麻布大学生命・環境科学部 臨床検査技術学科 微生物学研究室

     海水、海泥、カキ及び海産魚類から分離した

1妨吻w1η哲。鋸並びにヒト臨床例由来のπw1η批〃3の疫学的検討

  麻布大学生命・環境科学部 臨床検査技術学科 微生物学研究室

大 仲  賢 二

Epidemiolog±cal study of Vibrio vu2nificus from sea waterr sea mud, oystersr marine       human clinical specimens

 isolated fish, and

Kenji Oonaka

Laboratory of Microbiology, Department of Medical Technology,          School of Life and Environmental Sc±ence,

      Azabu University

       目         次

要  旨 英文要旨

1，Isolation of碗加 o v〃1η哲。〃5 f士om commercially available

       and isolates serotyping and antibiotics resistance

    1．Summary

    2． Introduction

    3．Materials and Methods        1．Materials

       2． Isolation and identification

       3．Serotyping

       4．Drug susceptibility tests

    4．Results

       1．Isolation status of Z vμ1η哲。〃5丘om丘esh fish        samples

       2． Status of isolate serotyping

       3．MIC distribution status of various drugs

    5．Discuss量on

    6．Ac㎞owledgments     7．Refbrences

II．恥r OV〃印加〃5感染症に関する基礎的研究：

      自然環境およびヒト臨床由来株の分子疫学的検討     1．要旨

    2．緒言

    3．材料および方法        1．供試菌株

       2．パルスアィールドゲル電気泳動法（PFGE）による1

  ﹂11    1■轟   1    

11▲   1    

1    

1    

1    

1

4．結果

  1．制限酵素卵1および

         No 1による供試菌株のDNA切断状況   2．供試菌株の解析状況

20 20 22

5．考察 ²²

  6．文献

III．佐わ7∫O V〃1η醒6〃5感染症に関する基礎的研究：環境由来株と

    ヒト臨床由来株の血清型別状況および薬剤感受性試験   1．要旨

23 25 25

2．緒言 ²⁵

3．材料および方法 ²⁶

1．供試菌株 ²⁶

2．抗血清の作成方法および血清型別 ²⁶

3．薬剤感受性試験 ²⁶

4．成績 ²⁷

1．各由来別における血清型別状況 ²⁷

2．

3．

4．

分離株の地域別における血清型別 環境由来株とヒト臨床由来株

       における生物型と血清型の関連性 環境由来株におよびヒト臨床由来株

         に対する各種薬剤のMIC分布

28 28

5．考察

28 28

6．文献 ³¹

謝  辞 ³²

     海水、二二、カキ及び海産魚類から分離した

碗塘ov〃1吻？o〃3並びにヒト臨床例由来のπv㍑1〃哲。〃3の疫学的検討

 旧記v〃1η哲。鰐（7．v〃1頑。㍑5）は、海水や汽水を主な生息域とする低濃度好塩性のグラム 陰性桿菌である。本証のヒトへの感染例は、1970年にRolandがヒトの下肢創傷部の皮膚滲

出液から本菌分離について報告したのが最初である（Roland， F． P．：New Engl． J． Med．，

282：1306，1970）。本山は、健康なヒトには感染しないが、肝疾患患者や免疫力の低下したヒ トに感染して重篤な感染症を引き起こすことから、近年注目されている。本菌感染症は、

臨床症状の違いによって、経口感染型、創傷感染型及び胃腸型の3タイプに分類されてい る。とくに経口感染型では、発症すると高い割合で敗血症を起し、重篤化して死亡率も高 い。本菌の疫学的調査に血清学的手法や分子生物学的手法が用いられているが、詳細な報 告はみられない。それ故に、本四の感染源や感染経路については不明な点が多い。また、

薬剤感受性については、臨床治療に用いる各種抗菌剤に対する系統的な検討はされておら ず、その耐性度も明らかにされてないのが実状である。

 そこで著者は、上述のことを加味して本菌の基礎的研究の一環として、自然環境下にお ける本菌の分布状況と汚染菌量の調査を行い、本四が海水、海泥、カキ及び海産魚類の5．4

〜54．8％に分布していることを明らかにした（大仲ら：感染症誌、76、528、2002；Oonakaθ

α1．：Jpn． J． Food Microbiol．，25、89、2008）。

 本研究の概要は次のとおりである。

 最初に、海水、海泥、カキ及び海産魚類から分離した株（環境由来株）とヒト臨床由来

株についてShimadaらの方法（Shimadaθ α∠：Jpn． J． Med． Sci． Biol．、37，241，1984）に準拠し

て血清型別を行い、薬剤感受性を検討した。次に、本菌の感染源や感染経路を明らかにす

る目的で、パルスフィールド・ゲル電気泳動（pulsed一∬eld gel electrophoresis：PFGE）法で解析 を行った。

1．環境由来及びヒト臨床由来のZv〃1η塑。〃5分離株の血清型別と薬剤感受性

 本研究には、環境由来の917株及び病院から分与されたヒト臨床由来の62株の

1一

配v〃1η哲。〃∫、合計979株を用いた。前者の917株は、千葉県、東京都、徳島県の海水、海泥、

カキ（1998年10月〜2000年ll．月に採取、分離した）及び全国9カ所の海産魚類（2003 年5月〜2004年9，月に採取、分離した）、後者のヒト臨床由来株は、全国11カ所及び海外 で分離された株を用いた。Shimadaらの作成したπv〃1η哲。π3の血清型（01〜018：017、

OI8は欠番）を用いて血清型別を行ったところ、587株（60．0％）が13血清型に型別された が、残りの392株（40．0％）については型別不能であった。その型別不能株について、新た に019〜023の5っの血清型を追加作成して血清型別を行ったところ、122株がこれらの 血清型に型別することができた。そして、その結果型別不能株は最終的に270株（27．6％）に 減少した。

 環境由来の917株では655株（71．4％）が18血清型に型別され、それらの中では07が371

株（40．5％）と最も多く、続いて04が58株（6．3％）、022が45株（4．9％）、019が37株（4．0％）で あった。しかし、残り262株（28．6％）は型別不能であった。一方、ヒト臨床由来の62株では54 株（87．1％）が8血清型に型別され、それらの中では04が27株（43．5回目と最も多く、続いて07 が8株（12．9％）、06が7株（11．3％）、01が5株（8．1％）で、残り8株（12．9％）は型別不能であっ

た。この様に、血清型別に関する解析の結果、両方の由来株には共通して07と04が多く 認められることから（46．8％と56．4％）、両血清型と起病性との間には関連性があることが示 唆される。

 次に採取した地域と血清型の異なる環境由来の191株とヒト臨床由来の57株の計248株 について、20薬剤を用いて薬剤感受性試験を行い、各種薬剤に対するMinimum Inhibitory Concentration （MIC），。を検討した。環境由来株のMICg。は、 Meropenem（MEPM）と Cipronoxacin（CPFX）が各0．05μg／mlと最も抗菌力が高く、次にDoxycycline（DOXY）と

Minocycline（MINO）が各0．2ドg／ml、 Tetracycline（TC）が0．39μg／ml、 Chloramphenicol（CP）と Nalidixic acid（NA）が各0．78μg／ml、 Cefbtaxime（CTX）、 Latamoxef（LMOX）及びErythromycin

（EM）が各3．13Fg／m1、 Gentamicin（GM）が6．25μg／ml、 Ampicillin（ABPC）、 Ce飴loridine（CER）、

Ce飴lotin（CET）及びCefbperazone（CPZ）が各12．5μg／ml、 Piperacillin（ABPC）、 Ce㎞etazole

（CMZ）、 LatamoxefてLMOX）及びAmikacin（AMK）が各25F9／ml、 Kanamycin（KM）、が50μ9／ml、

一2一

Lincomycin（LCM）が100＜μg／mlであった。環境由来株では、リンコマイシン系のLCMに対 して耐性株が認められた。一方、ヒト臨床由来株のMIC・・はCPFXが0．05μ9／mlと最も抗菌 力が高く、続いてMINOが0．1μg／ml、 DOXYが0．39μg／ml、 TCとNAが各0．78μg／ml、 EM が3．13μg／ml、GMが12．5μg／ml、CER、 CET、KM及びAMKがいずれも50μg／mlであり、ABPC、

PIPC、 CPZ、 CTX、 CMZ、 LMOX、 MEPM及びLCMのいずれもが100＜μg／mlであった。

ヒト臨床由来株ではβ一ラクタム系やリンコマイシン系に対して耐性株が多く認められた。

 以上の様に、ヒト臨床由来株は環境由来株に比べてβ一ラクタム系やアミノグリコシド系 の薬剤に耐性傾向が高いことが明らかになった。

II．環境由来株及びヒト臨床由来株の分子疫学的検討

 分子疫学的検討は環境由来の355株とヒト臨床由来の65株の計420株について、卵1と No 1を用いた無傷ゲノムDNA切断後のPFGEパターンで行った。その結果、 Nb 1では312 株（74．3％）で、卵1では411株（97．9％）でそれぞれPFGEパターンが得られ、溺1の方がこれ らZv〃1η哲。〃3株の株間識別能において優れていることが明らかになった。また、 DNAの切 断パターンで、N∂ 1では約20〜600 kilo base pair（kbp）の問に15本から22本のバンドが、

溺1では20〜500kbpの間に15本から22本のバンドがそれぞれ確認された。次に、切断 が高い割合で認められた制限酵素卵1で切断された411株（環境由来の349株、ヒト臨床 由来の62株）のPFGE像の類似度が89％以上の場合を同一群としてUnweighted Pair−Group Method with Arit㎞atic mean（UPGMA）法によるクラスター解析を行った。その結果、同一 群に属する環境由来株とヒト臨床由来株は少なく、18組のみが同一群に位置することが明 らかになった。また、一致した18組の中で4組（22．2％）は同一血清型であったが、他の14 組（77．8％）は異なる血清型であった。さらに、πv珈批〃3の採取場所別に解析したとこ ろ、採取場所が同一地点であった18組中10組（55．6％）で同一血清型が認められたが、他の8 組（44．4％）では異なっていた。なお、同一血清型が認められた10組中1組（10．0％）の Zv〃1η哲。〃3は東日本地域の海水と西日本地域のカキからそれぞれ分離されたものであった。

由来別では18組中15組（83．3％）が環境由来株、2組（11．1％）がヒト臨床由来株、1組（5．6％）が 環境由来株とヒト臨床由来株の両方の由来であった。

一3一

 以上の様に、瓦v〃1η扉ω3の血清型別に関する解析で、既知の血清型に新たに筆者が追加 作成した血清型を加えて検討したところ、環境由来株では71．4％が、ヒト臨床由来株では 87．1％がそれぞれ血清型別されることが明らかになった。また、両由来株は共通して07や04 に型別される菌株が多く認められ、両血清型と起病性との間に関連性があることが示唆さ

れた。

 薬剤感受性試験で、ヒト臨床由来株はβ一ラクタム系やアミノグリコシド系の薬剤に対し て耐性傾向にあることが明らかになった。

 分子疫学的検討では、No 1では76．9％、卵1では97．9％の切断率がそれぞれ示され、本 菌のゲノムDNAの切断には溺1が優れていることが明らかになった。さらに、卵1によ ってDNA切断した菌株のPFGEの泳動像をUPGMA法でクラスター解析を行ったころ、

PFGE法が本菌の分子疫学的解析に応用可能であることが示唆された。

一4一

Epidemiological study of Vibrio vulnificus isolated from sea water, sea raud, oysters, marine fish, and human clinical specirnens

  Vibrio vu2nificus (V. vulnificus) is a low‑salt halophile gram‑negative rod mainly inhabiting sea and estuarine water. The first reported case of human infection with this bacterium was described by Roland in 1970, in which the bacterium was isolated from skin exudate from a leg wound (Roland, F. P.: New Engl. J. Med. 282:1306, 1970). This bacterium has recently been attracting attention because it infects liver disease patients and humans with impaired immunity, but not healthy humans, and induces severe infectious disease. The disease is divided into 3 types based on the clinical symptoms: oral, wound, and gastrointestinal infection types. In the oral infection type, sepsis occurs after the onset at a high rate and

aggravates, leading to a high mortality rate. Serological and

molecular‑biological techniques are used for epidemiological surveys of        ' this bacterium, but there has been no detailed report. Accordingly, rnany

points regarding the source and route of infection of thi.s bacterium are unclear.

  We investigated the distribution and contamination level of this

bacterium in natural environments as part of a basic study, and found that the bacteriurn was present in 5.4‑54.8g of sea water, sea mud, oysters, and marine fish (Oonaka et al.: kansenshoshi 76: 528, 2002; Oonaka et al. Jpn. J.

Food Microbiol. 25:89, 2008).

  A summary of this study is as follows:

  Serotypes of strains isolated frorn sea waterr sea mud, oysters, marine fish (environmental isolates), and human clinical isolates were determined by the method reported by Shimada et al. (Shimada et a2.: Jpn. J. Med. Sci.

      ‑5‑

Biol. 37: 241, 1984)r and drug sensitivity was investigated. To identify the source and route of infection, the isolates were analyzed by pulsed‑field gel electrophoresis (PFGE).

I. Drug sensitivity by serotypes of environmental and human clinical isolates of V. vu2nificus

  This study was performed using 917 environmental and 62 human clinical isolates provided by hospitals, with a total of 979 strains of V.

vulnificus. The former 917 strains were isolated from sea water, sea mud, and oysters from Chiba and Tokushima Prefectures and the Tokyo Metropolitan area (sampled and isolated in October 1998‑November 2000) and marine fish from 9 reg±ons nationwide (sampled and isolated in May 2003‑ September 2004). The latter were isolated in 11 regions of Japan and overseas. On serotyping following the V. vu2nificus serotypes established by Shimada et al. (Ol‑O18 excluding missing numbers of O17 and O18), 587 isolates (60.0?) were typed into 13 serotypes, but the remaining 392 isolates (40.0g) could not be typed. When 5 new serotypes (O19‑023) were added to typing of the non‑typed isolates, the 5 serotypes were identified in 122 isolates,       ' reducing the number of non‑serotype identitiable isolates to 270 (27.6g).

  0f the 917 environmental isolates, 655 (71.4g) were typed into 18 serotypes, and 371 were typed 07 (40.5g), the most common, followed by 58 isolates typed 04 (6.3g), 45 typed 022 (4.9?), and 37 typed O19 (4.0?). The remaining 262 isolates (28.6?) could be not be typed. Of the 62 human clinical isolates, 54 (87.lg) were typed into 8 serotypes: 27 were typed 04

(43.5g), the most common, followed by 8 isolates typed 07 (12.9g), 7 typed 06 (11.3g), and 5 typed Ol (8.lg), and the remaining 8 isolates (12.9g) could not be typed. The frequent identification of 07 and 04 was common to the environmental and clinical isolates (46.8 and 56.4g, respectively), suggesting the presence of an association between the two serotypes and

      ‑6‑

pathogemcity.

  Drug sensitivity tests involving 20 drugs were perforrned in 191 environmental strains isolated from various regions and typed serotypes, and 57 human clinical isolates, with a total of 248 strains, and the minimum inhibitory concentrations (MIC)go of the drugs were determined. For the

environmental isolates, the MICgo of meropenem (MEPM) and

ciprofloxacin(CPFX) was O.05 mg/ml, respectively, showing the most potent antibacterial activity, foUowed by O.2 mg/ml for doxycycline (DOXY) and minocycline (MINO), O.39 mg/ml for tetracycline (TC), O.78 mg/ml for

chlorarnphenicol (CP) and nalidixic acid(NA), 3.13 mg/m for

cefotaxime(CTX), latamoxef (LMOX), and erythromycin(EM), 6.25 mg/ml for gentamicin (GM), 12.5 mg/ml for ampicillin (ABPC), cefaloridine (CER), cefalotin (CET), and cefoperazone (CPZ), 25 mg/ml for piperacUlin (PIPC), cefmetazole (CMZ), latamoxef (LMOX), and amikacin (AMK), 50 mg/ml for knamycin (KM), and 100< mg/ml for lincomycin (LCM). LCM resistance was noted in the environmental isolates. For the hurnan clinical isolates, the MICgo of CPFX was O.05 ptg/ml, showing the most potent antibacterial activity,

followed by O.1 ptg/ml for MINO, O.39 pg/ml for DOXY, O.78 ptg/ml for TC and NA, 3.13 pg/rn1 for EM, 12.5 pg/ml for GM, 50 pg/ml for CER, CET, KM, and AMK, and 100< ptg/ml for ABPC, PIPC, CPZ, CTX, CMZ, LMOX, DufEPM, and LCM. Many hurnan clinical isolates were resistant to B‑lactams and lincomycin antibiotics.

  The above findings clarified that the human clin±cal isolates tended to be resistant to fi‑lactams and aminoglycosides, compared to the environmental isolates.

II. Molecular‑epidemiology of environmental and human clinical isolates

  Molecular‑epidemiological analysis was performed using 355

environmental and 65 human clinical isolates, with a total of 420 isolates.

The PFGE pattern after the cleavage of intact genomic DNA with Sfi I and Not

       ‑7‑

I was invest±gated. PFGE patterns of digests with Not I and Sfi I were acquired in 312 (74.3g) and 411 (97.9%) isolates, respectively, showing that sfi I has a more discriminating power among the V. vulnificus strains.

Regarding the DNA cleavage pattern, Alot I produced 15‑20 bands of about 20‑600 kilobase pairs (kbp), and Sfi I produced 15‑22 bands of 20‑500 500 kbp. After treatment with Sfi I, wh±ch cleaved the isolates at a h±gh rate, cluster analysis of 411 isolates (349 environmental and 62 human clinical isolates) was performed using the unweighted pair‑group method with arithrnetic rnean (UPGMA>, regarding isolates with an 89g or higher

sirnilarity in the PFGE profile as belonging to one group. Only a small number of environmental and human clinical isolates belonged to the same clusters:

only 18 pairs belonged to the same groups. Furthermore, only 4 of the 18 pairs (22.2%) were serotyped the same, but the serotype was different in the

other 14 pairs (77.8g). When analysis was performed by V.

vulnificus‑sampling sites, the serotype was identical in 10 of the 18 pairs (55.6g) sampled at the same sites, but different in the other 8 pairs (44.4g). In one of the 10 pairs with identical serotypes (10.0g), one was isolated from sea water of the East Japan area and the other from oysters in the West Japan area. By the origin of isolates, 15 (83.3g) of the 18 pairs were environmental isolates, 2 (11.1?) were human clinical isolates, and one (5.6?) was a pair of environmental and human clinical isolates.

  When the new serotypes were added to the analysis by serotypes, the serotype was determined in 71.4 and 87.12 of the environmental and human clinical isolates, respectiveLy. In addition, many isolates were typed 07 and 04 ±n both the environmental and human clin±cal isolates, suggesting the presence of an association between the 2 serotypes and pathogenicity.

  The drug sensitivity tests clarified that the human clinical isolates

       ‑8‑

tended to be resistant to B‑lactams and aminoglycosides.

  on molecular‑epidemiological analysis, the ATot I and Sfi I cleavage rates were 76.9 and 97.9g, respectively, showing that Sfi I is superior regarding the genomic DNA cleavage of this bacterium. In addition, cluster analysis of the PFGE patterns of Sfi I‑cleaved strains by the UPGMA method suggested that the PFGE rnethod is applicable for molecular‑epidemiological analysis of this bacterium.

,

‑9‑

謝  辞

 本研究を行うにあたり、ご懇篤なご指導、ご高配を賜りました麻布大学大 学院環境保健学研究科 福山正文教授に深甚なる謝意を表します。また、ご 懇切なご高閲を賜りました同研究科 松田基夫教授ならびに同研究科 山本 静雄教授に深謝いたします。さらに、ご懇切なご教示を賜りました獣医学研 究科 原元宣教授および環境保健学研究科 古畑勝則准教授に深謝いたしま

す。

一32一