にお け る経 口 治療 薬 の第 一 選択 薬 と され る に至 っ てい る。
本報 で は,RKMの 抗Chlamydia活 性 をin vitro, in vivoで 再 評 価 し,あ わ せ て動 物 に お け るRKMの 体 内 動 態 の 特殊 性 と治療 効 果 の 相 関 に つ いて も,そ の 血 漿中 代 謝 を中 心 に検 討 したの で以 下 に報告 す る。 I. 材 料 ・ 方 法 1. 使 用 薬 剤 RKM(旭 化 成 工 業 株 式 会 社),EM(ダ イ ナ ボ ッ ト 株 式 会 社),MINO(日 本 レ ダ リ ー 株 式 会 社),CAM (大 正 製 薬),RXM(日 本 ル セ ル 株 式 会 社)を 以 下 の 各 実 験 系 で 用 い た 。 2. 使 用 菌 株 今 回 使 用 し たChlamydia標 準 菌 株 は以 下 の ご と く で あ る。 C. psittaci Budgerigar no 1株 は 国 立 予 防学 研究 所, Clifornia 10株(Cal 10)は 川 崎 医 科 大 学 微 生物 学教 室 よ り各 々 分 与 を 受 け た。C. trachomatis D/UW-3/ Cx株,E/UW-5/Cx株,L2/434/Bu株 お よ びC. pneumoniae TW-183株 は ワ シ ン ト ン大 学 よ り購入 した 。 3. 最 小 発 育 阻 止 濃 度 最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)測 定 に つ い て は 日本化 学 療 法 標 準 法1)に 従 い行 っ た 。 す な わ ちHeLa 229細 胞 を 直 径14mmの カバ ー グ ラ ス を 入 れ た24穴 プ レ ー トに て培 養 し,細 胞 が完全 に 単 層 とな っ た 状 態 でC. pneitmonide, C. psittaci, C. trachomatisを そ れ ぞ れ104IFU/wellの 菌 量 にて 接 種 し た 。 そ れ ぞ れ の 株 の 至 適 条 件 に て培 養 し,C. pneumoniae, C. trachomatisは 感 染72時 間,C. psittaciは 感 染48時 間 培 養 し,カ バ ー グ ラ ス を100% メ タ ノ ー ル に て 固 定,Fluorescein isothiocyanate (FITC)標 識 ク ラ ミ ジ ア 属 特 異 的 モ ノ ク ロナ ル抗体 (カ ル チ ャ ー セ ッ ト:オ ル ソー)に て染 色 し判 定 を行っ * 倉敷市松島577
VOL.42 NO .12 Rikitamycinの 抗Chlamydia活 性 1343 た 。 判 定 は ク ラ ミ ジ ア 封 入 体 形 成 が 完 全 に阻 止 され た 最 小 発 育 濃 度 を も っ てMIC値 と した 。 4. C. psittaci感 染 マ ウ ス の 治 療 効 果 5週 齢MCHマ ウ ス(日 本 ク レ ア)を1群10匹 ず つ 用 い た 。 マ ウ ス を ク ロ ロ ホ ル ム に て 吸 入 麻 酔 し た 後,C. psittaci 106IFU/mlに 調 整 し た 菌 液0.1mlを マ イ ク ロ ピペ ッ トに て 点 鼻 感 染 した 。 感 染24時 間 後 よ り5%ア ラ ビ ア ゴ ム に懸 濁 した 各 薬 剤 を10mg/kg , 20mg/kg治 療 の2群 で そ れ ぞ れ1日2回 経 口 投 与 を 行 っ た。 薬 剤 の 効 果 は感 染7日 目 の 生 存 率 に て判 定 し た 。 5. マ ウ ス 血 漿 中 のRKM濃 度 測 定 使 用 動 物:マ ウ ス はSlc-ddY系 雄 性 マ ウ ス(日 本 ク レア,7週 齢)を 使 用 し た 。 薬 剤 お よ び 投 与 方 法:RKMを0.5%カ ル ボ キ シ メ チ ル セ ル ロー ス に 懸 濁 し,そ の0.5mlを 絶 食 下 で 経 口投 与 した 。 薬 剤 投 与 量 は,200, 500, 1 ,000mg/kg の単 回 投 与 と し た 。 薬 剤 濃 度 測 定:薬 剤 投 与 後,経 時 的 に マ ウ ス を 屠 殺 し,心 臓 採 血 を行 っ た 。 採 取 し た 血 液 は デ ィ イ ソ プ ロ ピル フ ル オ ロ リ ン酸(7.5mM)処 理 を 行 い,氷 冷 下 保 存 後3,000rpm,10分 間 遠 心 分 離 を 行 っ て 得 た 血 漿 を 森 下 ら の 方 法2)に よ り ア セ トニ ト リル を 用 い て 抽 出 した 。 得 られ た ア セ トニ ト リル 層 を減 圧 下 乾 固 し, 20%ア セ トニ ト リル 含 有1/15Mリ ン酸 緩 衝 液(pH 6.5)で 溶 解 し た 液 を試 料 と した 。 こ の 試 料 を 用 い て 抗 菌 活 性 か ら血 漿 中 濃 度 を 測 定 し た。 6. 血 漿 中 代 謝 物 の 検 索 経 時 的 に 採 血 し た血 漿 に つ い て はthin-layer chro-matography (TLC)/Bio-autographyを 用 い て 抗 菌 活 性 物 質 の 検 索 を行 っ た 。 試 料 の 調 製 は森 下 ら の 方 法2) に従 い 行 っ た 。 ク ロ ロ ホ ル ム-メ タ ノ ー ル(1:2)溶 液 に溶 解 し てsilica gel 60art. 5721(メ ル ク社 製)に ス ポ ッ トし た 。 展 開 溶 媒 は ク ロ ロ ホ ル ム:メ タ ノー ル: 酢 酸:水(70:11:8:2)を 用 い て15cm展 開 し た 。 展 開 後,抗 菌 活 性 物 質 の 検 出 はMicrococcus luteus ATCC 9341を 用 い て,普 通 寒 天 培 地(pH8.0)37℃, 18時 間 培 養 して 行 っ た 。 II. 成 績 1. 最 小 発 育 阻 止 濃 度 MINOのMIC値 は3株 す べ て0.015μg/ml, EM はTW-183, Budgerigar 0.25μg/ml, D株 は0.5μg/ ml, RKMはTW-183, Budgerigar株0.063μg/ml, D株0.125μg/ml, CAMは3株 す べ て0.015μg/ml, RXMはTW-183, Budgerigar 0.125μg/ml, D株 0.25μg/mlで あ っ た(Table 1)。 2. C. psittaci感 染 マ ウ ス の 治 療 効 果 20mg/kg治 療 群 で は,未 治 療 マ ウ ス が 感 染7日 目 ま で に 全 例 死 亡 し た の に 対 し て,MINO, CAM, RXM治 療 マ ウ ス の感 染7日 目 の生 存 率 は100%で, 感 染14日 目 に お い て も 同 様 で あ っ た 。EMは7日 目 で は100%, 14日 目 で70%の 生 存 率 で あ っ た 。RKM は感 染3日 目 で80%, 7日 目 で40%, 12日 目 で 全 例 死 亡 した(Fig. 1)。 10mg/kg治 療 群 の7日 目 の 生 存 率 で は 未 治 療 群 は 全 例 死 亡 し た の に対 し,7日 の 治 療 群 の 生 存 率 は 各 々 MINO, CAM, RXM, 100%, EM70%, RKM 60% で あ っ た 。EM, RKMは そ れ 以 降 も死 亡 数 の 増 加 が み ら れ,EMは10日 目 で 全 例 死 亡 し,RKMは 感 染 14日 目で10%の 生 存 率 で あ っ た(Fig. 2)。 3. マ ウ ス 血 漿 中 のRKM濃 度 測 定 RKMを200, 500ま た は1,000mg/kg経 口 投 与 し た と き の 血 漿 中 濃 度 の 推 移 をFig. 3に 示 し た 。 い ず れ の 投 与 量 に お い て も投 与 後15分 に は血 漿 中 濃 度 は 最 高 値 を示 し,そ の 値 は 各 々2.4, 10.6, 14.4μg/ml で あ っ た 。 また,時 間 の経 過 と と も に減 少 し,投 与 後 4時 間 で は検 出 限 界 以 下,0.31, 1.96μg/mlで あ っ た 。 4. 血 漿 中代 謝 物 の 検 索 RKMを500mg/kg経 口 投 与 し た と き の 血 漿 中
Fig. 1. Survival rates of mice infected with Chlamydia psittaci and treated with 20 mg/ kg of minocycline (•œ), clarithromycin (•£), roxithromycin(•¡), erythromycin (•›), or rokitamycin (•¢) twice daily for seven days.
Control (• ) received 5% gum arabic.
Fig. 2. Survival rates of mice infected with Chlamydia psittaci and treated with 10 mg/ kg of minocycline (•œ), clarithromycin(•£), roxithromycin (•¡), erythromycin (•›), or rokitamycin (•¢) twice daily for seven days. Control (• ) received 5% gum arabic.
Fig. 3. Plasma concentration of rokitamycin (RKM) after oral administration in fasted mice.
Mice received 200 mg/kg (•œ), 500 mg/kg (•›), or 1,000 mg/kg (•¢) of RKM.
Fig. 4.
Bio-autogram
of plasma
after
oral
administration
of rokitamycin
(500 mg/kg)
in fasted mice.
RKMお よ び そ の 代 謝 物 を 経 時 的 に 検 討 したTLC/ Bio-autogramをFig.4に 示 し た 。RKM投 与 後15 分,1,2時 間 に お い て 未 変 化 体 で あ るRKMは 検出 され ず,leucomydnA7(LMA7)お よびleucomycin V(LMV)が 主 要 代 謝 物 と し て 検 出 さ れ た。LMV よ り,さ ら にrateofnow(Rf)値 の小 さな スポツ トが 投 与 後1時 間 を最 高 に,わ ず か で あ るが 認 め られ た。 III.考 察 ク ラ ミ ジ ア 呼 吸 器 感 染 症 の 中 で 特 にCpm露 脚 醐 は,成 人 に お い て 広 く抗 体 保 有 が 認 め られ3,4),また, 集 団 内 流 行 も報 告 さ れ て い る こ とよ り呼 吸器 感 染症 の 普 遍 的 な 病 原 微 生 物 と考 え られ る 。 現 在,こ れ ら ク ラ ミジ ア 呼 吸 器 感 染 症 の 治療 を評価VOL.42 NO .12 Rikitamycinの 抗Chlamydia活 性 1345 す る う え で,我 々 は マ ウ ス を 用 い たC. psittaci感 染
モ デ ル を 作 成 し,各 種 薬 剤 の 同 肺 炎 に対 す る治 療 効 果 を報 告 して きた5)。new quinolone剤 の薬 効 評 価 で は sparfloxacin, tosufloxacinそ し てOPC-17116は MINOに は 若 干 治 療 効 果 は 劣 る がofloxacinよ り は 良 好 な 効 果 が 確 認 され た 。 今 回 我 々 はマ ク ロ ラ イ ド剤 に つ い て も 同 様 に 検 討 を 行 い,roxythromycin, clarithromycinはMINOと 同 等 の 効 果 が あ る こ と を 認 め た。 一 方,16員 環 マ ク ロ ラ イ ドで あ るRKMは, MIC値 は 良 好 な 結 果 で あ る に もか か わ ら ず,マ ウ ス 感 染 治 療 実 験 で は そ の 治 療 効 果 はEMよ り若 干 劣 る 結 果 を示 した 。 マ ウ ス に お い て はRKMは 投 与 直 後 よ り速 や か に 代 謝 さ れ,抗 菌 活 性 を 有 す るRKMは 速 や か に 消 失 し,LMA7やLMV等 の 抗 菌 活 性 の 低 い 代 謝 物 の み 血 漿 中 に 存 在 す る こ と が 今 回 の 検 討 で 明 ら か とな っ た 。 こ の 現 象 は酒 井6),鈴 木7)ら の ラ ッ ト を用 い た動 物 実 験 に お い て,投 与 直 後 よ り血 漿 中RKM濃 度 の 減 少 が 認 め られ た成 績 と同 様 で あ る 。 こ れ ら の事 実 よ りRKMを げ っ 歯 類 に 投 与 し た 場 合,血 中 エ ス テ ラ ー ゼ に よ る分 解 を受 け治 療 効 果 が 減 ず る こ と とな る と 考 え られ た 。 一 方,ヒ トに お け る検 討 で は げ っ歯 類 と 異 な り,RKMは 比 較 的 長 時 間 血 漿 中 に 存 在 す る こ と が 認 め ら れ て お り8),臨 床 に お け る 治 療 効 果 もChla-mydia感 染 症 に 限 ら ず 優 れ た 成 績 が 報 告 さ れ て い る9,10)。 病 原 微 生 物 の 治 療 効 果 の指 標 と し て種 々 の 動 物 モ デ ル が 用 い られ て い るが,病 原 菌 の感 受 性 が 良 好 で あ る 動 物 や,ま た ヒ トに 近 い 動 物 モ デ ル を作 成 す る こ と は 必 要 条 件 で あ るが,薬 物 の 代 謝 様 式 も ヒ トに近 い 系 を 慎 重 に選 択 す る 必 要 性 が あ る と考 え られ た 。 謝 辞 研 究 の 薬 物 濃 度 測 定 に技 術 協 力 し て い た だ き ま し た,旭 化 成 工 業 株 式 会 社 に 深 謝 い た し ま す 。 文 献 1) 熊 本 悦 明, 松 本 明, 副 島 林 造, ク ラ ミ ジ アMIC 測 定 法 ― 日 本 化 学 療 法 学 会 標 準 法(1991年 改 定 版)―(札 幌)。Chemotherapy 40: 303∼307, 1992 2) 森 下 真 孝, 酒 井 敦 史, 遠 藤 里 子, 鈴 木 忠 清: TMS-19-Qの 体 液 内 濃 度 測 定 法 に 関 す る 研 究(I)。 Chemotherapy 32 (S-6): 70∼79, 1984 3) 岸 本 寿 男: Chlamydia pneumoniae (TWAR株)感
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1993 6) 酒 井 敦 史, 鈴 木 忠 清, 遠 藤 里 子, 渡 辺 真 由 美, 森 下 真 孝: 動 物 に お け るTMS-19-Qの 呼 吸 分 布, 代 謝 お よ び 排 泄 に 関 す る 研 究 。Chemotherapy 32: 93∼ 98,1 984 7) 鈴 木 忠 清, 酒 井 敦 史, 森 下 真 孝: 14C標 識 ロ キ タ マ イ シ ン の 体 内 動 態 に 関 す る 研 究 。I. ラ ッ ト単 回 投 与 時 の 呼 吸, 分 布, 代 謝, 排 泄 。Jap J Antibiot-ics, 40: 499∼518, 1987 8) 森 下 真 孝, 鈴 木 忠 清, 酒 井 敦 史, 遠 藤 里 子, 渡 辺 真 由 美, 永 田 明 徳: 健 常 人 に お け る 吸 収, 代 謝 お よ び 排 泄 に 関 す る 研 究 。Chemotherapy 32: 99∼116, 1984 9) 副 島 林 造, 松 島 敏 春, 二 木 芳 人, 川 根 博 司, 川 西 正 泰, 中 浜 力, 渡 辺 正 俊, 日野 二 郎: TMS-19-Qに 関 す る 研 究 。Chemotherapy 32 (S-6): 322∼328, 1984 10) 小 林 宏 行, 他33施 設: 呼 吸 器 感 染 症 に 対 す るTMS -19-QとMidecamycinと の 二 重 盲 検 比 較 試 験 成 績 。 感 染 症 誌59: 201∼226, 1985
