大腸癌における

(1)

大腸癌における desmoplastic reaction の多様性が持つ臨床的・分子生物学的意義に関する研究

阿

あ

尾

お

理

ただ

一

かず

（外科系プライマリー・ケアー学専攻）

防衛医科大学校

令和２年度

(2)

第１章緒言１頁

第２章肝転移巣におけるDRの臨床病理学的意義３頁

第１節背景と目的３頁

第２節対象と方法４頁

第３節結果６頁

第４節考察７頁

第５節小括９頁

第３章リンパ節転移巣におけるDRの臨床病理学的意義１０頁

第１節背景と目的１０頁

第２節対象と方法１１頁

第３節結果１２頁

第４節考察１３頁

第５節小括１５頁

第４章 DRの形態学的多様性が癌悪性度に関与する分子生物学的機序の解明

１６頁

第１節背景と目的１６頁

(3)

第２節対象と方法１７頁

第３節結果２５頁

第４節考察２９頁

第５節小括３３頁

第５章全体の考察３４頁

第６章結論３６頁

謝辞３７頁

略語一覧３９頁

引用文献４１頁

図表５０頁

(4)

- 1 -

第1章緒言

癌組織は癌細胞と癌間質から構成される。大腸癌では、簇出をはじめとする腫瘍先進部の癌細胞の脱分化所見が腫瘍の生物学的悪性度をよく反映することが知られている¹⁾。一方、近年では癌細胞の周囲を取り巻く癌間質が腫瘍の浸潤・転移に影響を及ぼしているとして注目を集めている^{2, 3)}。癌間質には骨髄由来の免疫細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、間質細胞間に介在する細胞外基

質（ECM, Extracellular matrix）などが活性化した状態で存在し、特異的な微小

環境を形成し線維化を生じさせる^{2, 3)}。癌細胞が浸潤する際に線維芽細胞をはじめとする間質細胞が増生し、膠原線維が領域性をもって蓄積する状態を線維性癌間質反応（DR, desmoplastic reaction）と称する⁴⁾。このDRの評価に関して、これまで本邦における大腸癌取扱い規約では、線維成分の多寡を基準に髄様型、中間型、硬性型の3つに分類する方法がとられてきた⁵⁾。しかしながら、大腸癌は、そのほとんどが中間型に分類されるため、この分類の臨床的価値は乏しい。一方、Uenoらは、DRを腫瘍の発育先進部に特異的に出現する myxoidな間質およびkeloid-like collagenを基準としてimmature、intermediate、

matureの3群に分ける「DR分類」を考案し、ステージII、III大腸癌における

DR分類別の5年無再発生存率（RFS, relapse-free survival）はimmature群で49- 51%、intermediate群で72-78%、mature群で85-87%と、予後予測因子として有用であることを報告している^{6, 7)}（図1）。この分類は個々の大腸癌のDRを量ではなく質を基準に評価する方法であり、主組織型、深達度、腫瘍最大径、脈管侵襲といった従来の臨床病理学的因子を凌ぐ独立した予後予測因子である可能性が示されている⁷⁾。DR分類はHematoxylin-eosin (HE) 染色標本で診断可能であり、診断の簡便性に優れるため、実臨床における新たな治療指標になることが期待される。

(5)

- 2 -

DRは大腸癌の原発巣のみに認められる所見ではなく、大腸癌の転移好発部位である肝臓やリンパ節等の転移巣においても認められる。しかしながら、転移巣におけるDRと原発巣のDRとの関連性や、その臨床的意義については明らかではない。さらに、DRの多様性の基となる分子生物学的背景は明確ではなく、さらに癌の悪性度とどのような機序を介して関連しているかも明らかではない。

DRの形成には、ECMの産生と分解が強く関与しており、癌関連線維芽細胞

（CAFs, cancer-associated fibroblasts）がその中心的な役割を担っている^{2, 3)}。 ECMの分解には、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP, matrix

metalloproteinase）遺伝子ファミリー分子が主役を演じており、またMMP遺伝

子ファミリーの兄弟遺伝子ファミリーに属するA disintegrin and

metalloproteinase (ADAM) 分子もECMおよび生理活性物質の代謝に重要な役割を果たしている^8-10)。しかし、これまでにDRの形態的変化とADAM分子との関連については検討されていない。

そこで本研究では、原発巣－転移巣間のDRの類似性、転移巣DRの予後予測指標としての意義を明らかにし、さらにDRの形態学的多様性が癌悪性度に関与する分子生物学的機序の解明を目的とした。

(6)

- 3 -

第2章肝転移巣におけるDRの臨床病理学的意義

第1節背景と目的

大腸癌肝転移（CRLM, colorectal liver metastases）患者に対して最も効果が高い治療法は肝切除である。しかし、CRLM患者の肝切除後の5年全生存率

（OS, overall survival）は22〜40％であり、10年OSは20〜26％である¹¹⁾。肝切除を施行した患者のうち50〜70％に再発を認め、30％以上の患者が1年以内に再発する¹²⁾。そのため、CRLM患者の肝切除後の再発リスクを正確に予測することは肝切除後のサーベイランスや補助療法の検討において非常に重要であり、本邦では、予後因子として肝転移個数、最大腫瘍径、原発巣のリンパ節転移の程度、肝外転移の有無といった病巣の解剖学的広がりを示す量的なパラメーターが用いられてきた¹³⁾。一方で、これまでに肝転移巣の増殖形態¹⁴⁾や線維性被膜形成の有無¹⁵⁾、肝転移巣内に取り込まれた正常肝細胞集塊の程度¹⁶⁾といった肝転移巣の組織学的所見に着目した質的なパラメーターの報告も散見されるが、未だ臨床応用には至っていない。

これまで肝切除後の治療成績の向上のために術後化学療法の実施が検討されてきた。現在まで2つのランダム化比較試験（FFCD09002試験，Hasegawaらの試験）による有効性に関する報告があり^{17, 18)}、いずれも、OSでは手術単独と比べて有意差を認めないものの、RFSに関しては化学療法群が有意に良好であった。これらの結果を受け、大腸癌治療ガイドラインでは肝転移治癒切除後の術後補助化学療法を行うことが弱く推奨されている¹⁹⁾。しかし、術後補助化学療法は、手術単独治療に比較してより毒性の高い治療であるため、有効な対象群に絞って行うことが望まれるが、治療効果の予測法は確立されていない。

これまでに多施設症例の検討において、肝転移を有する大腸癌で原発巣の

(7)

- 4 -

DR分類が予後予測因子として有用との報告があり、CRLM患者の肝切除後の 5年無病生存期間はimmature群で8%、intermediate群で25%、mature群で35%

と報告されている²⁰⁾。

肝転巣においてもDRが認められるが、肝転移巣におけるDR（DR^liver）の臨床病理学的意義は明らかでない。そこで本検討では、DR^liverが予後不良なサブグループを抽出する上で有用かどうかを明らかにし、肝転移を有する大腸癌の再発リスク評価の一つになり得るかどうか検討することを目的とした。

第2節対象と方法 1) 症例

1997年から2014年までの間、防衛医科大学校病院で大腸癌の肝転移に対して肝切除を施行した大腸癌患者204例（同時性101例、異時性103例）を対象とした。肝切除時にR0手術を施行し得た症例は193例であった。なお、204症例のうち44例は、原発巣の手術を他院で行っているなどの理由で原発巣の病理学的評価を行えなかった。

2) 方法

DR^liverの評価のために用いた病理標本は、実臨床における病理診断のために

作製された既存のHE染色標本を使用した。肝転移巣の全切片を観察し、

DR^liverを既報の原発巣におけるDR分類の評価法に従い²¹⁾、immature、

intermediate、mature の3群に分類した。すなわち、均一な両染性あるいは好塩

基性の細胞外基質が増量したmyxoidな間質が対物40倍視野全体を占めるもの

をimmature、基準を満たすmyxoidな間質が存在しない場合には、好酸性のヒ

アリン化した幅の広い断片状の膠原線維（keloid-like collagen）が存在するもの

(8)

- 5 -

をintermediate、存在しないものをmatureと判定した（図2）。多発肝転移を認める場合、全ての転移巣のDRをそれぞれ判定し、最も成熟度の低いDRを当

該症例のDR^liverとした。その他の臨床病理学的因子に関しては診療録、病理報

告書等を参照した。なお、DR^liverの評価は、予後転帰を含むすべての臨床病理学的情報を盲検化した状態で申請者（阿尾）が施行した。評価の再現性を検証するため、無作為に抽出した50症例の肝転移巣の病理組織標本を申請者以外の評価者（梶原講師）が独立して評価を行い、その評価者間の判定の一致度を κ係数により評価した。原発巣のDR（DR^primary）についても既報の方法に従って²¹⁾、原発巣の全切片を観察し、immature、intermediate、mature の3群に分類した。

3) 統計学的手法

DR^liverとその他の臨床病理学的因子との関連は、カイ二乗検定を用いて検討

し、母集団の数が少なく期待値が5未満となる場合にはFisherの直接確率検定を用いて検討した。DR^liverとDR^primaryとの関係強度はスピアマン順位相関係数を用いて検討した。スピアマン係数の解釈は、0＝|ｒ|：相関なし、0＜|ｒ|≦ 0.2：ほとんど相関なし、0.2＜|ｒ|≦0.4：低い相関あり、0.4＜|ｒ|≦0.7：相関あり、0.7＜|ｒ|≦1.0：高い相関あり、|ｒ|＝1.0：完全な相関とした²²⁾。κ係数に基づく一致率の解釈は、< 0.0：一致度不良（poor）、0.01-0.20：わずかな一致

（slight）、0.21-0.40：一応の一致（fair）、0.41-0.60：中等度の一致

（moderate）、0.61-0.80：実質的な一致（substantial）、0.81 <：ほぼ完全な一致

（almost perfect）とした²³⁾。生存率について、OSでは全死亡を、肝切除時に R0手術を施行し得た症例におけるRFSでは再発および全死亡をイベントとし

てKaplan-Maier法で算出し、ログランク検定を用いて比較検討した。単変量解

(9)

- 6 -

析にて有意な相関を示した因子に関して、Cox's proportional hazard modelによる多変量解析を行った。P値 < 0.05を有意とし、各統計計算はJMP^® pro14.0

（SAS Institute, Cary, NC, USA）を用いて行った。

第3節結果

1）DR^liverの評価の内訳および評価者間の一致率

対象症例におけるDR^liverの分類の内訳は、immatureが91例（44.6％）、 intermediateが101例（49.5％）、matureが12例（5.9％）であった。判定の一致度についてκ値を検討したところ、DR^liverの評価に関するκ値は0.61であり、

実質的な一致（substantial）と評価された。

2）DR^liverとDR^primaryとの関係強度、その他の臨床病理学的因子との関連

全症例におけるDR^liverとDR^primaryの一致率は51.9%（同時性肝転移：62.5%, 異時性肝転移：38.4%）であった（図3A）。

DR^liverがmatureである症例においてDR^primaryもmatureだった症例は27％と

低率であったが、DR^liverがintermediateおよびimmatureでは半数以上の症例で

DR^primaryと同一の判定であった（図3B）。DR^liverとDR^primaryとの関係強度につい

てスピアマン係数を検討したところ、スピアマン係数は0.3で低い相関を認

め、DR^liverはDR^primaryの特徴を保持していた（P < 0.0001）。

また、同時性肝転移の症例で、肝切除前に化学療法が実施されていない45 例において同様にDR^liverとDR^primaryの一致率を検討したところ、64.4%であった（スピアマン係数＝0.40［P = 0.0069］）（図3A）。

DR^liverと関連を認めた臨床病理学的因子は、DR^primary（P = 0.0001）以外は、

肝切除前CEA値（P = 0.032）のみであった（表1）

(10)

- 7 -

3）DR^liver分類別の予後

対象症例全体の5年OSは51.1％、5年RFSは26.2％であった。DR^liver分類別のOSおよびRFSに関する生存曲線を図4に示す。5年OSは、immature群で35.0%、mature/intermediate群で64.8%であり、immature群で有意に予後不良であった（P = 0.0012）。同様に5年RFSは、immature群で16.7%、

mature/intermediate群で33.8%とimmature群で有意に予後不良であった（P = 0.0021）（図4）。

4）肝切除後のOSおよびRFSに関するリスク因子

DR^liverを含む臨床病理学的因子別のOS、RFSを表2に示す。OSに関して、

単変量解析では、肝転移個数（P = 0.0019）、DR^liver（P = 0.0054）、肝外転移有無（P = 0.0018）がOSと有意な関連を示した。上記3因子に関してCox's proportional hazard modelによる多変量解析を実施したところ、肝転移個数5個以上（P = 0.0054）、DR^liver immature（P = 0.0072）、肝外転移あり（P = 0.0035）の3因子がいずれも独立したリスク因子として選択された。一方、RFSに関して、単変量解析では、原発巣の深達度（P = 0.013）、リンパ節転移分類（P = 0.026）、同時性/異時性（P = 0.0006）、DR^liver（P = 0.0069）が有意な関連を示し、上記4因子に関して多変量解析を実施したところ、原発巣の深達度T3以深（P = 0.013）、DR^liver immature（P = 0.021) の2因子が独立したリスク因子として選択された（表2）。

第4節考察

肝転移を有する大腸癌症例においてDR^liverの評価による予後の層別化が可能

(11)

- 8 -

であった。DR^liverがimmatureの症例の予後は5年OSが35.0%、5年RFSが

16.7%と極めて不良であった。

近年、癌細胞のみならず癌細胞の周囲を取り巻く癌間質も腫瘍の浸潤・転移に影響を及ぼしているとして注目されている^{2, 3)}。DR分類は癌間質の形態学的な分類方法であり、keloid-like collagenとmyxoidな間質を基準に3つの群にDR を分類するものである。keloid-like collagenは、癌の増殖と治療抵抗性を促進するI型コラーゲンの過剰析出が特徴であり²⁴⁾、形態的にはケロイドに観察される線維に類似する²⁵⁾。myxoidな間質を有する腫瘍の特徴として、血管新生が乏しく、ミスマッチ修復遺伝子欠失の頻度が少ないといった特徴があり、また fibronectinやtenascin-CなどのECMの過剰新生、CAFsの高密度な分布、免疫細胞浸潤の減少を認めることから^{21, 25-27)}、myxoidな間質は腫瘍が自らの発育進展に最も有利なECMの再構築に成功した形態と捉えることができる。

Dudaらは、転移の過程で、癌細胞のみならずCAFsを含む間質成分も一緒に転移することを報告している²⁸⁾。本研究では、原発巣および肝転移巣それぞれのDRを評価し、DR^liverとDR^primaryとの間に有意な関連があることが明らかとなった。これはDudaらの理論と矛盾のない結果である。しかし、DR^liverと

DR^primaryが一致しない症例も少なからず認められる。高橋らは、原発巣の主組

織型と転移リンパ節の主組織型との一致度を評価したところ、46.2%の症例で組織型が一致するものの半数以上の症例で不一致であることを報告している

29)。今回、DR^liverとDR^primaryの一致率は51.9%であったが、DRが完全に一致し

ない理由として、多くの症例で肝切除術の前に原発巣切除が先行して行われ、

その後一定期間を経て肝切除が行われていることが要因の一つとして考えられる。日常診療では、原発巣切除から肝切除術までの間に腫瘍縮小効果を狙って化学療法が行われるケースが多く、化学療法が癌細胞の組織型および癌間質の

(12)

- 9 -

双方の形態に変化を及ぼす可能性が考えられる。肝切除前に化学療法が行われていない症例群ではDR^liverとDR^primaryの一致率が64.4%と比較的高い結果となった。しかしながら、この症例群においても不一致の症例が35.6%に認められた。keloid-like collagenやmyxoidな間質は、CAFsを含むcell clusterと転移臓器との間に相互作用が生じた結果、生成される構造物と考えられるが、その生成までに一定時間を要する。すなわち、遠隔臓器での生着後の経過時間が原発巣と遠隔臓器におけるDRの一致度に影響を及ぼしている可能性が考えられた。

本研究の限界として、単施設による検討のためサンプル数が少ないことが挙げられる。また後向き研究のため、肝切除前および肝切除後の治療にばらつきが存在し、化学療法による結果への修飾が排除されていない。今回の症例群では他施設で原発巣切除を行っている症例も多く含まれ、予後予測における

DR^liverとDR^primaryの有用性に関する比較は行えていない。また、本結果からは

肝切除後のDR^liverの判定に応じた術後補助化学療法の選択が予後に上乗せ効果を有するかどうかは不明であり、DR^liverの臨床応用については、大多数の症例を含む前向きの臨床試験により検証を行う必要があると考えられた。

第5節小括

DR^liverによりCRLM患者の肝切除後の予後の層別化が可能であった。今後、

肝転移切除後の治療選択基準として利用できる可能性が示唆された。

(13)

- 10 -

第3章リンパ節転移巣におけるDRの臨床病理学的意義

2000年から2004年における大腸癌研究会の全国大腸癌登録によると、登録された初発大腸癌25,617例のうち42.9%にリンパ節転移が認められている。その他の初発時転移臓器・部位の頻度は、肝（10.9%）、腹膜（4.5%）、肺

（2.4%）であり、リンパ節は大腸癌転移の最好発部位である¹⁹⁾。大腸癌取扱い規約（第8版）では、遠隔転移が存在せず、リンパ節転移が陽性の症例はステージIIIに該当し、病理学的に確認したリンパ節転移個数が3個以下（pN1）の症例をステージIIIa、転移個数が4個以上（pN2）およびリンパ節転移個数に関わらず主リンパ節または側方リンパ節に転移のある症例（pN3）をステージ IIIbに分類している³⁰⁾。ステージIII症例全体の5年OSは、結腸癌72％，直腸癌63％であり、大腸癌研究会の2007年の全国大腸癌登録によるとステージIII 症例の治癒切除後の再発率は31.8%で、5年OSはステージIIIaで77.7%、ステージIIIbで60.0%であった^{30, 31)}。ステージIII症例は、これまで一律に術後補助化学療法を実施すべきと考えられてきた集団であるが、この集団においても予後の層別化が可能であれば、リスクに応じた術後補助療法の選択が可能と考えられる。

本章第1節の肝転移と同様に、大腸癌では原発巣のみならずリンパ節転移巣においてもDRが認められるが、リンパ節転移巣におけるDR（DR^LN）の臨床病理学的意義は明らかではない。そこで本検討では、DR^LNがステージIII症例における予後不良な集団を抽出する上で有用かどうかを明らかにし、術後補助療法等の治療の選択指標になり得るかどうか検討することを目的とした。

(14)

- 11 -

第2節対象と方法

1）症例

2005年から2012年の間、防衛医科大学校病院で根治切除術を施行された深達度T3以深のステージIII大腸癌症例363例（ステージIIIa：234例・ステージIIIb：129例）を対象とした。

2）方法

通常診療における病理診断用に作製されたHE染色標本を使用して検討を行った。すべての転移リンパ節を観察し、DR^LNを本章第1節の検討と同様に既報の方法に従い²¹⁾、myxoid間質とkeloid-like collagenの有無を基準に

immature、intermediate、matureの3群に分類した（図5）。複数の転移リンパ節が存在する症例では、すべての転移リンパ節についてそれぞれDRを評価し、

最も成熟度の低いDRを当該症例のDR^LNとした。その他の臨床病理学的因子に関しては診療録、病理報告書等を参照した。なお、DR^LNの評価は、予後転帰を含むすべての臨床病理学的情報を盲検化した状態で申請者（阿尾）が施行した。評価の再現性を検証するため、無作為に抽出した50症例のリンパ節転移巣の病理標本を申請者以外の評価者（梶原講師）が独立して評価を行い、その評価者間の判定の一致度をκ係数により評価した。DR^primaryについても既報の方法に従い²¹⁾、原発巣の全切片を観察しimmature、intermediate、matureの3 群に分類した。なお、リンパ節領域に存在する脈管侵襲や神経侵襲が主たる病巣でない非連続性癌進展病巣（ND, tumor nodule）についてはリンパ節転移巣に含めて評価した。

3）統計学的手法

(15)

- 12 -

DR^LNとその他の臨床病理学的因子との関連は、カイ二乗検定を用いて検討し、母集団の数が少なく期待値が5未満となる場合にはFisherの直接確率検定を用いて検討した。DR^LNとDR^primaryとの関係強度はスピアマン順位相関係数を用いて検討した。スピアマン係数とκ係数に基づく一致率の解釈は前節と同様に行った。生存率は、OSでは全死亡を、RFSでは再発および全死亡をイベン

トとしてKaplan-Maier法で算出し、ログランク検定を用いて比較検討した。単

変量解析にて有意な相関を示した因子に関して、Cox's proportional hazard model による多変量解析を行った。P値 < 0.05を有意とし、各統計計算はJMP^® pro14.0（SAS Institute, Cary, NC, USA）を用いて行った。

第3節結果

1）DR^LNの評価の内訳および評価者間の一致率

対象症例におけるDR^LNの分類の内訳は、immatureが148例（40.8％）、 intermediateが106例（29.2％）、matureが109例（30.0％）であった。判定の再現性についてκ値を検討したところ、DR^LNの評価に関するκ値は0.83であり、ほぼ完全な一致（almost perfect）と評価された。

2）DR^LNとDR^primaryとの関係強度、その他の臨床病理学的因子との関連

全症例におけるDR^LNとDR^primaryとの一致率は59.2%であった（図6A）。 DR^LNはいずれの群においてもDR^primaryと6割前後の症例で一致していた（図

6B）。DR^LNとDR^primaryとの関係強度についてスピアマン係数を検討したとこ

ろ、スピアマン係数は0.43と相関を認めた（P < 0.0001）。DR^LNと有意な関連を認めた臨床病理学的因子は、年齢（P = 0.014）、リンパ節転移分類（P <

0.0001）、リンパ管侵襲（P = 0.039）、静脈侵襲（P = 0.014）、簇出（P =

(16)

- 13 -

0.0020）、ND（P < 0.0001）、転移リンパ節長径（P = 0.021）、転移リンパ節短径

（P = 0.0070）であった（表3）。

3）DR^LN分類別の予後

対象症例全体の5年OSは78.9％、5年RFSは60.7％であった。DR^LN分類別のOSおよびRFSに関する生存曲線を図6に示す。5年OSは、immature群で 76.1%、mature/intermediate群で80.9%であり、両群間に有意差を認めなかった

（P = 0.60）。一方で、5年RFSは、immature群で51.9%、mature/intermediate群で66.8%でありimmature群で有意に予後不良であった（P = 0.0066）（図7）。

4）手術後のRFSに関するリスク因子

DR^LNを含む臨床病理学的因子別のRFSを表4に示す。RFSに関して、単変量解析では、腫瘍占居部位（P = 0.023）、原発巣の深達度（P = 0.037）、リンパ節転移分類（P < 0.0001）、静脈侵襲（P = 0.013）、簇出（P = 0.0083）、DR^primary

（P < 0.0001）、DR^LN（P = 0.020）が有意な相関を示し、上記7因子に関して多変量解析を実施したところ、N2/N3（P = 0.0002）、静脈侵襲あり（P = 0.022）、

DR^primary immature（P = 0.0001）の3因子が独立したリスク因子として選択され

たが、DR^LNは独立したリスク因子としては選択されなかった（表4）。

第4節考察

ステージIII大腸癌症例においてDR^LNによりRFSに関する予後の層別化が可能であったが、DR^LNは独立した予後因子ではなかった。

これまでに予後と関連があるリンパ節の組織学的所見として、転移陰性リンパ節における傍皮質過形成やリンパ濾胞の増生³²⁾、リンパ洞へのマクロファー

(17)

- 14 -

ジの集積³³⁾等が報告されてきた。しかし、リンパ節の線維化に着目したパラメーターの報告はない。

癌の転移は、癌細胞の原発巣での増殖、原発巣からの癌細胞の離脱と脈管

（血管やリンパ管）への浸潤、脈管内での移動、転移臓器の血管内皮への接着、転移臓器への浸潤、転移臓器内での増殖などの過程から構成されており、

すべての過程が連続的に起こった結果生じる^{34, 35)} 。また近年、癌細胞は単一の細胞としてだけでなく、CAFsを纏いながらクラスターとなって移動することが報告されている^35-40) 。今回の検討において、DR^primaryとDR^LNとの関係強度は、スピアマン係数0.43と有意な関連を認め、DR^LNはDR^primaryと類似しており、上記のクラスター理論と矛盾のない結果と考えられた。

これまでに、原発巣と転移巣との間でhuman epidermal growth factor receptor 2 (HER2) 遺伝子や血管内皮増殖因子 (VEGF, Vascular Endothelial Growth Factor）の発現に関連があるとの報告や⁴¹⁾、局所免疫を示す浸潤リンパ球数の度合いに関連があるとの報告がある⁴²⁾。今回の検討にて、DRに関しても原発巣とリンパ節転移巣との間で形態的に有意な関連が認められた。近年、癌微小環境が癌化のみならず癌悪性化や治療抵抗性に寄与することが明らかになり^{3, 35, 43)}、癌細胞内の異常に加えて、微小環境の異常をどのように評価し、癌診断・治療に役立てるかが重要な課題となってきている。本検討の結果からDR^primaryの評価が転移巣の治療を行う上で有用な surrogate markerとなる可能性が示唆された。

リンパ節転移を有するStage III大腸癌においては、再発抑制および生命予後の改善を目的とした術後補助化学療法が推奨されている¹⁹⁾。術後補助化学療法に用いられるレジメンとしては、tegafur-uracil (UFT) + calcium folinate (LV)、 capecitabine (Cape)、tegafur gimeracil oteracil potassium (S-1)およびFluorouracil (5-

(18)

- 15 -

FU) + levofolinate calcium (l-LV)と、oxaliplatinを併用する FOLFOX、CAPOXが挙げられる。本邦では比較的予後の良好なステージIIIa大腸癌（規約第8版）

では前者の経口薬主体のレジメンが用いられることが多く、ステージIIIb大腸癌には後者のoxaliplatin併用レジメンが用いられることが多い。しかしながら、後者は、より一層の予後改善効果が期待できるものの有害事象も高率であ

り、oxaliplatinによる末梢神経障害が高頻度に出現し、投薬終了後も長期間神

経障害が継続することもしばしば経験される^{44, 45)}。よって、その適応は慎重になされるべきと考えられる。このような観点から、Stage III大腸癌症例における再発リスクの絞り込みは、有害事象のリスク軽減から重要な課題である。本検討ではリンパ節転移個数に加え、DR^primaryを考慮することで、さらなる再発リスクの絞り込みを行える可能性が示唆された。

本研究の限界として、本章第１節と同様に、単施設かつ後方視的研究であり、術後補助化学療法の内容にもばらつきがある。また、DRの所見を基に

oxaliplatin併用の比較的強力なレジメンを選択することで実際に予後の上乗せ

効果が得られるかどうかは定かではないため、DRによる治療選択の妥当性については評価できない。よって、さらに大多数の症例を含む大規模な前向きの臨床試験により検証する必要があると考えられた。

第5節小括

ステージIII大腸癌において、原発巣におけるDRの形態学的特徴はリンパ節転移巣においても再現されることが示された。リンパ節転移巣におけるDR分類により、原発巣のDR分類と同様に予後の層別化が可能であったが、予後分別能は原発巣のDR分類の方が良好であった。

(19)

- 16 -

第4章 DRの形態学的多様性が癌悪性度に関与する分子生物学的機序の解明

近年、癌間質は癌細胞の生存や増殖を育む微小環境として認識され、癌の悪性進展に重要であるとの概念が定着している^46-48)。癌間質の中心的な構成細胞であるCAFsは癌組織内に存在する線維芽細胞として定義され、様々な種類の前駆細胞（線維芽細胞・上皮細胞・血管内皮細胞・血管周皮細胞・星細胞・前脂肪細胞・骨髄由来間葉系幹細胞など）から起源し、腫瘍増殖を促進するサイトカイン、ケモカインを産生・分泌し、癌の進展に関与している^{43, 49-51)}（図 8）。非癌部正常組織の間質と比較し、癌間質ではECMの再編成が積極的に行われ、Ｉ型・Ｖ型コラーゲン、tenascin-C、fibronectinなどのECM分子の産生と沈着が認められる^{52, 53)}。ECMの分解には、MMP遺伝子ファミリー分子が主役を演じており、またMMP遺伝子の兄弟遺伝子にあたるADAM遺伝子ファミリー分子もECMの分解に重要な役割を果たしている^8-10)。ADAM分子はディスインテグリン（ヘビ毒から単離された血小板凝集阻害因子）とメタロプロテアーゼ（Zn²^＋を活性中心に持つプロテアーゼ）ドメインを有する膜貫通型タンパク質からなり、ECM分解の他に、細胞膜上の増殖因子・受容体・接着分子のシェディングやインテグリンなどへの結合により、癌細胞の接着・運動・増殖に関与している⁹⁾（図9）。

我々は、これまでに原発巣の腫瘍先進部および転移巣におけるDRの形態的特徴の差が大腸癌の予後をよく反映することを示してきたが、このような形態的特徴の差が生じる背景として、CAFsを主体としたECM再編成時の分子制御機構の差がDRの形態学的多様性に反映されている可能性が考えられる。

そこで本章では、CAFsから産生されるADAM分子に着目し、DRの形態的

(20)

- 17 -

特徴の背後にある分子生物学的因子の同定を試みた。

第2節対象と方法 1）対象症例

2017年3月から2018年12月の間、防衛医科大学校病院にて原発巣切除を施行したpT3以深の大腸癌症例61例（結腸癌37例・直腸癌24例）を対象とし、細胞培養用および新鮮凍結標本用の検体をそれぞれ採取した。患者背景の詳細を表5に示す。なお、術前加療を施行した症例は本研究から除外した。術前にすべての検体採取候補となる患者に対し、防衛医科大学校倫理委員会から承認を得た文書を使用して同意取得を行った。

2）DR分類

対象の全症例について、通常の病理診断用に作成されたHE標本を用いて、

第2章第１節と同様に、既報の評価法に従い²¹⁾、原発巣のDRを評価した。

3）CAFs培養

摘出直後の大腸癌手術検体から癌部および非癌部の漿膜下層組織をそれぞれ採取し、CAFsおよび非癌部線維芽細胞（NFs, non-cancer-associated ﬁbroblasts）を培養した（図10A）。非癌部漿膜下層組織は切除検体の口側断端から採取した。また、腫瘍のheterogeneityを考慮するため、1症例あたり3個の腫瘍検体を採取した。

約5 mm角の組織切片を癌部漿膜下層および非癌部漿膜下層からそれぞれ採取し、10%ウシ胎児血清（FBS, fetal bovine serum）および抗生剤（100 IU/ml penicillin, 100 μg/mlstreptomycin）を含むDulbecco’s Modified Eagle’s medium

(21)

- 18 -

(DMEM^TM) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 培地上で37℃、5%CO2

の条件下で培養した。3回以上継代し、純度の高いCAFsあるいはNFsを抽出し、それぞれ3-7継代したものを実験に使用した。

4) Total RNAの抽出およびcDNA合成

培養したCAFsまたはNFsにISOGEN^TM (Nippon gene, Tokyo, Japan) を加えてホモジナイズし、製品プロトコルに従ってtotal RNAの抽出を行った。単鎖 cDNAの合成は，抽出したtotal RNAを鋳型としてPrime Script RT-reagent Kit^TM (Takara Bio Inc., Shiga, Japan) を用いて行った。

5）リアルタイム定量的RT-PCR

cDNAを鋳型としてSYBR Premix Ex Taq II^TM（Takara Bio Inc., Shiga, Japan）を用いて各種ADAMのmRNA発現を半定量的に解析した。リアルタイムRT- PCRに用いたプライマー（Perfect Real Time Support System^TM）(Takara Bio Inc.,

Shiga, Japan）と反応条件は下記の通りである。

ADAM9 増幅産物サイズ 87 bp

Forward primer TGTGAGACTAAAGGATACGGAGGAA Reverse primer GACCAGAAGTCCGTCCCTCAA

Forward primer GCCAGTTCTGATGGCAAAGATG Reverse primer AGACCCTGTACTGCCACAAGTTGA

(22)

- 19 -

Forward primer CACATGAGCTGGGCCACAA Reverse primer CCTGCTGCAACTGCTGAACAC

Forward primer CTTGGATCTTGGCAAGTGTAAGGA Reverse primer GCATCGACATAGGGCACACAG

GAPDH 増幅産物サイズ 138 bp

Forward primer GCACCGTCAAGGCTGAGAAC Reverse primer TGGTGAAGACGCCAGTGGA

PCRプロトコル：

（初期変性） 95℃、30秒

（アニーリング・伸長） 95℃、05秒 → 60℃、30秒（40サイクル）

全ての反応は二重反復試験で施行し、平均値をもって結果とした。PCR反応終了後、融解曲線分析にて増幅産物の特異性を確認した。mRNAの相対的発現量の評価は内因性標準遺伝子であるglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

（GAPDH）により発現を補正し、Multiplate RQ^TM(Takara Bio Inc., Shiga, Japan) ソフトウェアを用いて⊿⊿Ct法にて行った。

6）イムノブロット法

培養したCAFsおよびNFsにそれぞれ2×sodium dodecyl sulfate (SDS) -sample

(23)

- 20 -

buffer および還元剤を加え、Bioruptor^® (BM Equipment Co., Ltd., Tokyo, Japan) で超音波処理し、12,000 rpmで10分間遠心した後、100℃で10分間インキュベートした。試料中のタンパク質をSDS- polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (12.5%アクリルアミドゲル) により分離しpolyvinylidene difluoride (PVDF) 膜に転写した。PVDF膜をBlock-Ace^TM (DS Pharma Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan) と2時間室温で撹拌後、抗ADAM9抗体 (5 µg/mL, MAB939; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)、抗ADAM17 抗体 (5 µg/mL, AB19027; Millipore

Corporation, Temecula, CA, USA)、抗proliferating cell nuclear antigen (PCNA) 抗体 (5 µg/mL, PC-10; Boster, Pleasanton, CA, USA) および抗GAPDH抗体（0.2 μ g/ml, ab125247; Abcam, Cambridge, MA, USA）とそれぞれ4℃で一晩インキュベートした。一次抗体と反応後、0.1%のtween^®-20を含むPBS (PBS-T) で10分間、3回洗浄後、horseradish peroxidase (HRP) 抗体 (DAKO, Glostrup, Denmark) と室温で2時間反応させた。免疫反応性のバンドは、ECL試薬 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) と反応させ、LAS4000^TM (GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan) により検出した。タンパク質の発現変化は、Image J

(https://imagej.nih.gov/ij/) を用いて解析した。

7）レーザーマイクロダイセクション（LMD, laser-microdissection）

手術標本の摘出直後に切り出された癌部漿膜下層を含む一割面分の標本および非癌部正常組織をそれぞれTissue-Tek OCT Compound ^TM (Sakura, Tokyo, Japan) を用いて包埋し、液体窒素で急速凍結を施行した後、－80℃下にて保存した。

保存した標本から10μm厚の連続凍結切片を作成し、エタノール加5%酢酸で3 分間固定を行った。RNase free水で洗浄した後、hematoxylinで30秒染色を行い、切片を風乾した。LMD6000^TM（Leica Microsystems, Wetzlar, Germany）を用

(24)

- 21 -

いてDR分類別に腫瘍先進部のDRおよび非癌部正常組織の漿膜下層を選択的に採取した。

8）免疫組織化学染色

腫瘍先進部を含む代表割面のホルマリン固定パラフィン包埋標本から4μm厚の薄切を行った。脱パラフィン後、濃度勾配をつけたエタノールを用いて親水処理を行ったのち、オートクレーブにて121℃、15分間の抗原賦活を施行した。5%過酸化水素水に10分間浸透させ内因性ペルオキシダーゼの阻害を行ったのち、スキムミルクにて非特異的反応を抑制した。

一次抗体反応として100倍希釈したgoat anti-human ADAM9 polyclonal antibody (AF939; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) を用いて4℃で一晩インキュベートした。二次抗体はEnvision^TM + system anti-goat (DAKO Cytomation, Glostrup, Denmark) を使用し室温で2時間反応させたのち、0.1%

diaminobenzidine (DAB) 溶液で10分間の発色を施した後にhematoxylinで2分間の核染色を加えた。

9）オルガノイド培養

摘出直後の手術標本から採取した癌組織を小切片に細分化し、氷冷したPBS で洗浄し夾雑物を取り除いたのち、Liberase^TM TH research grade (Roche Ltd., Basel, Switzerland) 10 µLを含むHanks' Balanced Salt solution (HBSS) (Life

Technologies Corporation, Carlsbad, CA, USA) 1 mL中で37℃ 、2時間撹拌した。

溶液を回収しcell strainer (pluriStrainer^®-Mini) (Funakoshi, Tokyo, Japan)で濾過し

たのち、4℃、300×gで5分間遠心した。沈殿した細胞ペレットをPBSで洗浄

後、Corning^® Matrigel^® Growth Factor Reduced (Corning, NY, USA) で包理し、48

(25)

- 22 -

cell culture plateに30 µL Matrigel/wellずつ分注した。DMEM/F12^TM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 1mL当たり100 IU penicillin-100 μg

streptomycin-250 ng amphotericin B (Fujifilm Wako Pure Chemical, Osaka, Japan),10 mM HEPES^TM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 2 mM GlutaMAX^TM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 1×B27^TM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 10 nM gastrin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), and 1 mM N-acetylcysteine (Fujifilm Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) を混合し基礎培地を作成したのち、ニッチファクターとして50 ng mouse recombinant EGF (Fujifilm Wako Pure Chemical, Osaka, Japan), 100 ng mouse recombinant Noggin (Fujifilm Wako Pure Chemical, Osaka, Japan), 50% Wint-3A conditioned medium (L-WRN) (ATCC, Manassas, VA, USA), 500 nM A83-01 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 10 µM SB202190 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), 10 µM Y27632 (Fujifilm Wako Pure Chemical, Osaka, Japan) を添加した。作成した混合液を300 µL/well ずつ分注しオルガノイドを培養した。

10）CAFsの培養上清を用いた大腸癌株化細胞の細胞増殖アッセイ大腸癌株化細胞HCT-116はAmerican Type Culture Collection（ATCC,

Manassas, VA, USA）から購入し、HT-29はRiken BRC cell bank (Riken, Tsukuba,

Japan) から購入した。CAFsの培養上清と共培養したそれぞれの大腸癌株化細

胞の増殖能を、Bromodeoxyuridine (BrdU)（Roche Molecular Biochemicals, Basel, Switzerland）によるCell Proliferation ELISA法を用いて以下の要領で測定した。

細胞周期の同調ならびに増殖停止を行ったのち、大腸癌株化細胞をCAFsまたはNFsの培養上清と46時間共培養した。BrdU標識溶液（10 mol/L）を培地に添加し、2時間後に除去後、抗BrdU抗体を添加した。BrdUの光学濃度

(26)

- 23 -

（450nm）を、iMark^TM microplate reader (Bio-Rad, Hercules, CA) を使用して測定した。また、細胞増殖に対するADAM9発現抑制の影響を評価するために、

short hairpin RNA (shRNA) によりADAM9のノックダウンを行ったCAFsの培養上清と大腸癌株化細胞を共培養し、上記と同様にBrdUによるCell

Proliferation ELISA法で検討した。

11）shRNAによるADAM9のノックダウン

ADAM9 shRNAとして5種類のlentivirus vectorならびに非標的shRNA vector (mock) をSigma-Aldrichから購入した。予備実験として各lentivirus vector によ

るADAM9の発現抑制効果についてイムノブロット法を用いて検討したとこ

ろ、5種類中2種類のshRNA（sh1およびsh2）に抑制効果を認めたため、その

後の実験に使用した。2種類のshRNAのコード配列は以下の通りであった。

sh1: 5’-CCGGCGAATGGATGATGTCTACAAACTCGAGTTTGTAGACATCATCCA TTCGTTTTTG-3’

sh2: 5’-CCGGGCCAGTATTATGATGCTCAATCTCGAGATTGAGCATCATAATACT GGCTTTTTG-3’

12) Venus融合タンパク質 (ffLuc-cp156) による蛍光標識大腸癌株化細胞の作

成

ADAM9の癌悪性度への影響を調べるために、ルシフェラーゼとVenus融合

タンパク質（ffLuc-cp156）を恒常的に発現する大腸癌株化細胞（HCT-116^ffLuc-

cp156およびHT-29ffLuc-cp156）を以下の要領で作製した。

HCT-116およびHT-29とlentivirus上清（ffLuc-cp156）を48時間共培養して核酸導入を行ったのち継代を繰り返し、ffLuc-cp156陽性細胞（HCT-116ffLuc-cp156

(27)

- 24 -

およびHT-29ffLuc-cp156）を、Cell Sorter SH800S^TM (SONY, Tokyo, Japan）を用いて収集した。得られた細胞株の95％以上が緑色蛍光タンパク質（GFP, green

fluorescent protein）陽性であることを確認し、その後の実験に使用した。

13）マウスを用いた腫瘍異種移植による腫瘍増殖能および転移能の評価

大腸癌株化細胞（HCT-116またはHT-29: それぞれ1×10⁶個）およびDR分類別に採取したCAFs（5×10⁵個）を、BALB/cSlc-nu/nu マウス (male, 5–6週齢) (Japan SLC, Shizuoka, Japan) の背部皮下に注入し、腫瘍の長径と短径を1週間ごとに計測してin vivoにおける腫瘍増殖能を評価した。腫瘍体積は下記計算式を用いて算出した。