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Academic year: 2021

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(1)

A解   剖 B病   理 C寄生虫 DB微生物 (細菌) DI微生物 (免疫) DV微生物 (ウイルス) E家   禽 F公衛生 G繁   殖 HL臨床 (産業動物) HS臨床 (小動物) I生理・化 J薬・毒 K実動医

C.日本獣医寄生虫学会

一般演題:53題(C-1~C-53)

座長

9 月17日(金) 13:00~16:10 第 3 会場

C-1,C-2

佐藤 宏( 山口大学)

C-3~C-5

堀井洋一郎( 宮崎大学)

C-6~C-9

福本真一郎( 酪農学園大学)

C-10~C-13

板垣 匡( 岩手大学)

C-14,C-15

平田 晴之( 酪農学園大学)

C-16~C-19

中村 義男( 動物衛生研究所)

9 月18日(土) 9:00~16:50 第 3 会場

C-20

松本 芳嗣( 東京大学)

C-21~C-24

櫻井 達也( 北海道大学)

C-25~C-27

高島 康弘( 岐阜大学)

C-28~C-31

加藤健太郎( 東京大学)

C-32,C-33

西川 義文( 帯広畜産大学)

C-34,C-35

今井 壮一( 日本獣医生命科学大学)

C-36~C-38

横山 直明( 帯広畜産大学)

C-39,C-40

片倉 賢( 北海道大学)

C-41~C-43

佐藤 雪太( 日本大学)

C-44~C-46

田仲 哲也( 鹿児島大学)

C-47~C-49

加藤 大智( 山口大学)

C-50,C-51

松尾 智英( 鹿児島大学)

C-52,C-53

八田 岳士( 動物衛生研究所)

C寄生虫

(2)

A解   剖 B病   理 C寄生虫 DB微生物 (細菌) DI微生物 (免疫) DV微生物 (ウイルス) E家   禽 F公衛生 G繁   殖 HL臨床 (産業動物) HS臨床 (小動物) I生理・化 J薬・毒 K実動医 C寄生虫

C-4

Genetic characterization of the gullet worms,

Gongylonema sp., from water buffaloes in Nepal

Bishnu B. Adhikari1、Hari B. Rana1、Ishwari Dhakal1

○Aogu Setsuta2、Hiroshi Sato31Tribhuvan University,

Institute of Agriculture and Animal Science、2Osaka City

Government, Meat Inspection Centre、3Yamaguchi Univ.,

Lab. of Vet. Parasitol., Fac. of Agri.)

Whole lengths of esophagi of 111 Murrah cross water buffaloes (Bubalus bubalis) were collected at the site of slaughter or butcher’s shop in Kathmandu valley and Chitwan district of Nepal from December 2009 to February 2010, and examined parasitologically. The gullet worm, Gongylonema sp., was detected in 13 of 53 (24.5%) buffaloes (13/48 females and 0/5 males) in Kathmandu and 5 of 58 (8.6%) buffaloes (2/38 females and 3/20 males) in Chitwan. The partial rDNA sequence of Gongylonema sp. isolated from a water buffaloes contained 1782-bp long 18S, 404- to 410-bp long ITS1, 158-bp long 5.8S, 236-bp long ITS2, and 3536-bp long 28S rDNA sequences. When compared with those of Gongylonema pulchrum obtained from sika deer in Japan, cattle in Japan and Iran, and squirrel monkeys in captivity in Japan, 3, 0, and at least 19 base substitutions in 18S, 5.8S and 28S rDNA, respectively, were noted in the gullet worms from Nepal. Base changes such as deletions and insersions between the gullet worms in Nepal and Gongylonema pulchrum in ruminants from Japan and Iran were critical. Careful morphological observations for the species identification are still in process.

C-3

Helminths of wild boar (Sus scrofa leucomystax) in

Hyogo Prefecture, with the first record of Ascarops

dentata Linstow, 1904 (Nematoda; Spirocercidae) in

Honshu, Japan

○Mosaab Omar1、Masae Toda1、Tomoka Tsuji2,3

Mayumi Yokoyama3,4、Hiroshi Sato11Yamaguchi Uni.,

Lab. of Vet. Parasitol., Fac. of Agri.、2Gifu Univ., United

Graduate Sch. of Vet. Med.、3Hyogo Pref., Wildl.

Management Res. Center、4Univ. of Hyogo, Nat. &

Environ. Div., Inst. of Nat. & Environ. Sci.)

Helminthic endoparasites were collected from 92 wild boars (Sus scrofa leucomystax), 47 females and 45 males, caught in Hyogo Prefecture, Japan, during a period between July 2009 to April 2010. Most of them originated in Kobe City (n=46), followed by Toyooka City (n=15), Tanba City (n=11), Awaji City (n=4), etc. Twenty nematodes and one cestode species were detected in them as follows; 4 Metastrongylus spp. (M. elongates, M. salmi, M. asymmetricus, and M. pudendotechus), Gongylonema pulchrum, Gnathostoma doloresi, Physocephalus sexalatus, 2 Ascarops spp. (A. dentata, and A. strongylina), 3 Aonchotheca spp. (A. suis, Aonchotheca sp. B, and Aonchotheca sp. C), Ascaris suum, 2 Globocephalus spp. (G. samoensis, and G. longimucronatus), Strongyloides ransomi, Trichuris suis, Bourgelatia diducta, 2 Oesophagostomum spp. (O. watanabe, and O. dentatum), and Pseudoanoplocephala nipponensis. Ascarops dentata, measuring 19-23 mm (males) and 41-51 mm (females) in length, was recovered from the stomach of 32 wild boars caught exclusively in Kobe City. Gongylonema pulchrum was detected in the esophagus of one wild boar caught in Tanba City. These two species have never been recorded in wild boars in Honshu, Japan. Gongylonema pulchrum isolated from the wild boar was genetically characterized based on the rDNA nucleotide sequences.

Parasitological investigation of small mammals

collected from Qinghai Province, China (outline and

preliminary results)

○ K h a l i u n a a T s e v e g m i d1、 K a t s u r o H a g i w a r a1

Haruyuki Hirata1、Chiaki Ishihara1、Daiji Endoh1

K a z u y a M a t s u d a1、 H i r o y u k i T a n i y a m a1

M a s a h a r u M o t o k a w a2、 B u h o H o s h i n o3

Mitsuhiko Asakawa11酪農大 獣医、2京都大学博物館、3

農大 環境システム、4酪農大 獣医学部、5酪農大 獣医学部)

Several ecological studies on Tibetan mammals have been conducted, but there is little information regarding disease-causing agents which might affect wildlife or natural ecosystem there. Hence, in order to perform an field epidemiological investigation, 78 individuals of 9 lagomorph/rodent species, namely Ochotona curzoniae, Mus musculus, Meriones meridianus, Alticola stoliczkanus, Rhodopus roborovskii, Cricetulus longicaudatus, Dipus sagitta, and Alloctaga sibirica, from western part of China, Qinghai province were collected during August in 2007 and August-July in 2009, and its virological, protozoological, parasitological, pathological and molecular biological studies are proceeding. Until the present report, warble fly larvae (Oestromiya sp.) and 4 nematode genera (Ohbayashinema, Trichostrongylus, Cephaluris and 1 unknown genus belonging to the superfamily Strongyloidea) were found from O. curzoniae. It seems to be the first record of the superfamily from lagomorphs. From the rodent hosts, 4 other nematode genera including Heligmosomoides, Heligmosomum, Syphacia and Trichuris were obtained, however, we could not find any platyhelminth parasites. This study was supported by a Grants-in-Aid for Scientific Research (A) (No. 19255005) from the Japan.

最近の国内の東洋眼虫症発生状況 

○福本真一郎1、山田清太郎1、紺野浩司1、西脇 薫2、石田誠夫3 古屋雅親4、佐尾梨沙子5、足立真美5、鈴木 新51酪農大 獣医学部、2西脇小動物病院(新潟) 西脇小動物病院、3 田眼科医院(新潟) 石田眼科医院、4若林救急動物病院 若 林救急動物病院、5あらた動物病院 あらた動物病院) 【目的】最近複数の地域の犬猫から東洋眼虫症症例を経験したの で報告する.あわせて人獣の本症の発生報告状況について検索を 行ったので紹介する.【結果】新潟県上越市と妙高市の犬各1頭(症 例1;2001と2002年5月の2回;症例2;2004年11月),宮城県仙台市の 犬1頭(症例3;2009年10月)および埼玉県東松山市周辺の犬4頭(症例 4~7;2009年11月2例,12月1例,2010年2月1例)と 猫1頭(症 例8;2009 年8月)の結膜嚢から東洋眼虫Thelazia callipaeda の成虫が検出され た. 【考察】これら3県からは人獣を含め2002年以前には本症の記録 報告が無く,今回が最初の東洋眼虫症の地理的分布記録となった.大 阪府と大分県内で飼育されていた犬からの標本も再確認された.新 潟県と埼玉県の犬では同一個体で再感染が見られた.また東松山市 では同一病院からの短期間内での複数症例が確認され,さらに周 辺での複数の発生が認められ感染の集中が認められた.2009年まで の国内での東洋眼虫症例報告の検索により,これまで人体症例は1都 2府20県から,犬からは1都2府15県,猫からは1道1府7県が確認され ており,総括すると我が国では1都1道2府24県で感染が認められてい る.2002年以前の分布と比べペットでは北上している傾向が判明し た.各症例検出時期から犬糸状虫症の投薬の影響にも言及した.今回 の東洋眼虫症例をもとに人獣共通寄生虫病の分布拡大と宿主の移 動について考察した.

(3)

C-8

特定地域の野生アライグマで高頻度に検出される吸虫、

特 に M a c r o o r c h i s s p i n u l o s u s と E u r y h e l m i s

costaricensis

○ 相 津 康 宏1、 藤 井  武2、 藤 井 浩 平1、Mosaab Omar1 Khaled Sultan1、横山真弓2,3、佐藤 宏11山口大 農・獣 医寄生虫病、2兵庫県森林動物研究センター、3兵庫県立大 自然・環境科学研究所) 外来動物が国内に定着、個体数を増すことにより、従来、在来動 物で維持されてきた寄生虫の生活環の維持に新たな宿主として参 加し、その分布にも影響を与えることも十分に考えられる。私 たちは既に、アナグマ(Meles anakuma)を本来の宿主とする胃虫 Physaloptera sp.が、和歌山県産野生アライグマ(Procyon lotor)に 高率に寄生していることを報告した(Sato et al., 2006)。今回、2009 年5月―2010年2月にかけて佐賀県下で捕獲されたアライグマ100 頭、長崎県佐世保市で捕獲された20頭、兵庫県神戸市・三田市・ 三木市で捕獲された195頭の消化管寄生蠕虫の検索を行い、佐賀県、 長崎県での捕獲動物における3種の吸虫、Macroorchis spinulosus、 Euryhelmis costaricensis、Isthimiophora hortensisの 寄 生 状 況 が 特に注目された。M. spinulosusは、サワガニを第二中間宿主とす る小吸虫で(Ando, 1918, 1921)、和歌山県産アライグマで1.9% (10 /531)で検出されているが(Sato et al., 2006)、今回、佐賀県産で45 頭(45%)、長崎県産で7頭(35%)に検出され、その寄生数も1-565(平 均56)隻であった。E. costaricensisは、過去、北東北のホンドテ ン(Martes melampus)やアナグマ小腸からの成虫の検出(八木澤, 1976; Sato et al.,1999)、阿武隈山系北部のトウホクサンショウウオ (Hynobius lichenatus)での皮膚小結節(メタセルカリア寄生)の原因 として報告されている(Sato et al., 2010)。今回、佐賀県下で捕獲さ れたアライグマ1頭(1%)の小腸から139隻の成虫を回収した。兵庫 県産アライグマからはいずれの検出もなかった。

C-7

中国・四国地方におけるイノシシ猟犬の肺吸虫血清疫

学調査

○山口洋平、入江隆夫、三堂祥吾、南野知也、郭 志宏、 小林郁雄、野中成晃、堀井洋一郎(宮崎大 農・獣医寄生虫 病) 【目的】国内での肺吸虫に関する最近の疫学情報は乏しいが、ヒ トの肺吸虫症患者は散発的に発見されている。イヌは肺吸虫の好 適宿主であることから、九州でのイノシシ猟犬を対象に疫学調査 を実施し、224頭中147頭(65.6%)が肺吸虫特異抗体陽性であること を過去に明らかにした。今回は、中国・四国地方での調査を行なった。 【方法】中国(133頭)および四国(105頭)地方のイノシシ猟犬 を対象にELISAによる特異抗体検査により肺吸虫感染率を調べた。 さらに、聞き取り調査によりイノシシ肉生食歴の有無による感染 率の比較を行った。【結果】調査の結果、中国地方では63頭(47.4%)、 四国地方では55頭(57.2%)と、九州と同様に高い陽性率を示した。 また、イノシシ生食群では57.0% 、非生食群では19.0%の陽性率を 示し、両群間に有意差が認められた。(χ2:p<0.01) 【総括】今回 の調査で中国・四国地方でも肺吸虫の高度な蔓延が強く推定され た。このことは、この地域におけるヒトやその他の感受性動物に 肺吸虫感染の危険性があることを意味する。これらの情報は中国・ 四国地方でのヒトの呼吸器疾患あるいは肺の異常陰影の診断の際 に肺吸虫の鑑別診断が必須であることを示すものである。肺吸虫 の調査にあたり、中間宿主のカニや待機宿主のイノシシを調べる 方法が専ら行なわれていたが、これには多大な労力を要する。一方、 イノシシ猟犬は狩猟や給餌を通して多量のイノシシ肉を食する機 会を有していることから、イノシシ猟犬を調査することは、肺吸 虫の分布を知るための効率的な調査方法であると考えられる。現在、 猟犬の糞便から得られた肺吸虫卵のDNA遺伝子解析から、中国・ 四国地方に蔓延している肺吸虫種の同定を試みている。

ミャンマー産肝蛭の生殖型およびDNA型の解析

○市川まどか1,5、Saw Bawn2、Ni Ni Maw3、Lat Lat Htun2

片倉 賢4、板垣 匡1,51岩手大 農・獣医寄生虫病、2Dept. o f P h a r m a c o l . a n d P a r a s i t o l . , U n i v . V e t S c i . , M y a n m a r 、3L i v e s t o c k B r e e d i n g a n d V e t . D e p t . , Myanmar、4北大院 獣医学研究科・寄生虫、5岐阜大院連獣 病態獣医) アジアにはF. hepaticaとF. giganticaに加えて、貯精嚢内に精子が 存在しない単為生殖型肝蛭(Fasciola sp.)が分布する。我々は第149 回本学会において、形態学的、分子学的解析に基づき単為生殖型 肝蛭の起源は中国であることを示唆した。しかし、中国と隣接す る東南アジアの肝蛭では、ベトナム産肝蛭について報告(Itagaki et al. 2009)があるのみで、充分な情報が得られていない。そこで本研 究では、ミャンマー産肝蛭の解析を行い、周辺諸国の肝蛭との系 統関係を明らかにすることを目的とした。 ミャンマー北部のLashio市でウシから2虫体、南部のYangon市で 水牛14頭から18虫体を得て解析に用いた。各虫体の貯精嚢内精子 を染色標本にて確認した。また、各虫体からDNAを抽出し、核リ ボゾームDNAのITS1領域およびミトコンドリアDNAのND1領域 をPCRにより増幅した。ITS1領域はRFLP法により、ND1領域は ダイレクトシークエンス法により塩基配列を決定し、その違いに よりDNA型を識別した。ND1型についてはGenBank登録配列とと もに系統解析を行った。 全虫体は、貯精嚢内に成熟精子を有する両性生殖型でITS1型がFg 型であったことから、F. giganticaと同定された。ND1型において は4型のハプロタイプ(Fg-M1~M4)が識別された。このうちFg-M1 型が15虫体を占め、最も優勢であった。系統解析では、Fg-M1, M3, M4型は周辺諸国のF. giganticaとは異なる独立したクレードを 形成したことから、これらのハプロタイプはミャンマー産肝蛭に 特徴的な遺伝集団であると考えられた。一方、Fg-M2型は中国産 およびベトナム産のF. giganticaと同一のクレードに属し、これら と近縁であると考えられた。今後、虫体数を増やしてミャンマー 産肝蛭の遺伝的特徴を明らかにする予定である。

野生肉食動物の消化管寄生毛細線虫種の形態型と遺伝

型の関連性

○ 戸 田 正 枝、 相 津 康 宏、 藤 井 浩 平、Mosaab Omar、 Khaled Sultan、佐藤 宏(山口大 農・獣医寄生虫病)  国内の野生肉食動物の消化管に寄生する毛細線虫について検討 した。すなわち、国内各地のテン、タヌキ、アナグマなどの在来動物、 さらにハリネズミやアライグマなどの外来動物の消化管寄生蠕虫 検査の折に虫体を回収し、形態学的観察とともに18S rDNA塩基 配列についても今回検討した。国内野生肉食動物の胃を中心とし た消化管から回収される虫体の多くは、Mustela putoriusを標準宿 主とするAonchotheca putorii (Travassos, 1915)に形態が酷似して いた。しかし、より詳細な観察により、雄虫では、交接刺長と尾 端の突起基部からその突起の乳頭先端までの長さ、それぞれにお いて二極化があり3型に分けられた。雌虫では、陰門部周辺の隆起 の特徴により2型に分けられ、1個体から回収される虫体に複数の 雌雄の形態型が見つかることもしばしばであった。ほぼ全長にわ たる18S rDNA塩基配列を用いた分子系統樹をつくると、それぞ れの形態型がクレードをつくった。すなわち、形態型と遺伝子型 の間には強い相関性があるが、いまのところ、それらと特定の動 物種や地域との関連性は見出されていない。また、佐賀県産アラ イグマの食道から検出した毛細線虫は、Butterworth & Beverley-Burton(1980)によって再記載されたEucoleus procyonis (Pence, 1975)の形態と一致した。さらに、和歌山県産アナグマ1個体の胃 と小腸、および佐賀県産アナグマ1個体の小腸からもEucoleus属毛 細線虫を検出しているが、雄虫の尾端の構造や雌虫の陰門部、お よび虫卵の卵殻表面の構造の明らかな違いから、胃寄生の種と小 腸寄生の種は別種と考えられた。

(4)

A解   剖 B病   理 C寄生虫 DB微生物 (細菌) DI微生物 (免疫) DV微生物 (ウイルス) E家   禽 F公衛生 G繁   殖 HL臨床 (産業動物) HS臨床 (小動物) I生理・化 J薬・毒 K実動医 C寄生虫

C-12

ラット小腸寄生線虫Orientostrongylus ezoensisの感染

時における胃の影響

○山田清太郎、田澤寿保、石原智明、植田弘美、翁長武紀、 北澤多喜雄、平田晴之、福本真一郎(酪農大 獣医) 消 化 管 線 虫 症 の げ っ 歯 類 実 験 動 物 モ デ ル に はNippostrongylus brasiliensis(以下、Nb)などが用いられ、宿主-寄生体関係の解明 に用いられている。我々はNbと同亜科の当研究室のみで維持して いるラット小腸寄生線虫Orientostrongylus ezoensis(以下、Oe)を用 いてNbとの感染の特性を比較した研究を行っている。Oeの主な 自然宿主はドブネズミ(Rattus norvegicus)であり、経口感染で体内 移行や組織侵入を行わない。Nbはラット、マウス(Mus musculus)、 などを実験動物宿主とし、経皮感染によって寄生する。Oeは、ラッ ト、スナネズミ、ハムスターに感受性が確認されているがマウス では感染が成立しなかった。OeとNbの宿主特異性に関わっている 要因を明らかにするため、胃酸により非特異的な感染防御の門戸 として重要な役割を持つ胃に注目をした。【材料と方法】(1)無腺部 除去ラットに、OeL3 1000匹経口投与(po)群、(2)シメチジンにより 胃酸分泌抑制をしたラットにOeL3 1000匹po群、(3)シメチジンに より胃酸分泌抑制をしたマウスにOe L3 500匹po群、以上3つの実 験を行った。【結果】実験(1)では手術ラット群からの回収虫体数は 対照群よりも有意に減少した(P<0.05)。(2)ではシメチジン処置群 が対照群よりも有意に高い虫体回収が認められた(P<0.05)。(3)シ メチジン投与マウス個体のみから約3.4%のOe成虫が回収され無処 置対照群からは回収されなかった。【考察】(1)と(2)から胃酸により OeのL3がダメージを受けることが明らかになった。(3)では今回初 めてマウスにOeL3のpoによる感染が証明されマウス利用の可能性 が開けた。以上のことから感染初期の自然抵抗性として胃酸の影 響が確認され、宿主特異性を規定する要因としての解明にも重要 な情報となった。

C-11

経時的CT検査による肺吸虫のイヌ体内動態の観察

○小川篤史1、佐藤裕之1、三堂祥吾2、野中成晃2、山口洋平2 入江隆夫2,3、浅沼武敏1、堀井洋一郎21宮崎大 獣医臨床放 射線、2宮崎大 獣医寄生虫病、3宮崎大 大学院医獣総合研 究科) 【背景】ヒトにおける肺吸虫症のCT検査による報告は数多く存 在し、ヒト体内における肺吸虫の動態は明らかになりつつあるが、 イヌにおけるその報告は少なくイヌ体内における動態は明らかと なっていない。さらに、ヒトとイヌでは肺吸虫に対する宿主反応 が異なることが知られており、肺吸虫の体内動態も異なることが 推測される。また、駆虫薬の効果は宿主の血管分布に依存し、シ ストの形成部位により効果は大きく変化すると考えられるため、 肺吸虫の宿主体内における動態を理解することは重要である。そ こで今回、実験犬を感染させ経時的にCT検査を行い、肺吸虫のイ ヌ体内の動態を検討した。 【方法】実験にはビーグル犬3頭を用い、 Paragonimus属2種のメタ セルカリア(Mc)を経口または腹腔内投与した。CT検査はヘリカル CT装置を使用し、得られた画像より病変の経時的変化について検 討した。 【結果】症例1. 大平肺吸虫Mc4個感染:感染初期、肺内に1週間 で消失する浸潤性陰影が頻出した後、境界明瞭な結節が形成され た。症例2. 宮崎肺吸虫Mc20個感染:右後葉に存在した結節は消失し、 肺のすりガラス様X線不透過像や1週間で消失する浸潤性陰影が頻 出すると同時に気胸の発生も確認された。その後、左後葉に新た な境界明瞭な結節が形成された。症例3. 大平肺吸虫Mc20個感染: 左後葉に存在した結節は次第に消失し、同時にこの頭側部で新た な結節が形成された。 【総括】肺吸虫症の感染初期および結節の消失後、イヌ肺内に頻 出する浸潤性陰影は、肺吸虫が宿主肺内を移動する際の物理的傷 害や炎症を反映して出現するものと考えられた。また、肺吸虫は イヌ肺内においてシストの形成、消失および移動を繰り返し寄生 していることが示唆された。

多 包 虫 感 染 コ ッ ト ン ラ ッ ト の 腹 腔 内 シ ス ト 塊 由 来

cDNAライブラリーに含まれていた宿主由来cDNAの解

○奥祐三郎1、八木欣平2、原雄一郎3、渡辺日出海3、李 爽4 山下理宇4、若栗浩幸4、鈴木 穣4、豊田 敦5、渡辺純一41 大 獣医寄生虫、2北海道立衛生研究所 医動物学、3北大 情報科学研究科、4東大 医科学研究所、5遺伝学研究所)  我々は多包条虫の成虫および幼虫のcDNAライブラリーについ て報告してきた。この幼虫のcDNAライブラリを作成するためには、 コットンラットの腹腔に寄生する多包虫シスト塊からmRNAを調 整した。したがって、幼虫のサンプル中には一部宿主細胞が含ま れているが、Blast検索により、約9,870クローンについてネズミ類 と相同性の高いものであった。これら宿主由来と予想されるcDNA について報告する。 まず、リボソーム蛋白類は1,160クローン以 上含まれていたが、その他、特に多数認められたクローンとしては、 免疫グロブリン(軽鎖および重鎖)、オステオポンチン、フェリチン 重鎖、リゾチームC、アルブミン、アポリポプロテインE、β2ミ クログロブリン、チモシンβ4、トランスフェリン、ハプトグロビ ン、ビメチン、デコリンなどであった。オステオポンチンについ ては炎症・肉芽腫との関連も知られ、単包虫のシスト周辺に含ま れていることがPeng et al (2006)によって報告されている。 免疫 関 連 のcDNAと し て、CD抗 原 で はCD63、CD74,CD147、CD81 お よ びCD14、MHC関 連 で はMHC class I H-2Dr、MHC class II antigen E-K α、MHC class II antigen RT1 class II、MHC class II antigen AαおよびEβ等が多く見られた。 今回の材料は感染 後のみで、感染前の状況は不明であるが、既に報告されている多 包虫の病理組織学的な知見から、これらのmRNAの由来としてマ クロファージ、線維・線維芽細胞、リンパ球、形質細胞等の可能 性が考えられる。

Screening of Schistosomiasis among water buffaloes

in Luzon, the Philippines using ELISA and COPT

○Jose Ma Angeles1、Lydia Leonardo2、Pilarita Rivera2

Elena Villacorte2、桐木雅史3、千種雄一3、井上 昇1、後藤康之1

河津信一郎11帯畜大 原虫病研究センター、2University of

the Philippines, College of Public Health、3獨協医科大学

熱帯寄生虫病)

Schistosomiasis has been one of the most prevalent parasitic diseases affecting 76 countries. Schistosoma japonicum occurs in Southeast Asia and western Pacific countries. In the Philippines, endemic areas for schistosomiasis are confined in 12 regions. Schistosomiasis is known as neglected zoonotic disease, but animal surveillance for the disease has not yet been developed in the Philippines and identification of these animal reservoirs has not fully studied. In a study done in 2008 on two endemic foci in the Philippines showed that there was 4% positivity for schistosomiasis among water buffaloes tested using Kato-Katz technique for fecal samples. We tested water buffaloes in 3 endemic areas in Luzon, Philippines for schistosomiasis namely Cagayan, Sorsogon and Oriental Mindoro using the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and circum-oval precipitin test (COPT) as screening methods. On the initial results, out of the 80 serum samples, 12 samples were positive for COPT (15%). For the ELISA, 9 showed high OD values (11.25%), 5 of which are also positive for COPT. These results indicate that there is certain level of infection rate among the water buffaloes, possibly contributing to the transmission of schistosomiasis to humans. Inclusion of zoonotic surveillance may therefore play an important role in the control and elimination of schistosomiasis in the Philippines.

(5)

C-16

ニホンザル(Macaca fuscata)から検出された新型ピ

ロプラズマ原虫の進化系統解析

○平田晴之1、川合 覚2、前田真理1、陳内理生1、藤澤幸平1 片貝祐子3、彦坂健児4、田辺和裄4、保富康宏5、石原智明11 農大 獣医学部 実験動物、2獨協医科大学 熱帯病寄生虫 病室、3予防衛生協会、4阪大微研 マラリア学、5基盤研 霊 長類医科学研究センター) 【背景】近年、各種野生動物から新型ピロプラズマ原虫の検出が 相次ぎ、ピロプラズマ原虫における進化系統の概念が大きく変化 しつつある。サル類からのピロプラズマ原虫の検出は、これまで にいくつか報告されているが、その遺伝子解析については、Wel ら(Am. J. Top. Med. Hyg. 78:643,2008)の論文のみで、原虫間の異 同は未だ不明である。今回我々は、これまでに報告のなかったニ ホンザル(Macaca fuscata)の末梢血液よりピロプラズマ原虫を検 出し、本原虫に関する遺伝子解析およびその進化系統解析を行った。 【方法】実験用に繁殖され、市販動物として購入したニホンザル (4歳齢、♀)1頭に対し、脾臓摘出を施したところ、脾臓摘出か ら113日後、赤血球球内に2~3μmの原虫を検出した。この個体か ら採取した血液試料よりゲノムDNAを抽出し、ピロプラズマ原虫 18S rRNA遺伝子(SSUrDNA)及びβ-tubulin特異的プライマーを 用いて、それぞれの遺伝子を増幅した。 増幅されたPCR産物はク ローニングした後、塩基配列を決定し、進化系統解析を行った。【結 果と総括】進化系統解析の結果、本原虫はエゾリスから分離され たBabesia microtiと同じクレードに帰属する新しい型のピロプラ ズマ原虫であると判定された。これまでピロプラズマ原虫は、多 くの野生動物から検出されているものの、遺伝子情報をもとにし た種の同定や系統解析はほとんど着手されていない。従って、本 研究で得られた新たな情報は、今後ピロプラズマ原虫の分類およ び進化系統解析を進めていくうえで、貴重なスタンダード情報と なることが期待される。

C-15

釧路湿原周辺に生息する蚊の鳥マラリア原虫保有状況

および吸血源動物種について

○江尻寛子1、佐藤雪太2、金 京純3、津田良夫3、村田浩一4 齊藤慶輔5、渡辺有希子5、志村良治6、湯川眞嘉21日本大院 獣・実験動物学、2日本大 獣・実験動物学、3感染研 昆虫 医科学、4日本大 動物資源・野生動物、5猛禽類医学研究所、6 路市動物園) 【背景・目的】 これまでに、我々は関東地方に生息する各種蚊から鳥マラリア原 虫(Plasmodium spp.)遺伝子を検出し、吸血源動物種を推定して、 蚊と鳥類間での原虫伝播を示唆してきた(Ejiri et al., 2008, 江尻ら、 2010)。北海道には本州以南ではほとんど見られない蚊種が多く生 息しており、鳥マラリア原虫の保有状況および吸血嗜好性は不明 である。そこで今回、釧路湿原周辺で蚊を捕集し、原虫遺伝子の 検出と吸血源動物の同定を行った。 【材料・方法】 2009年8月3、4日の2日間、釧路市動物園および釧路野生生物保護 センターとその周辺において、CDC型ドライアイス誘引トラップ および捕虫網によるスウィーピングによって蚊を捕集した。形態 学的に種を同定した捕集蚊のうち、腹部に血液貯留が認められた 個体を吸血蚊とし、頭胸部と腹部とを分離してそれぞれからDNA 抽出した。頭胸部と腹部由来DNAはマラリア原虫mtDNA cyt b、 腹部由来DNAは脊椎動物mtDNA(16Sまたはcyt b)の増幅を試み、 原虫の保有状況と吸血源動物種の同定を行った。 【結果・考察】 7種232個体の吸血蚊が捕集され、80%以上をエゾヤブカが占め ていた。鳥マラリア原虫遺伝子は増幅されなかったが、203個体 (87.5%)から脊椎動物の増幅シグナルが得られた。増幅産物の塩 基配列の相同性から、釧路市動物園の蚊は飼育下動物(ほ乳類2種、 鳥類1種)とヒト、釧路野生生物保護センターの蚊はエゾシカ、ウ シ、オオワシ、オジロワシなど、ほ乳類5種および鳥類3種を吸血 していた可能性が示唆された。また今回、これまで吸血嗜好性が 不明であったエゾヤブカ、ミスジハボシカおよびヤマトハボシカ が哺乳類と鳥類を吸血することが初めて示唆された。

国内におけるオオミズナギドリの鳥マラリア原虫感染

○村田浩一1、佐々木絵美7、佐藤雪太1、炭山大輔1、佐藤克文2 越智大介3、岡奈理子4、山本麻希5、山本誉士61日本大 生 物資源科学部、2東大 海洋研、3遠洋水産研、4山階鳥類研究 所、5長岡技術科学大、6総研大、7日本大院) 【背景と目的】国内における鳥マラリア感染状況の把握は未だ不 完全である。とくに海鳥に関しては情報が少ない。そこで本研究 では、繁殖期を除いてほとんどを洋上で過ごすオオミズナギド リ(Calonectris leucomelas)の鳥マラリア原虫保有状況を調査 した。【材料と方法】岩手県三貫島、東京都御蔵島および新潟県 粟島で、156羽から血液採取した。塗抹染色標本を鏡検すると共 に、鳥マラリア原虫のmtDNA cyt b 部分領域(478 bp)を標的と したnested-PCRを行った。増幅産物の塩基配列を決定して分子系 統解析した。【結果と考察】Plasmodium sp.が全検体の14.1%から 検出された。原虫が検出されたのは、粟島の成鳥22羽(41.5%) からのみであった。原虫遺伝子の塩基配列はすべて同一で、オオ ヨシキリ(Acrocephalus arundinaceus)などのヨーロッパおよび アフリカ産鳥類4種およびアフリカで採集された蚊(Cercotrichas galactotes)から検出報告のある遺伝子配列と98%一致していた。 分子系統解析では、東南アジアやオーストラリア産の鳥類から検 出された原虫群とは異なるクラスターに位置しており、ヨーロッ パやアフリカの鳥類から検出されたものとより近縁であった。繁 殖地(島)によって原虫の検出状況が異なるのは、他の鳥種との 関係が考えられた。オオヨシキリは、アフリカ北部から中国東部 にかけて広く繁殖分布し、フィリピン・ボルネオ島などで越冬する。 国内へは夏鳥として飛来するが、調査地の中では粟島でのみ繁殖 が確認されている。今後は、調査地における他の鳥類からの原虫 検出が求められる。本研究は文部科学省ハイテク事業および学術 フロンティア推進事業による私学助成を得て行われた。

New aspects of parasitic infection: an atherogenic

lipid profile with lowered metabolizing enzyme activity

during nematode infection

○Ayman Samir Farid1,2、堀井洋一郎11宮崎大 農・獣医

寄 生 虫 病、2Benha University, Dept. Clin. Pathol., Facult.

Vet. Med.)

We studied the effects of N. brasiliensis (Nb), a model of human GI nematodes, infection in male Wistar rats on atherosclerosis initiation and metabolizing enzyme activities, particularly through its effect on hepatic paraoxonase (PON1) synthesis and disturbances in the lipid profile. Using standard (sd) and high-fat (hf) diet, we found that Nb-infected rats fed a sd diet show a significant reduction in serum PON1 activity and down-regulation of hepatic PON1 mRNA expression as well as up-regulation of hepatic IL-1β, IL-β receptor (R), TNF-α, and TNFR1 mRNA expressions in association with hepatic recruitments of Kupffer cells and neutrohils. In the presence of a hf diet, Nb infection increases the levels of serum triglycerides, total cholesterol, low density lipoprotein/very low density lipoprotein, and oxidized LDL as well as decreases HDL coinciding with a maximum serum PON1 reduction. Also, on day 7 PI, Nb induced a significant reduction in plasma cholinesterase enzyme activity; an enzyme hydrolyzes ester-containing compounds such as succinylcholine and acting as a neurotoxic scavenger. These results indicate that Nb infection could be a potential risk for atherosclerosis via reducing serum PON1 activity and inducing lipid metabolism disturbances, and also may affect the degradation of the muscle relaxant succinylcholine, which is usually given before anesthesia, and thus run the risk of prolonged apnea.

(6)

A解   剖 B病   理 C寄生虫 DB微生物 (細菌) DI微生物 (免疫) DV微生物 (ウイルス) E家   禽 F公衛生 G繁   殖 HL臨床 (産業動物) HS臨床 (小動物) I生理・化 J薬・毒 K実動医 C寄生虫

C-20

マラリア原虫感染時における宿主血中アミノグラム解

○万代一翔1、斉木選射1、土井裕子1、長尾健児2、坂内 慎2 福本晋也1、嘉糠洋陸11帯畜大 原虫セ、2味の素ライフサ イエンス研) バベシア原虫やマラリア原虫などの血液寄生性原虫は、寄生部位 である血流中、または赤血球や血管内皮などの細胞内において分 裂・増殖を繰り返すが、これにあたり周囲の環境から栄養素を取 り込んでいる。このような栄養素の一つとしてアミノ酸について、 マラリア原虫は何種類かのアミノ酸の合成経路を欠いていること、 アミノ酸源を宿主のヘモグロビンおよび血中アミノ酸に依存して いることから、宿主血中のアミノ酸は血液寄生性原虫の寄生成立 にあたり重要な役割を果たしていると考えられる。 齧歯類特異的マラリア原虫(Plasmodium berghei)感染後のマ ウス血漿成分を用いて、その中に含まれるアミノ酸およびその誘 導体計40種類以上を網羅的に解析したところ、感染が進行するに 従って各種血中遊離アミノ酸の濃度が劇的に変動することが明ら かとなった。各アミノ酸の濃度変化を多変量として扱い、アミノ グラムのクラスター解析をおこなった結果、非感染群と感染後期 群間で明確な違いが観察された。特徴として、感染群においてロ イシン、イソロイシン、バリンなどの分岐鎖アミノ酸(BCAA) 濃度が一斉に上昇していること、また逆にグリシン、グルタミン酸、 チロシン、トリプトファンなどの濃度が減少することが挙げられる。 これらのアミノ酸群の代謝合成経路は複雑な栄養ネットワークと して構成されていることから、相互に関連するアミノ酸多変量が 感染症の過程を定義する可能性を強く示唆している。本研究では、 この齧歯類マラリア原虫感染モデルを中心に、宿主血中遊離アミ ノ酸情報(アミノ酸インフォマティクス)を解析パラメータとし、 病原体―宿主間の新しい相互作用解明を試みており、その最新の 成果を報告したい。

C-19

B.microti原虫類の進化解析マーカーとしてのイントロ

ン配列の有用性評価

○藤澤幸平1、中嶋瑠衣1、陳内理生1、平田晴之1、新倉 綾1 倉田貴子2、石原智明11酪農大 実験動物学教室、2大阪府 立公衆衛生研究所) 【目的】CCT7 (CCTη)遺伝子のイントロン位置及びサイズによっ てBabesia microtiグループが新属と確定されたことにより、種や 亜種など、近縁関係の解明が新たな課題として浮上している。そ こで今回CCT7 の6個のイントロンの塩基配列について有用性を検 討した。【材料と方法】27株の原虫のCCT7 遺伝子イントロン配 列について、AT/GC比、突然変異の種類、出現頻度、及び配列に 基づく進化系統樹をcording sequences (CDS)の物と比較し、進化 マーカーとしての有用性を評価した。【結果】CCT7 遺伝子の6個 のイントロン全てが標準的な5’-GT...AG-3’構造を持ち、高A-T 含量を示したが原虫株による差異もみられ、A-T比によって7亜群 に区分け出来た(人獣共通感染症の病因となる4つのグループ: US、Kobe、Hobetsu、Munichを含む)。一次塩基配列の比較より、 47箇所の単塩基置換と11箇所の挿入/欠失を発見し、それらの大半 は、USとKobeに存在した。25塩基数以下の極小イントロンを個別 に用いた系統樹解析では十分な解析精度がなかったが、大サイズ のイントロンは単独で、6個全てを繋げた配列データからは更に高 信頼度の進化系統樹が得られた。この系統樹から、USグループを さらにアメリカ、中央アジア、極東アジアの3亜群に分類できるこ とが確かめられた。【総括】イントロンの塩基配列に基づく進化解 析手法は期待通りの高い解析精度を示した。今後は、より詳細な US、Kobe、Hobetsu、Munich相互の進化関係や、各原虫系列個々 の地理的拡散経緯の解明に向けて、サンプル密度を上げた検討が 必要である。

イ ヌ 赤 血 球 置 換 マ ウ ス を 利 用 し た ヒ グ マ か ら の

Babesia原虫のクローニング

○西和田淳1、平田晴之1、陳内理生1、藤澤幸平1、中村公亮2 石原智明11酪農大 実験動物学教室、2国立医薬品食品衛生 研究所 代謝生化学部) 【背景】多くの野生動物は異なる遺伝子型のBabesia属原虫に混合 感染していることが知られている。これらの血液寄生原虫の性状 解析・診断開発などの応用研究を行うためには1種類の原虫を分離 することが必要であるが、ほとんどのBabesia属原虫はin vitro培養 ができない。従来、混合感染している動物から原虫を単独分離す るために赤血球の限外希釈法が行われてきたが、この方法では労 力と時間が必要である。そこで、我々は新たなクローニング方法 としてイヌ赤血球置換マウスにヒグマのBabesia属原虫感染赤血球 を静脈内投与することによりヒグマのBabesia属原虫の単一株を得 ることを試みた。【方法】2009年に江差町で捕獲されたヒグマの血 液を用いた。DNAを抽出し、ピロプラズマ18S rRNA遺伝子(SSU rDNA)特異的プライマーを用いて遺伝子を増幅し、ダイレクトシー クエンス、PCR-RFLP assayを行った。また、同じヒグマ個体の血 液をイヌ赤血球置換マウスに静脈内投与し原虫のin vivo培養を行 い、その血液を用いて同様に解析した。【結果と考察】ダイレクト シークエンス、PCR-RFLP assayの結果よりヒグマにおける原虫の 混合感染を確認した。in vivo培養では約50日間で2峰性の寄生率上 昇を示し、原虫が点突然変異を起こしてヒグマ赤血球からイヌ赤 血球に宿主転換したことが示された。原虫のSSU rDNAの塩基配 列の解析は、宿主転換前の原虫DNAでは不可能であったが、宿主 転換後の原虫DNAの塩基配列は決定出来た。さらに、宿主転換前 後でのPCR-RFLP assayにおけるバンドパターンの比較により、宿 主転換後のBabesia属原虫はクローンである事が証明された。今後、 他の動物においても同様の方法を用いた原虫のクローニングが期 待される。

岩 手 県 の ツ キ ノ ワ グ マ か ら 検 出 さ れ たHepatozoon

sp.とBabesia sp.について

○ 井 河 和 仁1、 青 木 美 樹 子1、 山 内 貴 義2、 市 川 ま ど か1 板垣 匡11岩手大 農・獣医寄生虫病、2岩手県環境保健研 究センター 地球科学部) 【背景と目的】岩手県では1998年より保護管理対策の一環として ツキノワグマの個体調査を継続して行っており、並行して寄生虫 の保有状況の調査もすすめられてきた。本研究では、ツキノワグ マが保有する住血性原虫類を明らかにすることを目的とした。【材 料と方法】1998年から2009年にツキノワグマ131頭から得られた血 液または肝臓を検体とし、全DNAを抽出した。Gubbelsら(1999) を一部改変したPCR法により、18S rRNA遺伝子のDNA断片(約 500bp)をPCR増幅した。増幅断片はダイレクトシークエンス により塩基配列を解析し、Genbank登録配列と相同検索を行っ た。検出されたBabesia sp.については新たにプライマーを設計し 18S rRNA遺伝子の1635bpの塩基配列を決定し、様々な宿主由来 のBabesia spp.と系統学的に解析した。【結果と考察】131検体中89 検体(68%)から約520bpの増幅断片のみが得られ、その塩基配列 はHepatozoon ursi(EU041717)と98~99%の相同性であった。また、 4検体(3%)から約480bpの増幅産物のみが確認され、その塩基 配列は、Inokumaら(2003)がヤマトマダニから検出したBabesia sp.(AY190124)と高い相同性(97%)を示した。さらに、12検体(9%) では約520bp、約480bpの増幅産物がどちらも得られた。今回の研 究で検出されたBabesia sp.の塩基配列1635bpではAY190124との相 同性が99%であり、系統樹でもAY190124とともに独立した一つの クレードをつくり、牛由来のBabesia bigemina や犬由来のBabesia canisとは多系統であった。また、ツキノワグマの地理的由来と原 虫DNAの検出との関連はみられなかった。

(7)

C-24

Aldolase forms a bridge between the actin

cytoskeleton and TRAP cytoplasmic tail in Babesia

gibsoni

○ 具  潤 景、M, Alaa Terkawi、 山 岸 潤 也、 西 川 義 文、 玄 学南(帯畜大 原虫病センタ-)

Babesia gibsoni is one of apicomplexan parasites and causes canine babesiosis resulting mainly anemic symptoms and fever in dogs. The apicomplexan parasites use a unique mode of locomotion termed gliding motility to invade host cells and cross cell substrates. Genetic and functional studies about gliding motility for Plasmodium species and T. gondii have demonstrated that aldolase interacts with the C-terminal of adhesins belonging the thrombospondin-related anonymous protein (TRAP) family and micronemal proteins (MICs). Previous study has identified B. gibsoni TRAP (BgTRAP) and determined that BgTRAP is an essential factor for a binding of parasites to erythrocytes and a parasite growth. Therefore, B. gibsoni aldolase (BgALD) was characterized that it has high homologues with aldolases of other apicomplexan parasites. Furthermore, conserved tryptophan (W) and glutamic acid (E) residues, key factors for interacting with aldolase, were found in cytoplasmic domain of BgTRAP (BgTRAPc), and phylogenic analysis of aldolases demonstrated shared identities. For further studies, BgALD, BgTRAPc, and BgTRAPm (corresponding tryptophan (W) to alanine (A) mutant) were cloned and expressed. BgALD was observed in cytoplasm in B. gibsoni parasites in IFAT. Lastly, interaction between BgALD and BgTRAPc was determined by GST fusion protein pull-down assay, which appeared that BgTRAPc bound BgALD (without GST) in a W-dependent manner.

C-23

陰イオン性糖類が引き起こす熱帯熱マラリア原虫メロ

ゾイトの赤血球侵入阻害機序の解析

○小林郷介、竹前 等、杉 達紀、ゴン海燕、明石博臣、 加藤健太郎(東大 農・獣医微生物) 【背景】原虫類の増殖には「宿主細胞への侵入」が不可欠であり、 これを阻害する薬剤の開発は原虫感染症の予防、治療において極 めて有効と考えられる。したがって我々は、ヒトに重篤な疾患を 引き起こす熱帯熱マラリア原虫をモデルとして、細胞侵入機構の 解析を行ってきた。現在までに、陰イオン性糖類の一種「ヘパリン」 が原虫メロゾイトの赤血球侵入を阻害することを明らかにし、侵 入時に赤血球表面に結合するメロゾイト表面蛋白質BAEBLの結合 が、ヘパリンによって阻害されることを明らかにした。しかしな がら、BAEBLは、複雑なメロゾイト侵入経路の一部を担うに過ぎ ない点を考慮すると、他にも糖類の影響を受ける分子が存在する と考えるのが妥当である。【目的】ヘパリンがメロゾイト侵入を阻 害する機序を明らかにする。【結果】1)虫体由来の赤血球結合性 分子のほとんどがヘパリンと結合する可能性が示された。2)メロ ゾイトの表面には、ヘパリンと結合する因子が存在することが示 され、それらの多くはマイクロネームと呼ばれる特殊な分泌器官 に局在しており、メロゾイトの先端部においてヘパリンと相互作 用することが明らかとなった。3)現在までに侵入に関与すること が示唆されている複数の原虫分子の赤血球結合が、ヘパリンによっ て阻害された。【考察】これらの結果は、メロゾイト侵入を媒介す る複数の経路が、ヘパリンにより同時に遮断されることで、メロ ゾイト先端部と赤血球膜との間で形成されるタイトジャンクショ ンが形成されず、その結果、侵入阻害が引き起こされるという可 能性を示唆するものである。

A novel PAN domain-containing protein from

Toxoplasma gondii: characterization and receptor

identification

○Haiyan Gong、小林郷介、杉 達紀、竹前 等、黒川 瞳、 明石博臣、加藤健太郎(東大 農学部) Toxoplasma gondii is a kind of intracellular parasite that invades almost all nucleated cells. The attachment of the parasite to the host cell is dependent on Glycosaminoglycans (GAGs), including chondroitin sulfate, heparan sulfate and keratan sulfate etc. In this study, a novel protein from T. gondii was characterized and its receptor was identified. P104, which contains 5 apple domains, showed low homology to other PAN domain-containing molecules. The protein with expected molecular size of 104 kDa was detected in the T. gondii lysate. Immunological fluorescence assay (IFA) indicated the presence of P104 at the apical end of the extracellular T. gondii, but the absence of it in intracellular parasite. The Fc-recombinant protein which contains one or two PAN domains showed strong binding activity to all tested cells, including 4 kinds of mammal cells and 2 kinds of insect cells. This binding is not associated with the protein-protein, but the protein-GAGs (chondointin sulfate (CS)) interaction. The above result hints that P104 expressed at the apical end of the extracellular parasite may play as a ligand for the attachment of T. gondii to the CSs or other receptors of the host cells and thus facilitate the invasion of the parasite.

トキソプラズマ感染末梢血単核球のCD44を介したヒア

ルロン酸への結合

海野明広2、鬼頭克也1,2、鈴木和彦3、○高島康弘1,21岐阜大 応用生物科学部獣医寄生虫病学分野、2岐阜大院連獣、3東大 獣医病理学) 【目的】トキソプラズマは腸管から宿主体内に侵入し、白血球に 感染することで血液・リンパ行性に全身へ播種的に伝播する。白 血球がどのように本原虫を末梢臓器に運搬しているのかについて は未知の部分が多いが、我々はこれまでに本原虫に感染したヒト 末梢血単核球においてCD44の発現レベルが上昇することを報告し ている。CD44はヒアルロン酸レセプターとして知られており、ト キソプラズマ感染単核球が細胞外マトリクス構成成分であるHA へ吸着することで血流から末梢臓器へ効率よく移行できる可能性 を示している。今回はこの可能性を検証するため、本原虫に感染 したヒト末梢血単核球が非感染細胞に比べ効率よくHAに吸着で きるか、またそのような吸着にCD44が関与しているかどうか確認 した。【方法】ヒト末梢血単核球にトキソプラズマを感染させHA コートしたプレート上で1時間培養し、培養開始段階の細胞の感染 率と培養後に底面に吸着した細胞の感染率を比較した。また培養 中に抗CD44抗体を加えることで感染細胞のHAへの吸着が阻害さ れるかどうか検証した。【結論】培養開始段階の感染率に比べ1時 間後にHAに付着した細胞のほうが感染率が有意に高かった。こ れは本原虫感染細胞が非感染細胞に比べてHAにより吸着しやす いこと、HAコートプレート上で感染細胞が濃縮されたことを示 している。このような感染細胞の濃縮は抗CD44抗体の抗体の添 加で抑制された。これらの結果からトキソプラズマ感染単核球は CD44分子を介して非感染細胞より効率よくHAに吸着しているこ とが示された。

(8)

A解   剖 B病   理 C寄生虫 DB微生物 (細菌) DI微生物 (免疫) DV微生物 (ウイルス) E家   禽 F公衛生 G繁   殖 HL臨床 (産業動物) HS臨床 (小動物) I生理・化 J薬・毒 K実動医 C寄生虫

C-28

Toxoplasma gondiiにおける宿主細胞MAPK p38α非

依存性のタキゾイトからブラディゾイトへのステージ

転換

○林 武志1、鬼頭克也1,2、高島康弘1,21岐阜大院連獣 連獣・ 獣医寄生虫病、2岐阜大 応用生物科学・獣医寄生虫病) Toxoplasma gondiiにおける宿主細胞MAPK p38α非依存性のタキ ゾイトからブラディゾイトへのステージ転換○林 武志1、鬼頭 克 也1、高島 康弘1(1岐阜大学・獣医寄生虫病学分野)Toxoplasma gondiiは中間宿主に感染すると、始め急速に増殖するタキゾイトと 呼ばれるステージを取るが、一部の虫体は脳や筋肉で増殖が緩慢 な潜伏型の虫体であるブラディゾイトへとステージ転換する。こ のようなT.gondiiのステージ転換はin vitro ではSB202190のよう な分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK) p38α/β阻 害剤で宿主細胞を処理することによって誘導できる。しかし、宿 主細胞のMAPK p38α/β活性の低下がステージ転換の直接的な 要因となるかどうかはまだ知られていない。本研究ではMAPK p38αに注目し、T.gondiiの潜伏への関与を検証した。実験には MAPK p38α遺伝子ノックアウトマウスの胎児由来線維芽細胞で あるKOP細胞を使用した。KOP細胞にT.gondiiのタキゾイトを感 染させ5日間観察したところ、タキゾイトは増殖を続け、ブラディ ゾイトへステージ転換しなかった。一方、KOP細胞をSB202190で 処理した場合、タキゾイトがブラディゾイトにステージ転換する ことが確認された。SB202190を用いたT.gondiiのステージ転換は MAPK p38αの阻害以外の作用によるものであるか、MAPK p38 αの阻害に加えて何らかの作用が必要であると考えられる。こ れらの結果から、宿主細胞のMAPK p38α活性の欠如や低下が T.gondiiのブラディゾイトへのステージ転換における最終的な引 き金ではないことが明らかとなった。

C-27

ASKA法を用いたトキソプラズマ原虫CDPK1薬剤標的

妥当性評価

○ 杉  達 紀、 加 藤 健 太 郎、 小 林 郷 介、 竹 前  等、 Haiyan Gong、黒川 瞳、Frances Recuenco、堀本泰介、 明石博臣(東大 農・獣医微生物) 【背景】プロテインキナーゼ(以下PK)は遺伝子の翻訳後修飾等 の細胞機能の調節の根幹を担っている。癌をはじめとする疾患に おいてPKをターゲットとした薬剤が開発されていることから、阻 害剤ライブラリーの充実など、PKを薬剤標的とする疾患における 開発環境が整っている。原虫感染症においては、マラリア原虫や トキソプラズマ原虫の増殖に必須である宿主細胞への侵入・脱出 の過程においてキナーゼが重要な役割を果たすことが知られてい る。しかしながら、PKドメイン自体は非常に相同性の高いファミ リーであることから、副作用の無い薬剤の開発には、PKドメイン とそれ以外のドメインの両者に親和性のある化合物のデザインが 必要であり、その立体構造の解析が必要となる。そのため標的PK が薬剤標的としての妥当性を評価することが必要である。我々を 含む3つのグループが並行して、ASKA法という迅速かつ特異性の 高い遺伝子抑制法でカルシウム依存性PK1(CDPK1)の侵入への 関与を報告してきた。【目的・結果】CDPK1の薬剤標的としての 妥当性の評価を行うべく、トキソプラズマ感染マウスモデルにお いて、ASKA法によるCDPK1の機能抑制を行った。マウスPKの 解析に用いられるASKA法で、これまでに報告のある濃度での薬 剤投与では、感染マウスの生存期間に有意な差は見られなかった。 これは、トキソプラズマのCDPK1が作用する部位(原虫細胞質内) において十分量の薬剤が到達していないか、CDPK1がin vivoにお いては重要な役割が無いかのいずれかを示すものである。薬剤の 投与量および、原虫の投与法の条件を変えてこの点に対するさら なる解析を行っており、その結果も合わせてCDPK1の薬剤標的と しての妥当性について議論したい。

トキソプラズマ原虫の新規プロテインキナーゼの機能

解析

○加藤健太郎、小林郷介、杉 達紀、竹前 等、ゴン海燕、 黒川 瞳、明石博臣(東大院 獣医微生物学研究室) 我々は第144回本学会において、熱帯熱マラリア原虫において唯一 のカルシウム/ カルモジュリン依存性プロテインキナーゼである Plasmodium falciparum protein kinase 2 (PfPK2)がメロゾイ ドにおいて特異的に発現し、カルモジュリン阻害薬がそのリン酸 化活性とメロゾイドの赤血球侵入を抑制することを発表した。今 回トキソプラズマ原虫においてPfPK2の相同遺伝子を検索した結 果、catalytic domainとその前部約90アミノ酸配列について高い相 同性を示す遺伝子を発見した。このトキソプラズマ原虫の新規プ ロテインキナーゼ候補蛋白質についてその機能解析を行い、以下 の結果を得た。(i) 小麦胚芽無細胞蛋白合成系を用いてGST と融 合する形で発現、精製を行い、銀染色及び、Western blot にて、 他の蛋白質の混入がないことを確認した。(ii) 精製したGST 融合 蛋白質 を用いてin vitro kinase assayを行った結果、[γ-32P] ATP によって標識された。さらに、ホスファターゼ処理によって その標識が除去された。(iii) そのキナーゼ活性部位と推定されるア ミノ酸に変異を入れることで、その活性が欠損した。(iv) ところが、 このリン酸化活性は、Ca2+やカルモジュリン濃度に依存性が無かっ た。(v) トキソプラズマ原虫感染細胞中でその発現が確認された。 現在、トキソプラズマ原虫の宿主細胞感染時におけるこのプロテ インキナーゼの役割について解析中であり、その研究結果につい ても発表したい。

トキソプラズマ原虫のcAMP依存性プロテインキナー

ゼの機能解析

○黒川 瞳1、加藤健太郎1、首藤篤史2、小林郷介1、杉 達紀1 竹前 等1、ゴン海燕1、明石博臣11東大 農・獣医微生物、2 戸大 医学部) Toxoplasma gondiiはアピコンプレックス門に属する原虫であり、 人獣共通感染症としてヒトでは胎児や免疫不全患者に感染すると 重篤なトキソプラズマ症を引き起こす。一方、セリン/スレオニ ンキナーゼであるcAMP依存性プロテインキナーゼ (PKA) は同じ アピコンプレックス門のマラリア原虫において赤血球内での無性 生殖期に関与することが知られており、病態発現に関わる重要な 因子として、我々は第144回本学会においてその機能解析の結果 を発表した。今回はin vitroにおいてT. gondiiのPKAの性状を解 析すると共に、PKAがT. gondiiの増殖環において果たす役割を 解明することを目指した。PKAのcatalytic subunitであるPKA-C は、T. gondii RH株より抽出したtotal RNAを用いてRT-PCRに よりmRNAを増幅したのち、小麦胚芽無細胞タンパク質合成系に よりGST融合タンパク質として発現した。このPKA-Cについて自 己リン酸化能を持つことを確認し、PKA特異的阻害剤であるH89、 PKIに対する感受性をin vitroにおいて解析した。現在、in vivoに おいて上記の阻害剤存在下でT. gondiiの培養を行い、tachyzoite の増殖への影響を解析中であり、TgPKAのcatalytic subunitと regulatory subunitとの相互作用についての解析も行っている。

(9)

C-32

Neospora caninumブラディゾイト由来抗原による防御

能のマウスモデルにおける検討

○内田昌樹、池 和憲、羽多野優芳、赤塚 唯、永島琴美、 森田達志、今井壮一(日獣大 獣医寄生虫) 【背景・目的】ネオスポラ症を惹起するN. caninum原虫は中間 宿主体内で活発に増殖するタキゾイトと、シストを形成し緩やか な増殖を行うブラディゾイトの両ステージからなることが知られ ている。マウスモデルを使用した防御試験に関し、タキゾイト由 来抗原を用いた報告は多くあるが、ブラディゾイト由来抗原を用 いたものは少ない。今回既に報告のある4種に関連抗原1種を加え た5種のブラディゾイト抗原を用いた防御試験を行ったのでその 概要を報告する。【材料・方法】供試抗原はNcBAG1、NcBSR4、 NcMAG1、NcSAG4、さらにNcBSR4関連抗原であるp38を加えた 5種の大腸菌発現組換え体で、これら抗原にW/O型オイルアジュ バントを加えたものを免疫原とした。免疫はBALB/cマウスに3 週間隔で2回筋肉内接種によって行い、最終免疫より3週後にN. caninumを腹腔内に攻撃した。評価は、各抗原に対する抗体産生 能、および脳を主体とした各種臓器からのPCRによる原虫遺伝子 の検出によって行った。【結果・考察】各接種抗原に対する抗体は、 NcSAG4接種群を除いて何れもIgG1およびIgG2a抗体価の良好な上 昇を示した。脳からの原虫遺伝子の検出は、NcBAG1、NcBSR4、 P38接種群で40%、NcMAG1接種群で60%、NcSAG4接種群で80%、 そしてアジュバントおよび無処置対照群では何れも100%であった。 これの結果からブラディゾイト抗原を用いたワクチンは攻撃感染 に対してある一定の抑制効果をもたらすことが示唆された。また NcSAG4については更なる検討を行う予定である。

C-31

Neospora caninum中間宿主ステージ特異的発色原虫の

作出

○羽多野優芳、池 和憲、内田昌樹、赤塚 唯、永島琴美、 森田達志、今井壮一(日獣大 獣医寄生虫) 【背景と目的】犬科動物を終宿主とする偏性細胞内寄生性原虫N. caninumが引き起こすネオスポラ症は、垂直感染による牛の死・流 産ならびに子犬の筋・神経疾患が臨床上問題となる。この垂直感 染へ関与は、シスト内ブラディゾイトが活性化後にステージ変換 したタキゾイトであると考えられているが、シストと胎盤通過原 虫の因果関係を証明した報告はない。本研究の目的はこれら垂直 感染メカニズムを解明すべく蛍光蛋白を利用した中間宿主ステー ジ特異的発色原虫を作出することで虫体を可視化させ、上記研究 等における手技・時間等を簡略化することである。【材料と方法】 薬剤耐性マーカーとしてN. caninum由来dihydrofolate reductase (DHFR)遺伝子をT. gondii由来DHFR遺伝子配列を基にクロー ニングと塩基配列の決定を行った。さらにNcSAG1、NcSAG4の5’ UTRならびにNcMAG1の3’UTRのクローニングと塩基配列の決定 も同様に行った。N. caninumベクターの原虫への遺伝子導入はエ レクトポレーション法で行い、カラー選択は蛍光顕微鏡下で行った。 【結果と考察】タキゾイト発色には5’UTR (NcSAG1)-ORF (GFP) -3’UTR (NcMAG1)を、ブラディゾイト発色には5’UTR (NcSAG4) -ORF (tdTomato)-3’UTR (NcMAG1)を、そして薬剤耐性マー カーにはN. caninum由来DHFR遺伝子を各々用いて原虫ベクター を構築した。遺伝子導入した原虫においてはin vitroでの発色を確 認した。さらに蛍光発色原虫のin vivoでの検証も行う予定である。

Toxoplasma gondii のDnaK-TPRタ ン パ ク 質 はp23

コーシャペロンと相互作用する

○上野晃生1、George Dautu1、芳賀香織1、古林与志安2 五十嵐慎11帯畜大 原虫病研究センター、2帯畜大 基礎獣 医学) 【目的】T. gondiiはネコを最終宿主とし、ヒトを含むほぼ全ての 温血動物に寄生する人獣共通感染症である。中間宿主に寄生した 場合、タキゾイト(Tz)から、シスト形成能のあるブラディゾイト(Bz) へと形態変化し慢性化する。演者らは、Bz特異的に発現する遺伝 子産物が分化もしくはシスト構造維持に重要な役割を果たしてい ると考えており、Bz特異的に発現する機能不明遺伝子の解析を試 みている。DnaK-TPRタンパク質(ToxoDB ID, TGME49_002020) は、中央部分にDnaKドメイン、C末端側にタンパク質間相互作用 に関わるとの報告のあるtetratricopeptide repeat (TPR)を持つ推定 分子量84.7 kDaのタンパク質であり、他のタンパク質と相互作用し、 分子シャペロンとしての機能を有していると考えられる。演者ら はDnaK-TPRタンパク質と相互作用する分子の探索を通じ本遺伝 子の機能解析を試みた。【結果と総括】DnaK-TPRタンパク質をベ イトとし、酵母2ハイブリッド系によるライブラリースクリーニン グを行ったところ、p23 co-chaperone (Tgp23)をコードするクロー ンを得た。Co-IPとGSTプルダウンアッセイにおいてもTgp23との 相互作用が確認された。Echeverriaら(2010)は、Tgp23と相互作 用するタンパク質のinteractomeマップを報告しているが、DnaK- TPRタンパク質についての報告がなく、本研究で示したDnaK-TPRタンパク質と Tgp23の相互作用は新規のものであると考えら れる。他の生物においては、p23はHSP90と結合することが報告さ れており、DnaK-TPRタンパク質はp23-HSP90を介したBzステー ジでのタンパク質のシャペロニングに関与している可能性がある。

比較トランスクリプトームによるトキソプラズマス

テージ変換機構の解析

○山岸潤也1、上野晃生1、五十嵐慎1、若栗浩幸2、鈴木 穣2 玄 学南11帯畜大 原虫病研究センター、2東大院 新領域 創成科学研究科) 【目的】 トキソプラズマは、宿主・環境に応じてその形態を多様 に変化させることが知られている。この性質はヒトを含む多細胞 生物とは大きく異なる極めてユニークなものであることから、そ こに関与する分子機構はワクチンや薬剤の標的としても重要であ る。中でも我々は、潜伏感染の原因にもなる急増虫体(タキゾイ ト)・緩増虫体(ブラディゾイト)間のステージ変換に注目し、そ の形態変化の分子機構を、それぞれで特異的に転写される遺伝子 を同定することで明らかにすることを試みている。 【方法】 解析に用いたタイゾイトおよびブラディゾイトは共にヒ ト繊維芽細胞を用いて培養し、特にブラディゾイトはpH8.1処理に よる誘導をおこなった後、アラビックガムによる密度勾配遠心に より精製した。得られた精製サンプルから各200 mgのtotal RNA を精製した後、キャップ構造を特異的に認識する酵素(TAP)を 利用してRNA linkerを付与することでintactな転写産物の5’末端 (転写開始点)を含んだ状態でcDNAを合成し(oligo-capping法)、 これを直接次世代シークエンサーによって解析した(TSS-seq法)。 【結果】 タイゾイトからは340万、ブラディゾイトからは160万の 有効タグが得られ、それぞれ424遺伝子、759遺伝子が、タイゾイ トおよびブラディゾイト特異的に転写されることを明らかにした。 また、トキソプラズマにおける転写制御因子AP2ファミリー遺伝 子候補をin silicoスクリーニングによって選抜し、それらの発現特 性について解析した。さらに、ステージ特異的な転写制御に関与 することが期待されるDNA cis-elementの同定を試みた。

参照

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