平成 26 年に発生した食中毒事例における分離ウェルシュ菌の解析
微生物部門
Analysis of Clostridium perfringens isolated from a food poisoning case in 2014 Division of Microbiology
Abstract
In May 2014, a large-scale outbreak of food poisoning by Clostridium perfringens broke out through the delivery of box lunches. Enterotoxin-producing C. perfringens were isolated from 5 stool specimens of patients, 2 stool specimens of food-workers, and 5 food specimens（Keema Curry etc.）in remaining box lunches.All of these isolates had the higher susceptibility to kanamycin than almost all C.perfringens strains.In addition, all of the isolates were serotype TW1, and the pulsed-field gel electrophoresis （PFGE） patterns of them were high similar to each other. Therefore, we considered that this outbreak of food poisoning was caused by a single strain.
Key Word
Clostridium perfringens ウェルシュ菌，kanamycin カナマイシン，food poisoning 食中毒， pulsed-field gel electrophoresis（PFGE） パルスフィールドゲル電気泳動
1 はじめに ウェルシュ菌は，偏性嫌気性の芽胞形成菌であり，ヒ トや動物の腸管内，土壌等の自然環境に広く分布してい る。一部のウェルシュ菌は，エンテロトキシンを産生し， ヒトに腸炎を引き起こす。ウェルシュ菌による食中毒は， 加熱調理によって食品内部の酸素分圧が低くなりやすい 大量調理食品が原因となることが多く，一件当たりの患 者数が多い特徴を持つ(1）。 平成 26 年 5 月に本市で発生したウェルシュ菌による食 中毒は，患者数が 900 名に上った。患者らは共通して配 達弁当を喫食しており，喫食してから平均 13 時間後に腹 痛，下痢等の症状を呈していた。検査の結果，患者便， 調理従事者便及び弁当の一品であるキーマカレー等から， エンテロトキシン産生性ウェルシュ菌が分離された。原 因食品は，ウェルシュ菌の検出状況及び喫食状況の統計 処理によりキーマカレーと推定された。 ウェルシュ菌の分離培地には，通性嫌気性菌の発育を 抑制するため，抗生物質であるカナマイシンを含有する 培地が一般的に用いられている(2）。しかし，本事例にお いて病因物質となったエンテロトキシン産生株は，カナ マイシン含有の培地では検出できなかった。 そこで，本事例のエンテロトキシン産生株とその他の ウェルシュ菌株のカナマイシンに対する感受性の違いを 検討するため，感受性試験を行った。また，患者便，調 理従事者便及び原因食品と推定されたキーマカレー等か ら分離されたウェルシュ菌株の同一性を確認するため， 血清型別及びパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）を 実施したので報告する。 2 検査材料 本事例において当所に搬入された患者便 7 検体，調理 従事者便 17 検体，弁当に使用された食品 20 検体※（キー マカレー4 検体，その他食品 16 検体），調理従事者の手指 ふきとり 6 検体，施設のふきとり 15 検体の計 65 検体に ついて，ウェルシュ菌検査を実施した。 ※ 搬入された食品のうち，弁当4 個（開封品 3 個，未 開封品1 個）については可能な限り品目ごとに分けて 検体とした。 3 検査方法 (1) ウェルシュ菌の分離及び同定 増菌培養にはチオグリコレート培地（ベクトン・ ディッキンソン社製）を使用し，35℃18～48 時間培養 した。分離培養にはカナマイシン含有の CW 卵黄寒天 培地（日研生物医学研究所社製）及びカナマイシン不 含有の CW 卵黄寒天培地（日水製薬社製）を使用し， 35℃18～48 時間嫌気培養した。接種する試料は，必要 に応じ加熱処理（75℃又は 100℃10 分間）を行った。 分離培養後，レシチナーゼ反応陽性及び乳糖分解性の ウェルシュ菌様コロニーを釣菌し，生化学的性状試験 等により菌種の同定を行った。
(2) エンテロトキシン検査 エンテロトキシン産生性試験は，ウェルシュ菌株を 変法 DS 培地で 35℃18～48 時間培養した後の遠心上清 を試料とし，PET-RPLA「生研」（デンカ生研社製）を 用いた RPLA 法により行った。エンテロトキシン遺伝 子の有無は，ウェルシュ菌毒素遺伝子検出用 Primer Set CPE-1/2（タカラ社製）を用いた PCR 法により実 施した。 (3) カナマイシン感受性試験 E-test（シスメックス・ビオメリュー社製）を使用 し，カナマイシンの最小発育阻止濃度（MIC）を測定 した。操作方法は，使用説明書に従い，純培養したウェ ルシュ菌株をミューラーヒントンブイヨンでマク ファーランド濁度 1 に調製し，ブルセラ血液寒天培地 に塗布した。48 時間培養後の阻止円から MIC 値を判定 した。 (4) 血清型別 Hobbs の血清型別は，耐熱性 A 型ウェルシュ菌免疫 血清「生研」（デンカ生研社製）を使用した。TW 血清 型別は，東京都健康安全センターに検査を依頼した。 (5) パルスフィールドゲル電気泳動 BHI ブロス（ベクトン・ディッキンソン社製）で 35℃ 一夜嫌気培養後，培養液 200μl を 15,000rpm で 3 分 間遠心した。上清を除去後，150μl の精製水で懸濁し， 等量の 1% SeaKem Gold agarose（タカラ社製）を加え プラグを作製した。プラグは，1mg/ml Lysozyme，80 μg/ml Lysostaphin 添加 0.5M EDTA（pH8.0）溶液で 37℃1 時間処理後，1mg/ml Protenase K，1% N-Lauroyl sarcosine 添加 0.5M EDTA（pH8.0）溶液で 50℃2 時間 処理した。制限酵素は，SmaⅠ及び NruⅠを使用し，Sma Ⅰは 25℃，NruⅠは 37℃で 16～20 時間反応させた後， PFGE を行った。 4 結果 (1) ウェルシュ菌の分離 表 1 に示すとおり，エンテロトキシン産生性ウェル シュ菌は，患者便由来 5 株，調理従事者便由来 2 株， キーマカレー由来 4 株，その他の食品由来 1 株の計 12 株が分離された。また，エンテロトキシン非産生性 ウェルシュ菌は，患者便由来 4 株，調理従事者便由来 8 株，キーマカレー由来 1 株，その他の食品由来 3 株 の計 16 株が分離された。 (2) カナマイシン感受性試験 表 2 に示すとおり，本事例のエンテロトキシン非産 生株及び他事例のエンテロトキシン産生株に対する カナマイシンの MIC 値は，すべて 256μg/ml 以上で あった。一方，本事例のエンテロトキシン産生株は， MIC 値が 24 又は 32μg/ml と低い値を示した。 (3) 血清型別 表 3 に示すとおり，Hobbs 血清型別は，すべて型別 不能であった。エンテロトキシン産生株の TW 血清型 別は，すべて TW1 型で一致した。 表 1 分離ウェルシュ菌 検体の種類 検体数 エンテロトキシン産生株 エンテロトキシン非産生株 患者便 7 5 4 調理従事者便 17 2 8 手指拭き取り 6 0 0 器具拭き取り 15 0 0 キーマカレー 4 4 1 その他食品 16 1 3 合計 65 12 16 表 2 カナマイシン感受性試験 種類 検体の種類 供試菌株数 MIC値（μg/ml） 最小発育阻止濃度 患者便 5 24（1株），32（4株） 調理従事者便 2 32（2株） キーマカレー 4 24（3株），32（1株） その他食品 1 24（1株） 患者便 4 256以上 調理従事者便 8 256以上 キーマカレー 1 256以上 その他食品 3 256以上 患者便 1 256以上 調理従事者便 1 256以上 エンテロトキシン産生株 （本事例） エンテロトキシン非産生株 （本事例） エンテロトキシン産生株 （他事例）
表 3 血清型別試験 図 1 エンテロトキシン産生性ウェルシュ菌の PFGE パターン（左：SmaⅠ処理，右：NruⅠ処理） 1～ 5 ：患者便由来株 12 ：その他食品由来株 6 , 7 ：調理従事者便由来株 13 ,14 ：参考株（他事例のエンテロトキシン産生株） 8～11 ：キーマカレー由来株 M ：分子量マーカー（Salmonella Braenderup H9812） 図 2 エンテロトキシン非産生性ウェルシュ菌の PFGE パターン（左：SmaⅠ処理，右：NruⅠ処理） 1,5,11,12 ：患者便由来株 17 ：本事例のエンテロトキシン産生株 2,6,7,8,13,14,15,16 ：調理従事者便由来株 （図 1 の番号「1」に同じ） 3 ：キーマカレー由来株 M ：分子量マーカー 4,9,10 ：その他食品由来株 （Salmonella Braenderup H9812） 種類 検体の種類 供試菌株数 Hobbs型別 TW型別 患者便 5 UT TW 1 調理従事者便 2 UT TW 1 キーマカレー 4 UT TW 1 その他食品 1 UT TW 1 患者便 4 UT NT 調理従事者便 8 UT NT キーマカレー 1 UT NT その他食品 3 UT NT
UT：Untypable NT：Not typed エンテロトキシン産生株
エンテロトキシン非産生株
(4) パルスフィールドゲル電気泳動 エンテロトキシン産生株は，図 1 に示すとおり， 制限酵素 SmaⅠ処理において 1 株（患者便由来）が 1 バンドの相違を示したが，その他はすべて同一パ ターンであった。また，制限酵素 NruⅠ処理では，3 バンドの相違が 1 株（患者便由来），2 バンドの相違 が 1 株（食品由来）確認されたが，その他はすべて 同一パターンであった。対象とした他事例のエンテ ロトキシン産生株の PFGE パターンは，いずれの制限 酵素処理においても，本事例のものとは大きく異 なっていた。 一方，エンテロトキシン非産生株は，図 2 に示す とおり，制限酵素 SmaⅠ処理の PFGE パターンによっ て，4 株（すべて同一パターン）のグループ A，6 株 （1 株が 3 バンド相違）のグループ B 及び全くパター ンの異なる 7 株に分けられた。 また，制限酵素 NruⅠ処理においても同様に，4 株（2 株が 1 バンド相違）のグループ A，6 株（すべ て同一パターン）のグループ B 及びパターンの異な る 7 株に分けられた。なお，いずれの制限酵素処理 においても，エンテロトキシン非産生株の PFGE パ ターンは，エンテロトキシン産生株のものとは大き く異なっていた。 5 考察 今回の事例では，当初からエンテロトキシン非産生性 のウェルシュ菌は分離されていたが，エンテロトキシン 産生株を分離することに苦慮した。培地上におけるエン テロトキシン産生株の発育の有無を確認するため，カナ マイシン含有の培地上から colony sweeps 法により集菌 した試料を PCR に供試したところ，エンテロトキシン遺 伝子は検出されなかった。しかし，分離培地をカナマイ シン不含の培地に替え，同様に PCR を行ったところ，エ ンテロトキシン遺伝子が複数検体から検出された。 そこで，カナマイシンに対する感受性試験を行ったと ころ，本事例のエンテロトキシン産生株は，カナマイシ ンの MIC 値が 24 又は 32μg/ml と低く，一般的なウェル シュ菌（MIC 値 256μg/ml 以上）に比べカナマイシンに 対する感受性が高いことが確認された。また，このエン テロトキシン産生株がカナマイシン含有の培地では検 出できなかったことは，本株に対するカナマイシンの MIC 値が，培地中のカナマイシン濃度 200μg/ml より低 かったことから説明できる。 本事例のエンテロトキシン産生株は，すべてカナマイ シンに対する感受性が高いという特徴を有し，血清型別 は TW1 型で一致した。PFGE 解析においても，3 株（図 1 の検体番号 1,4,9）で 3 バンド以下の相違があったもの の概ね PFGE パターンは一致したことから，分離された エンテロトキシン産生株は単一株から派生したものと 考えられた。このことは，4 検体すべてからエンテロト キシン産生株が分離されたキーマカレーが原因食品で あることを肯定する結果となった。 なお，キーマカレー以外の食品 1 検体からもエンテロ トキシン産生株が分離されたが，原因としては，盛り付 けの区画が同じであったために，キーマカレーが付着し たことが推察された。 また，エンテロトキシン非産生株には，PFGE パター ンが概ね一致したグループが 2 つ存在した。いずれのグ ループの菌株も，その由来が患者便，調理従事者便及び 食品にまたがっていたことから，エンテロトキシン産生 株と同様に食品を介して患者に広がった可能性が考え られる。しかし，食品汚染が原材料由来によるものか調 理従事者を介したものか詳細は不明である。 なお，エンテロトキシン非産生株の PFGE パターンは， エンテロトキシン産生株と大きく異なっていたことか ら，すべて別株由来と考えられた。 今回のようなカナマイシンに感受性を示すウェル シュ菌による食中毒事例は，過去にも報告されてお り(3)(4)，病因物質を検出するうえで参考にした。非定型 的な性状を示す細菌による食中毒事例は，多くを経験す ることができないため，過去の報告事例等を把握し，通 常の方法で検出できない際にも対応できる体制を整え ておく必要があると考える。 6 参考文献 (1) 食中毒予防必携 第 3 版 社団法人 日本食品衛 生協会(2013.1.31) (2) 衛生試験法・注解 2010 日本薬学会編 (3) IASR Vol.29 p.216-217:2008 年 8 月号 ウェル シュ菌食中毒 (4) 門間千枝，下島優香子，小西典子，尾畑浩魅，石 崎直人，仲真晶子，甲斐明美，柳川義勢，山田澄 夫：カナマイシンに感受性を示すウェルシュ菌に よる食中毒事例と分離菌株の性状.日本食品微生 物学会雑誌 25(2)，76-82,2008 謝辞 ウェルシュ菌の TW 血清型別を実施していただきまし た東京都健康安全センター微生物部食品微生物研究科 食中毒研究室の先生方に深謝いたします。
食品中フェノール系酸化防止剤の検出方法に関する検討 山下毅，西川清文，髙尾恭平，篠﨑史義，伴埜行則
Analysis of Phenolic antioxidants in foods by LC-PDA, LC-FL, and LC-MS/MS
Takeshi YAMASHITA, Kiyofumi NISHIKAWA, Kyohei TAKAO, Fumiyoshi SHINOZAKI, Yukinori BANNO Abstract
Determination of propyl gallate (PG), butylated hydroxyanisole (BHA)，and butylated hydroxytoluene (BHT) in foods by means of LC-Photo Diode Array (PDA) and Fluorescence (FL) were examined. As a result, using PDA and FL detectors simultaneously was effective for improving quantitativity of Phenolic antioxidants. In some cases, however, qualitative analysis method by more specific detector was required. Therefore analysis method of Phenolic
antioxidants in foods by means of LC-MS/MS was developed. Phenolic antioxidants were extracted from olive oil with acetonitrile. The solution was put in a freezer at -20 °C for over one hour and was passed through a filter paper to remove an oil content. The extract was purified with C18 cartridge column and Phenolic antioxidants in the solution were determined using LC-MS/MS. The result of spiked and recovery test showed that the method had sufficient spontaneous repeatability and could be used as qualitative analysis.
Key Words
フェノール系酸化防止剤 Phenolic antioxidants， 液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析計 LC-MS/MS，没食子酸プロピ ル propyl gallate (PG)，ブチルヒドロキシアニソール butylated hydroxyanisole (BHA)，ブチルヒドロキシトルエン butylated hydroxytoluene (BHT) 1 はじめに フェノール系酸化防止剤はラジカル捕捉剤として，不飽和 脂肪酸の連鎖的酸化反応を停止させることから，食品の劣化 を防ぐ目的で世界的に使用されてきた1)。日本ではこのうち没 食子酸プロピル(PG)，ブチルヒドロキシアニソール(BHA)，ジ ブチルヒドロキシトルエン(BHT)が食品添加物として認めら れており，使用基準が定められている。当研究所においては 通知法2)に則り，紫外部吸収検出器付高速液体クロマトグラフ を用いて検査を実施しているが，平成 26 年度に取り扱ったオ リーブオイルからフェノール系酸化防止剤の定量を妨害する ピークが検出された。通常このようなピークは LC 条件を変更 することにより分離を試みるが，検査対象物以外のピークが 多い場合，最適な条件の探索に時間を要する。そこで今回， LC 条件の変更に加えて，蛍光検出器(FL)を使用し，フォトダ イオードアレイ検出器(PDA)との比較を行った。また，確認試 験として液体クロマトグラフ-タンデム型質量分析計 (LC-MS/MS)による分析法についても検討し，一定の知見を得 たので，これを報告する。 2 方法 (1) 試料 京都市内に流通していたオリーブオイルを使用した。 (2) 試薬及び標準品 蒸留水（ナカライテスク），メタノール（関東化学），ア セトニトリル（関東化学），2 -プロパノール（ナカライテ スク），エタノール（純正化学）は液体クロマトグラフ用を， 酢酸（ナカライテスク），無水硫酸ナトリウム（ナカライテ スク），酢酸アンモニウム（和光純薬工業）は特級を用いた。 オクタデシルシリル化シリカゲル（ODS）ミニカラムとして Bond Elut C18 500 mg (Agilent Technologies)を使用した。 各標準品について，PG は和光純薬工業，BHA，BHT は関東化 学から購入したものを使用した。 また，アセトニトリル，2 -プロパノール及びエタノール を 2 : 1 : 1 の割合で混和した液を抽出混液とし，これを -20℃で冷却したものを冷抽出混液とした。 (3) 装置 LC : Nexera (島津製作所) PDA : SPD-M20A (島津製作所) FL : RF-10AXL (島津製作所) MS/MS : LCMS8030 (島津製作所) (4)試験溶液の調製 ア 定量法 試料 5.0 g を採り，抽出混液 50 ml を加え，3 分間ホ モジナイズした。これを 4,200 rpm で 5 分間遠心分離を
インターフェイス電圧 プリカーサイオン 定量イオン 定性イオン kV m/z m/z m/z PG - -3.5 211.1 124.1 169.1 BHA - -3.5 179.2 164.1 149.2 BHT - -5.0 219.1 203.1 163.1 ESI 表1 LC-MS/MS検出条件 行った後，-20 ℃の冷凍庫で 1 時間以上冷却した。冷却 後，素早くナスフラスコ内へろ過した。次いで，残さ及 びろ紙を冷抽出混液 15 ml で洗浄し，洗液はろ液に合わ せた。これを 40 ℃以下で 1 ml 程度まで減圧濃縮し，抽 出混液を用いて 5 ml に定容し 0.2 μm メンブランフィ ルターに通じたものを試験溶液とした。 イ LC-MS/MS 確認法 試料 5.0 g を採り，アセトニトリル 50 ml を加え，3 分間ホモジナイズした。これを 4,200 rpm で 5 分間遠心 分離を行った後，-20 ℃の冷凍庫で1 時間以上冷却した。 冷却後，素早くナスフラスコ内へろ過した。次いで，残 さ及びろ紙を冷アセトニトリル 15 ml で洗浄し，洗液は ろ液に合わせた。これを 40 ℃以下で 4 ml 程度まで減圧 濃縮し，予めアセトニトリル 5 ml によりコンディショ ニングを行った ODS ミニカラムに通じ流出液を採った。 次いでアセトニトリル 5 ml を ODS ミニカラムに通じ， 流出液は先のものと合わせた。これを，アセトニトリル を用いて 10 ml に定容し 0.2 μm メンブランフィルター に通じたものを抽出液とした。またアセトニトリルによ り希釈を行ったものを LC-MS/MS 試験溶液とした。 (5) LC-PDA 及び LC-FL 分析条件
カラム：Shim-pack HR-ODS (3.0 mm i.d. × 150 mm, 3 μm) カラム温度：40 ℃
移動相：A 液 5 %酢酸水
B 液 アセトニトリル：メタノール（1：1） グラジエント条件：B 液 40 %(0 min) → 90 %(15 min) → 90 %(25 min) → 100 %(25.01 min) → 100 %(55 min) → 40 %(55.01 min) → 40 %(65 min) 流速：0.3 ml/min 注入量：10 μL PDA：280 nm FL： PG Ex 275 nm Em 365 nm BHA Ex 290 nm Em 320 nm BHT Ex 276 nm Em 304 nm (6) LC-MS/MS 分析条件
カラム：CAPCELL PAK C18 HR-ODS (2.0 mm i.d. × 150 mm,
5 μm) カラム温度：40 ℃ 移動相：BHA, BHT A 液 10 mM 酢酸アンモニウム水 B 液 アセトニトリル PG A 液 0.25 %酢酸水 B 液 アセトニトリル グラジエント条件：B 液 10 %(0 min) → 90 %(15 min) → 90 %(25 min) → 10 %(25.01 min) → 10 %(35 min) 流速：0.2 ml/min 注入量：10 μL ヒートブロック温度：250 ℃ 脱溶媒管温度：250 ℃ ドライングガス流量：15 L/min MS/MS：表 1 のとおり 3 結果及び考察 (1) PDA および FL による検出比較 通知法で定められている280 nm における吸収を測定した 際，定量を妨害するピークの観察されたオリーブオイル及 び 10 μg/ml 標準溶液 (0.01 g/kg 相当)について FL によ る測定も行い，比較した（図 1）。FL による検出は PG，BHA， BHT，それぞれの極大励起波長，極大蛍光波長の文献値3)， 4)を用いて測定を行った。その結果 BHA 及び BHT において， 分析対象物以外のピークが定量に及ぼす影響は大幅に改善 された（図 1B 中下段）。一方，PG については，定量を妨害 するピークが見られ，改善には至らなかった（図 1B 上段）。 そこで，PG について定量を妨害するピークを分離するた め B 液濃度 20 % 及び 30 %でイソクラティック分析を行い PDA 及び FL により検出した（図 2）。その結果，B 液濃度が 20 %の PDA において定量を妨害するピークを分離すること ができたが，それ以外では標準物質保持時間と類似した位 置にピークが見られた。検体種によっては図2 の様にPDA， FL両方で標準物質保持時間と類似した位置にピークを持つ ものもあり，こうした場合，別の検出方法による確認試験 が有用であると考えられた。そこで，さらなる定性精度を 求め，既報5), 6)を参考にLC-MS/MS による確認試験を行った。
PDA FL MS / MS PG 96.9 ± 3.4 99.7 ± 3.6 96.9 ± 3.4 BHA 99.4 ± 3.0 94.7 ± 2.9 94.4 ± 1.9 BHT 82.4 ± 3.4 80.8 ± 3.1 68.3 ± 2.3 表2 LC-MS/MS確認法添加回収試験の結果 酸化防止剤 回収率（平均値 ± RSD % , n = 5） ×10/×1 ×50/×5 ×100/×10 ×200/×20 ×500/×50 PG 1.159 1.186 1.165 1.086 1.046 BHA 1.068 1.124 1.146 1.162 1.166 BHT 0.782 0.889 0.878 0.895 0.950 PGは0.25 μg/ml，BHA及びBHTは2.5 μg/ml標準溶液を用いてマトリックス添加標準を作製した 表3 LC-MS/MS確認法の試験溶液希釈率の違いによるマトリックス効果の比較 マトリックス効果 （希釈倍率：PG / BHA & BHT ） (2) LC-MS/MS による確認法の検討 ア LC-MS/MS による検出条件の検討 フローインジェクション分析の結果，それぞれの LC-MS/MS 検出条件は表 1 のとおりとなった。ESI ネガテ ィブモードによる検出のため，A 液に 10 mM 酢酸アンモ ニウム水，B 液にアセトニトリルを用いて検討したとこ ろ，BHA 及び BHT は良好なピークが得られたが，PG はテ ーリングし，ピーク形状が悪かった。このため，PG につ いては A 液を 0.25 %酢酸水とし検討を行った結果，ピー ク形状の改善が見られたため，これを採用した。検量線 について，PG は 0.1 - 0.5， BHA 及び BHT は 1 - 5 μg/ml の範囲で作成したところ，それぞれにおいて R2 ≧ 0.99 と良好な直線性が得られた。 イ 抽出・精製法の検討及び添加回収試験 定量法（公定法）ではアセトニトリル，2-プロパノー ル及びエタノールの混液を抽出溶媒として用いている が，本検討では機器に対する負荷を軽減するため，比較 的油分が溶解しにくいとされるアセトニトリルを使用 し，冷凍による脱脂後，ODS ミニカラムによる精製を追 加して行った。この LC-MS/MS 確認法について，オリー ブオイルを用いて添加回収試験 (n = 5)を実施し，PDA， FL，MS/MS それぞれにより回収率を確認した。PDA およ び FL での測定には抽出液を， MS/MS での測定にはそれ ぞれの分析対象物質のピーク面積が検量線の範囲内に 収まるようにアセトニトリルで希釈した LC-MS/MS 試験 溶液を用いた。その結果，回収率および RSD(%)は定性試 験としては良好な値が得られた（表 2）。また，オリーブ オイル空試験溶液を用いてマトリックス添加標準を作 製し，溶媒希釈標準に対するレスポンス比（面積）をマ トリックス効果とし評価した。本試験を確認試験として 使用する場合，試験溶液の希釈倍率は様々となることが 想定されるため，空試験溶液を PG については 10，50， 100，200，500 倍，BHA 及び BHT については 1，5，10， 20，50 倍に希釈したものをそれぞれ用い，比較した（PG： 0.025 μg/ml，BHA，BHT：0.25 μg/ml）。その結果，お おむね 1.000 前後の値をとり，マトリックス効果に関し ても，定性結果に大きな影響を与えるものではないと考 えられた（表 3）。また，標準溶液及びオリーブオイル空 試験抽出液の SRM クロマトグラムを比較したところ，定 量を妨害するピークは見られなかった（図 3）。 以上の検討により，S/N 比や添加回収率の精度は良好で定量 を妨害するピークも見られないことから，本試験法による定 性に問題はないと考えられた。 4 まとめ フェノール系酸化防止剤の分析方法においては，検体種に よって精製が不十分となり，分析対象物以外のピークが多数 検出されることがある。こうしたピークへの対策として PDA， FL 検出の併用が有効であることを確認した。また，確認試験 法についても検討し，その結果，LC-MS/MS による定性が可能 であることが示唆された。今後は，油脂以外の検体にも本試 験法が適応可能かどうか確認を行う予定である。 5 引用文献 (1) 寺尾純二：合成抗菌剤，日本農芸化学会誌 62(2) p174 -177 (1988) (2) 平成 12 年 3 月 30 日付衛化第 15 号別添「第 2 版 食品
中の食品添加物分析法」
(3) 大石充男 他：蛍光検出 HPLC による食品中 5 種の酸化 防止剤の同時分析法，食品衛生学雑誌 43(2) p104 – 109 (2002)
(4) Vivienne V. Yankah, et al：Quantitative Determination of Butylated Hydroxyanisole, Butylated Hydroxytoluene, and tert-Butyl Hydroquinone in Oils, Foods, and Biological Fluids by High-Performance
Liquid Chromatography with Fluorometric Detection, Lipids 33(2) p1139 - 1145(1998)
(5) Sumiko Tsuji, et al：Determination and Confirmation of Five Phenolic Antioxidants in Foods by LC/MS and GC/ MS, J.Food Hyg.Soc.Japan 46(3) p63-71(2005) (6) 脇山ひとみ，赤木浩一：LC-MS/MS による食品中のフェノ
ール系酸化防止剤の分析，福岡県保健環境研究所年報 39, p95–97 (2014)
マイクロウェーブ分解装置を用いた家庭用品中の有機水銀化合物の分析の検討
○柴田 さよ ，伴 創一郎 ，伴埜 行則
Analysis of Organic Mercury in Household Products by Microwave Digestion Sayo SHIBATA, Soichiro BAN ,Yukinori BANNO
Abstract
A microwave assisted digestion procedures for determination of organic mercury in household products has been examined. 100mg of sample material was weighed out in the teflon vessel, and 7ml of nitric acid and 1ml of hydrogen peroxide were added. The sample was digested under high pressure and high temperature using a microwave digestion system.
Then the digested sample was diluted with distilled water and analyzed by cold vapor atomic absorption spectrometry. Recovery studies of Phenylmercuric acetate (n=3) were performed on six kinds of household products : sanitary shorts , diaper cover , glue , shoe polish , wax , paint. The recovery rates for elements examined ranged from 90.3% to 104.5% and the RSD ranged between 1.0% and 3.3% .The determination limits was 0.05 mg/kg.
The data proved that the digestion technique using microwave is reliable in analysis of the organic mercury compound in household products.
Key words
microwave マイクロウェーブ，organic mercury 有機水銀化合物，household products 家庭用品
１ はじめに 家庭用品に含まれる有機水銀化合物は，有害物質を含有す る家庭用品の規制に関する法律1)により「おしめ，おしめカ バー，靴下などの繊維製品，家庭用接着剤，塗料，ワックス， 靴墨及び靴クリーム中からバックグランド値としての 1μ g/g を超えて検出されてはならない」という基準が設けられ ている。 当研究所においても家庭用品中の有機水銀化合物の検査 を公定法2)により行ってきたが，公定法は，還流，抽出に多 大な時間がかかる，毒性が強い四塩化炭素を使用するなどの 問題点があった。そのため，当研究所では家庭用品中の有機 水銀化合物の検査法として前処理に酸循環分解装置を用い る方法3)を検討してきたが，酸の使用量が多く有機物の分解 に時間を要した。 そこで，効率のよい前処理法としてマイクロウェーブ分解 装置を用いる方法を検討した。マイクロウェーブ分解装置は， テフロン製密閉容器を用いてマイクロ波を照射し高圧，高温 で試料の有機物を分解する装置であり，迅速で効率のよい前 処理が可能である。また，密封系で分解を行うため，水銀等 の揮発性の高い元素への適用も可能である。 今回，家庭用品中の有機水銀化合物についてマイクロ ウェーブ分解条件を検討し，添加回収試験を行い分析法を検 証したので報告する。 ２ 方法 ⑴ 装置 マイクロウェーブ分解装置：
Milestone 社製 ETHOS PLUS 還元気化水銀分析装置：平沼産業製 HG-200 ⑵ 試料 繊維製品(おしめカバー，衛生パンツ)，ワックス， 靴クリーム，スティックのり，塗料(ペンキ） ⑶ 試薬 酢酸フェニル水銀標準品：東京化成工業製 水銀標準原液(水銀分析用)：関東化学製 硝酸(有害金属測定用)：関東化学製 過酸化水素(原子吸光分析用)：関東化学製 ⑷ 試験溶液の調製 試料 0.1g をテフロン製容器に量り採り，硝酸 7ml 及び過 酸化水素 1ml を添加して 1 時間放置後，表 1 または表 2 の 条件で，マイクロウェーブ分解装置で分解した。冷却後， 分解後の溶液を精製水で 50ml に定容した。定容後の溶液 を精製水で2倍あるいは4倍に希釈して全量を100mlとし，
これを試験溶液として水銀分析装置(還元気化原子吸光光 度法)で測定した(図 1)。 水銀量が 5, 25，50, 100, 200 ng になるように水銀標 準原液を量り採り, 100ml に定容し検量線用水銀標準液と した。 ３ 結果及び考察 ⑴ マイクロウェーブ分解条件の検討 今回検討した試料のうち，おしめカバー，スティックの りについては，表 1 の 190℃の分解条件で無色透明な溶液 が得られ，50ml 定容後の液を 2 倍希釈し試験溶液としても 水銀分析計で測定可能であった。しかし，衛生パンツ，靴 クリーム，ワックス，塗料については，表 1 の分解条件で は試料の分解状態にバラツキがあり，溶液に濁りや浮遊物 が見られる場合があり，分解が不十分であると考えられた。 また，靴クリーム，ワックス及び塗料では，水銀分析計に よる測定時のバブリングの際の発泡が激しく，エラーが起 こり測定が困難な試料があった。 そこで，表 2 の 220℃の分解条件を検討したところ，濁 りや浮遊物がなく，透明な溶液が得られ，分解が十分であ ると考えられた。また，50ml 定容後の液を 4 倍希釈し試験 溶液にすることで，バブリングの際の発泡を抑えることが でき，測定が可能となった。 ⑵ 添加回収試験 おしめカバー，衛生パンツ，ワックス，靴クリーム，ス ティックのり，塗料(ペンキ）の 6 種類の家庭用品試料に ついて，試料 0.1g に 0.1μg の酢酸フェニル水銀を添加し マイクロウェーブ法で添加回収試験(n=3)を行った。その 結果を表 3 に示す。また，平成 13 年から平成 21 年の間に， 当研究所で公定法により行われた有機水銀化合物の検査 における，おしめ, ワックス, 靴クリーム, でんぷんのり, 衛生パンツの5種類の家庭用品試料についての添加回収試 験の結果を表 4 に示す。 公定法による平均回収率は 69.3％-82.3％の範囲であっ たが，マイクロウェーブ法による平均回収率は 90.3％ -104.5％の範囲であり，いずれの検体でも公定法より良好 な結果が得られた。また，結果のバラツキもマイクロ ウェーブ法のほうが小さかった。 公定法は，試料のサンプリングから水銀分析計による測 定終了まで検査日数にして 2 日，作業時間として 15 時間 程度要したのに対して，マイクロウェーブ法では，5 時間 程度で分析が可能であり，分析時間を大幅に縮減すること ができた。
step
time/min power /w
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2
3
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表1 Microwave 分解プログラム 190℃
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表2 Microwave 分解プログラム 220℃
0.1g sample HNO37mL H2O21mL Microwave分解(表1または表2) １時間放置 50mL定容 2倍希釈または4倍希釈して水銀分析計測定 図1 Microwave法の分析手順 0.1g sample HNO37mL H2O21mL Microwave分解(表1または表2) １時間放置 50mL定容 2倍希釈または4倍希釈して水銀分析計測定 0.1g sample HNO37mL H2O21mL Microwave分解(表1または表2) １時間放置 50mL定容 2倍希釈または4倍希釈して水銀分析計測定 図1 Microwave法の分析手順４ まとめ マイクロウェーブ分解装置を用いた家庭用品中の有機水 銀化合物の分析について検討した結果，良好な回収率が得ら れ，酸の使用量や分析時間を大幅に縮減することができた。 マイクロウェーブで分解できる試料量には限りがあり樹脂 の場合 0.5g 程度が限度であるが，今回使用した還元気化水 銀分析装置は水銀絶対量として 5.0ng まで検出可能であり, 試料中濃度に換算して基準値レベル(1μg/g)の 1/20 に相当 する濃度(0.05μg/g)まで測定できるため，家庭用品中の有 機水銀化合物の検査法として十分な測定感度を有している と考えられた。 今回検討対象とした家庭用品試料のワックス，塗料の成分 はアクリル樹脂であり表 2 の条件で分析可能であったが，マ イクロウェーブ分解の場合，アクリロニトリル-ブタジエン-スチレン共重合体(ABS)やポリスチレン(PS)など，分子構造 内にベンゼン環をもつ樹脂については，硝酸単独による条件 では分解が困難であり，硝酸＋硫酸によるマイクロウェーブ 分解あるいは，硝酸によるマイクロウェーブ分解後，ビー カー上で過塩素酸を追加し加熱することで分解可能となる と報告されている。4) このような樹脂については，今回検討した硝酸＋過酸化水 素による分解条件では分解が困難であると考えられるため， 使用する酸の条件やマイクロウェーブ分解条件について検 討が必要であると考えられた。 公定法では試料中の有機水銀のみを抽出・分析するのに対 し, マイクロウェーブ分解装置を用いた前処理法は，試料中 に存在する有機水銀を全て無機水銀に分解し, もとある無 機水銀との合計量（総水銀）を分析している。よって本法で 得られた値は，公定法の値に比べて高くなると考えられるた め,この値が基準値以下であれば, その試料に含まれる有機 水銀量は基準以下と判定できる。 検体名 検体数 平均回収率% RSD％ おしめカバー 3 93.9 3.3 スティックのり 3 90.3 2.8 衛生パンツ 3 99.8 1.9 靴クリーム 3 99.8 2.9 ワックス 3 104.5 1.1 塗料（ペンキ） 3 96.3 1.0 表3 Microwave法の添加回収率 検体名 検体数 平均回収率% RSD％ おしめ 11 76.7 23.7 でんぷんのり 2 79.2 17.6 衛生パンツ 2 71.8 3.5 靴クリーム 2 69.3 20.6 ワックス 2 82.3 3.0 表4 公定法の添加回収率 ５ 文献 1) 厚生省令：第 34 号, 昭和 49 年. 保健衛生安全基準 2) 家庭用品規制関係実務便覧：昭和 50 年 5 月 30 日 3) 京都市衛生環境研究所年報 No78(2012)p89-91 4) 新潟県工業技術総合研究所工業技術研究報告書 No40(2010)p52-54
○冨田 陽子，並河 幹夫，塩見 哲生（北区役所保健部），伴埜 行則 市販の冷凍カニクリームコロッケと冷凍餃子を添加回収試験用試料として，農薬 269 成分を 2 つのグループに分 け，「食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライン」に従い妥当性評価を行った。通知試験 法に QuEChERS 法を取り入れた方法により調整した試験溶液で添加回収試験を行った。試料採取量を農産物の半量 にすること，遠心分離後の試料を一夜冷凍すること及び精製ミニカラムへの負荷量を半量にすることにより，精製 効率を高め，試験溶液のマトリクス成分（脂質等）を減少させた。その結果，ガイドラインの目標値を満たした成 分数は冷凍カニクリームコロッケで 200 成分，冷凍餃子で 208 成分であった。 １ はじめに 平成 25 年 12 月，異臭がすると苦情が寄せられた冷凍食 品から有機リン系農薬であるマラチオンが検出されるとい う事件があった。また，有機リン系農薬が混入した中国産 冷凍餃子（平成 19 年 12 月）や中国産冷凍インゲン（平成 20 年 10 月）による健康被害も記憶に新しい。これらの事 件を背景として，京都市においても冷凍食品中の残留農薬 検査に対するニーズが高まっている。 一方，食品中に残留する農薬の濃度が食品規格に適合し ていることの判定を目的として試験を実施する場合，厚生 労働省通知「食品中に残留する農薬等に関する試験法の妥 当性評価ガイドラインについて（平成 19 年 11 月 15 日付け 食安発第 1115001 号）」により，試験法の妥当性について， 適用しようとする食品毎に評価する必要がある。 以上のことから，2 種類の冷凍食品について残留農薬試 験法の妥当性評価を行い，若干の知見を得たので，今後の 参考に報告する。 ２ 方法 （１）試料 市販の冷凍カニクリームコロッケ及び冷凍餃子を添加 回収試験用試料とした。 （２）対象農薬 通知法のうち主に LC/MS による農薬等の一斉試験法Ⅰ （農産物）を対象とした農薬 269 成分を 2 つのグループ に分け，試験を行った。 （３）標準物質 関東化学（株）農薬混合標準液 53，54，56，57，58 及 び各農薬の標準品 （４）装置 高速液体クロマトグラフ／質量分析計 ProminenceUFLC／LCMS8030 （（株）島津製作所） （５）試験溶液の調製 通知試験法に QuEChERS 法を取り入れた図１の方法に より，試験溶液の調製を行った。 図１ 試験溶液の調製法 （６）添加回収試験 1g あたり各農薬 0.01μg または 0.1μg となるよう標準 溶液を添加した試料を 1 日 1 回（2 併行），5 日間試験し た。 均質化した試料 5g ┣精製水 5ml を添加 アセトニトリル 10ml を加える ホモジナイズ 1 分 ┣塩化ナトリウム 1g クエン酸 3 ナトリウム 2 水和物 1g を加える クエン酸 2 ナトリウム 1.5 水和物 0.5g 無水硫酸マグネシウム 4g 手で振とう 1 分 ┃ 遠心分離 4000rpm 5 分 ┃ -20℃で一夜冷凍（約 15～18 時間） ┃ アセトニトリル層 0.5ml を分取 ┃ 固相 C18-1g：精製 ┣アセトニトリル 15ml で溶出し 5ml まで濃縮 固相 EnvicarbⅡ/PSA-500mg/500mg：精製 ┣アセトニトリル：トルエン(3：1) 20ml で溶出 窒素気流下で蒸発乾固し，メタノールで 1.0ml に定容 （試料 0.25g/ml）
濃度 （μg/g） 真度 （％） 併行精度 （RSD%） 室内精度 （RSD%） 0.01 70～120 25＞ 30＞ 0.1 70～120 15＞ 20＞ （７）マトリクス添加標準溶液の調製 各ブランク試料から得た試験溶液をそれぞれ分取し， 窒素気流下で溶媒を除去した後，添加回収濃度（2.5ng/ml 及び 25ng/ml）に相当する混合標準液で溶解し，マトリク ス添加標準溶液とした。 （６）検量線 検量線は 0，0.5，1，2.5，10，25，50ng/ml の混合標 準液を用いて作成した。 保持時間及びピーク形状を確認し，必要により手動で 波形処理を行ったのち，ピーク面積を用いるマトリクス 検量線法により定量した。 ３ 結果 （１）選択性 検量線測定に用いた 2.5ng/ml の混合標準液のデータを 用いて，各農薬成分の定量イオンピークがS/N比 10 以上 であること，また，感度やピーク形状が不良でないこと の確認を行った。その結果，オリザリン，テフルベンズ ロン，デメトン－S メチルスルホキシド（オキシデメトン メチル）及びフルミオキサジンの 4 成分を妥当性評価の 対象から外した。 次に，ブランク試料に定量を妨害するピークがないこ とを確認した。妨害ピークを認める場合は，妨害ピーク 面積と 2.5ng/ml の混合標準液から得られるピーク面積を 比較し，1/3 未満であることを確認した。その結果，冷凍 カニクリームコロッケ及び冷凍餃子のブランク試料に妨 害ピークを認めたヘキサコナゾールとジニコナゾールの 2 成分を妥当性評価の対象から除外した。 （２）真度（回収率）及び精度 各試料においてマトリクス添加標準溶液濃度に対する 添加回収試験溶液濃度の比を求め，評価を行った結果， 前述の目標値を満たした成分数は下記のとおりである。 食品名 目標値を満たした成分数 ／試験した成分数 冷凍カニクリームコロッケ 200／263（76.0%） 冷凍餃子 208／263（79.1%） 今回実施した 2 種の冷凍食品の妥当性評価試験では，約 200 成分の農薬についてガイドラインの目標値を満たすこ とができた。 揚げ物や餃子等の加工食品は農産物と比較すると脂質を 多く含み（カニクリームコロッケ約 13.9％，餃子約 10.4％）， 水分が少ない。そこで最終試験溶液のマトリクス成分（脂 質等）を減らす対策として，試験溶液調製時の試料採取量 を農産物の半量にし，かわりに同量の精製水を加えた。さ らに，遠心分離後の試料を一夜冷凍することでアセトニト リル層と試料層の間に脂肪層を形成させ，脂質の除去を容 易にした。また，精製ミニカラムへの負荷量を半量に減ら したことにより，精製効率を高めた。これらの結果，測定 中の感度変化が見られなかったことから，マトリクス成分 による検出器の汚れや分析カラムへの吸着による影響を緩 和できたのではないかと思われる。しかし，下記の表のと おり，溶媒標準とマトリクス添加標準での真度を比較する と，溶媒標準で定量した際にイオン化阻害を主とする影響 が見られた。 食品名 標準 (25ng/ml) 真度 (%) >50 50 70 70 120 120 150 <150 冷凍カニク リームコロッケ 溶媒 41 44 177 1 0 マトリクス 30 7 225 1 0 冷凍餃子 溶媒 40 15 202 5 1 マトリクス 34 4 224 1 0 このことから，今回検討した試験溶液の調製法では，一部 農薬の試験に対してマトリクス成分の除去が十分ではなか った可能性が高い。加工食品は多種多様の原材料から様々 な調理工程を経て製造されているため，マトリクス成分は 複雑である。今回検討した食品よりも脂質を多く含む食品 については，さらにマトリクス成分を除去する対策を考え る必要がある他，大幅に食品成分が異なる加工食品を試験 する場合には，別の対策が必要になるかもしれない。 加工食品は個別の基準が設定された場合を除き，原則一 律基準が適用される。今回行った添加回収試験の低濃度 （2.5ng/ml）が基準値に値することから，この濃度におけ る機器の安定した感度と検査の迅速性を十分確保し，正確 性を備えた検査を行えるよう今後も工夫を重ねていきたい。
高速液体クロマトグラフタンデム型質量分析計を使用したゴルフ場排水中農薬の一斉分析法の検討～その 1 環境部門 ○中川和子，小林博恭，西村仁志，宮尻久美（京都府保健環境研究所），水谷聡之 要約 ゴルフ場で使用される農薬 58 項目の一斉分析を高速液体クロマトグラフタンデム型質量分析計高速液体によっておこない，IDL （装置検出限界）と 9 種類の抽出固相カラムで添加回収実験をおこなった。そのうち 54 項目は，回収率の結果 72%～120%であり， 一斉分析可能であった。保持時間の短いアシュラム，カーベンダジウム（以下 MBC），メソミルは，ピーク形状不良のため定量値を 正しく測定できていない恐れがあるため，ピーク形状の改善とその回収率を求める必要性がある。さらに，クロルフルアズロンは回 収率不良のためこの一斉分析には適用できなかった。 Key Words ゴルフ場農薬，高速液体クロマトグラフタンデム質量分析計， 一斉分析 1 はじめに ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁を未然に防止す るため，「ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止に 係る暫定指導指針」1）が定められているが，その一部が平成 25 年 6 月に改正された。それによると，指針の別表中の農薬 項目数が変更になったこと，農薬取締法に基づく水質汚濁に 係る農薬登録保留基準が定められている農薬は，その値の 10 倍値を指針値とすること，分析には高速液体クロマトグラフ タンデム型質量分析計（以下 LC-MS/MS）の使用が認められて いることが挙げられる。そこで，平成 11 年度から 25 年度の 間に市内ゴルフ場で使用された頻度の高い農薬を対象として， LC-MS/MS を適用するための基礎的検討とスクリーニング的 に使用可能な一斉分析法の検討を行った。 2 実験方法 ⑴ 試料 市内の河川水またはゴルフ場内の河川水。 ⑵ 対象農薬 平成 11 年度から 25 年度までで使用頻度の高い農薬で LC-MS/MS 一斉分析に適しているものを対象とし表 1 に示し た。 ⑶ 試薬及び標準品 ア 各農薬標準品 林純薬工業㈱製，和光純薬工業㈱製，関東化学㈱製， Riedel-deHäen 製並びに，Dr.Ehrenstorfer Gmbh 製の残 留農薬試験用を用いた。表 1 に示した各農薬標準品をそ れぞれの易溶な有機溶媒で溶解し 50～1000μg/ml の標 準原液を作成した。そして，アセトニトリルで希釈して 10μg/ml の混合標準溶液として用いた。 イ 抽出用固相カラム ｾｯﾌﾟﾊﾟｯｸ RⓇﾌﾟﾗｽ PS-2 ｶｰﾄﾞｯﾘｯｼﾞ(日本ｳｫｰﾀｰｽﾞ㈱製) ｵｱｼｽⓇHLB ﾌﾟﾗｽｴｸｽﾄﾗｸｼｮﾝｶｰﾄﾞﾘｯｼﾞ(日本ｳｫｰﾀｰｽﾞ㈱製) ｲﾅｰﾄｾｯﾌ TM ｽﾘﾑ-J PLS-3（ｼﾞｰｴﾙｻｲｴﾝｽ社製） ｵｰﾄﾌﾟﾚｯﾌﾟⓇPS@Liq（昭和電工㈱製） ﾉﾋﾞｱｽ RP-SG1L(日立ﾊｲﾃｸｻｲｴﾝｽ㈱製) ｴﾝﾋﾞｸﾛﾑ-P (ｽﾍﾟﾙｺ製) ｲﾅｰﾄｾｯﾌﾟ TM miniRP1 (ｼﾞｰｴﾙｻｲｴﾝｽ社製) ｲﾅｰﾄｾｯﾌﾟ TM ｽﾘﾑ-J RP-C18 (ｼﾞｰｴﾙｻｲｴﾝｽ社製) ｴﾑﾎﾟｱﾃﾞｨｽｸ EZ ｶｰﾄﾞﾘｯｼﾞ RP-1（住友 3M㈱製） ウ 純水 ピュアラボコーラス（エルガ製）超純水製造装 置で製造したものを用いた。 エ アセトニトリル 関東化学（濃縮 5000）又は LC/MS 用 を用いた。 オ アセトン及びメタノール 関東化学（濃縮 5000） カ 0.1％ギ酸 ギ酸（和光純薬工業㈱製 LC-MS 用）1ml を 純水 1000ml に溶かしたもの。 キ DISMIC－13HP 0.45μmPTFE フィルター（アドバン テック製 LC 試験液調製用フィルター） ⑷ 装置 ア 高速液体クロマトグラフ㈱島津製作所製 LC-20AD 型ポ ンプ 2 台 同 CBM-20A 型システムコントローラー 同 NexeraSIL-30AC オートサンプラー 同 CTO-20AC 型カラムオーブン 同 DGU-20A デガッサー 同タンデム型四重極質量分析計：LC-MS-8050 により構成されたものを使用した。
イ 固相抽出装置 コントローラー部 日本ｳｫｰﾀｰｽﾞ㈱ Sep-Pak コンセン トレーターSPC-10-C 同ポンプ部 Sep-Pak コンセントレータープラス 5 連 により構成されたものを使用した。 ⑸ HPLC 測定条件 ガードカラム：ノムラディベロシル XG-C30-S （径 1.5mm ×長さ 10mm 粒子径 3μm） ノムラ化学㈱製 分析カラム：ノムラディベロシル XG-C30M-3（径 2.0mm ×長さ 150mm 粒子径 3μm） ノムラ化学㈱製 カラム温度：40℃ 移動相及びグラジェント溶出条件 A 液: 0.1％含ギ酸水溶液 B 液: 0.1％含有アセトニトリル B 液 10％の初期状態 1 分保持後,15 分で 100％まで B 液濃度を上げ 5 分保持する。 流速：0.2ml/分 注入量：5μl 定量は外部標準法または内部標準法でおこなった。 ⑹ 質量分析計条件 表 2 に示したとおり。 表 2 質量分析計条件 イオン化モード ESI ネブライザーガス流量 3L/min ドライングガス流量 10L/min ヒーティングガス流量 10L/min インターフェース温度 300℃ ヒートブロック温度 400℃ DL温度 250℃ ⑺ 対象成分の測定条件 測定対象農薬ごとに LC-MS/MS-MRM 分析条件を最適化し てプリカーサーイオン，プロダクトイオン，コリンジョン エネルギーを決定し定量イオン，確認イオンを設定した （表 1）。 3 分析方法 試験溶液の調整方法 市内河川水 1L に対し混合標準液 10μg/ml を 0.1ml 添加し （試験溶液濃度 1ppb 報告下限値），1 時間撹拌後，9 種の類固 相カラム（各ｎ=5）において，図 1 に示す方法で，前処理を 行った。 4 結果と考察 ⑴ IDL（装置検出限界）の算出及び検量線 化学物質環境実態調査実施の手引（平成 20 年度）2）に従っ て，表 1 に記載の農薬を含む 1ppb または 10ppb 標準溶液 を調整後，各濃度 5μl を 7 回測定し IDL（装置検出限界値） を算出した。（表 1） 検量線は 1ppb から 100ppb の範囲でレベルを 5 段階作成し 測定をおこなった。相関関数は R2＝0.995 以上を示した。 pH3.5に調製した試験溶液100ml 固相にロード (10ml/分) 洗浄(2ml/分)超純水10mlで洗浄 固相を予め ①ｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ5ml ②超純水5mlで洗浄 脱水 溶出(1ml/分)ﾊﾞｯｸﾌﾗｯｼｭ法でｱｾﾄﾆﾄﾘﾙ溶出 LC-MS/MSへ 0.45μmﾌｨﾙﾀｰでろ過 内部標準物質 10μg/mlを 5μl添加 *溶出使用溶媒量は5ml使用 （EZｶｰﾄﾞﾘｯｼﾞのみ10ml） 図 1 試験溶液調製フロー ⑵ 添加回収試験 表 3 に示すように，クロルフルアズロンは，すべての固 相で回収率が 60％以下であったため，今回の一斉分析法を 適用することは難しいことがわかった。 他 54 農薬成分は，セップパック PS-2，オアシス HLB，ノ ビアス RP-SG1L を使用した回収率は 72%～120%となり良好 な結果であった。 ⑶ 分析法の問題点 保持時間の短いアシュラム，MBC，メソミルのピーク形状 が悪く（図 2），特にアシュラムの回収率が 120％を超えて いる等，定量値を正しく測定できていない可能性がある。 原因として，試験溶液の組成（100％アセトニトリル）と 移動相の初期組成（90％のギ酸水溶液-10％アセトニトリ ル）が異なるため，クロマトグラフィー開始直後の溶離状 況が変化することにより，保持時間の短い化合物が影響を 受けると考えられる。試験溶液の組成と初期移動相濃度を 合わせれば解決するが，操作が煩雑になること，濃縮によ る農薬成分の損失を避けたいため，他の分析方法でピーク
3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 6.00 min 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 (x10,000) 2:ｱｼｭﾗﾑ 231.05>155. 95(+) CE: -9.0 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 6.00 6.25 6.50 min 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 (x10,000) 4:ﾒｿﾐﾙ 163.00>87.95(+) CE: -9.0 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 5.25 5.50 5.75 6.00 6.25 min -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75 5.00 (x100,000)3:MBC 191.75>160.05(+) CE: -17.0 アシュラム Tｆ＝0.642 カーベンダジウム Tｆ＝1.654 メソミル Tｆ＝0.757 形状改善の検討が必要である。 5 まとめ LC-MS/MS でゴルフ場使用対象農薬の最適化を行い，IDL 及 び 9 種の抽出カラムを使用し試験溶液中の農薬の添加回収実 験を行った。 ⑴ IDL は絶対量として 0.4pg から 18.9pg であった。 ⑵ クロルフルアズロン以外の農薬は，セップパック PS-2， オアシス HLB，ノビアス RP-SG1L を使用した回収実験の結 果は 72%～120%となった。 ⑶ 保持時間の短いアシュラム，MBC，メソミルは，ピーク 形状が悪く，正しい定量値を示していない可能性があるた め，他の条件を検討する必要性がある。 6 参考文献 1）ゴルフ場で使用される農薬による水質汚濁の防止に係る 暫定指導指針（環水土第 777 号 環境庁水質保全局長通知） 2）化学物質環境実態調査実施の手引（平成 20 年度） 図２ ピーク形状不良クロマト（標準 100ppb）
1 ｱｼｭﾗﾑ 252.2 pos 231.05>155.95 231.05>92.05 -9 -24 1.6 2 MBC 191.19 pos 191.75>160.05 191.75>132.05 -17 -23 0.7 3 ﾒｿﾐﾙ 162.21 pos 163.00>87.95 163.00>105.95 -9 -18 4.7 4 ﾁｱﾒﾄｷｻﾑ 291.7 pos 291.95>211.00 291.95>181.00 -12 -15 2.8 5 ｸﾛﾁｱﾆｼﾞﾝ 249.68 pos 249.95>169.00 249.95>112.95 -12 -13 2.0 6 ｲﾐﾀﾞｸﾛﾌﾟﾘﾄﾞ 255.7 pos 256.00>175.05 256.00>208.85 -18 -13 2.4 7 ﾁｵﾌｧﾈｰﾄﾒﾁﾙ* 342.4 pos 342.95>151.00 342.95>310.95 -20 -18 0.8 8 ﾒﾄｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 381.36 pos 381.95>167.00 381.95>141.10 -16 -20 2.1 9 ﾁｵｼﾞｶﾙﾌﾞ 354.5 pos 354.95>88.00 354.95>107.90 -21 -18 3.0 10 ﾘﾑｽﾙﾌﾛﾝ 431.4 pos 431.95>182.05 431.95>325.00 -22 -22 3.2 11 2.4-D 221.0 neg 218.95>160.85 218.95>150.90 15 23 18.9 12 ﾄﾘﾌﾛｷｼｽﾙﾌﾛﾝ 459.3 pos 437.95>182.00 437.95>139.00 -19 -13 2.4 13 ﾄﾘﾎﾘﾝ 436.96 pos 387.80>212.95 387.80>98.10 -20 -15 3.6 14 ﾄﾘｸﾛﾋﾟﾙ 256.47 pos 255.90>209.85 255.90>145.90 -13 -13 11.7 15 ﾄﾘﾈｷｻﾊﾟｯｸｽｴﾁﾙ 252.26 pos 253.05>69.05 253.05>207.00 -21 -13 0.8 16 ﾌﾗｻﾞｽﾙﾌﾛﾝ 407.3 pos 407.95>181.95 407.95>82.90 -20 -12 3.3 17 ﾒｺﾌﾟﾛｯﾌﾟ 214.65 neg 213.00>140.95 213.00>105.00 15 15 1.9 18 ﾖｰﾄﾞｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 529.25 pos 507.90>167.05 507.90>141.05 -20 -20 3.4 19 ｲﾏｽﾞｽﾙﾌﾛﾝ 412.8 pos 412.95>156.05 412.95>152.95 -20 -12 3.5 20 ｸﾛﾗﾝﾆﾄﾘﾙﾌﾟﾛｰﾙ 483.15 pos 483.90>452.75 483.90>285.75 -17 -14 2.0 21 ﾋﾟｽﾋﾟﾘﾊﾞｯｸﾅﾄﾘｳﾑ 452.35 pos 453.05>297.00 453.05>179.05 -19 -11 7.0 22 ﾌﾙﾙﾌﾟﾙﾐﾄﾞｰﾙ 312.29 pos 313.00>269.95 313.00>268.90 -23 -16 2.3 23 ﾋﾟﾗｿﾞｽﾙﾌﾛﾝｴﾁﾙ 414.4 pos 415.00>181.95 415.00>82.95 -19 -16 3.1 24 ｼﾌﾟﾛｺﾅｿﾞｰﾙ 291.78 pos 292.00>70.00 292.00>124.90 -21 -15 2.6 25 ﾊﾛｽﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 434.8 pos 434.95>182.00 434.95>139.00 -20 -13 3.2 26 ｱｿﾞｷｼｽﾄﾛﾋﾞﾝ 403.39 pos 404.00>372.00 404.00>344.00 -14 -21 4.4 27 ｴﾄｷｼｽﾙﾌﾛﾝ 398.39 pos 398.95>260.90 398.95>217.90 -15 -15 4.9 28 シメコナゾール 293.41 pos 294.05>70.05 294.05>135.10 -21 -15 2.6 29 ｼｸﾛｽﾙﾌｧﾑﾛﾝ 422 pos 422.00>260.90 422.00>217.90 -16 -30 5.5 30 ｶﾌｪﾝｽﾃﾛｰﾙ 350.9 pos 351.10>100.05 351.10>72.05 -9 -18 6.0 31 ﾃﾌﾞｺﾅｿﾞｰﾙ 307.8 pos 308.05>70.00 308.05>125.00 -21 -12 3.3 32 ﾃﾌﾞﾌｪﾉｼﾞﾄﾞ 352.48 pos 353.15>133.00 353.15>297.05 -20 -13 6.0 33 ﾋﾞﾃﾙﾀﾉｰﾙ 337.42 pos 338.05>269.10 338.05>99.10 -9 -13 3.2 34 ﾌﾙﾍﾞﾝｼﾞｱﾐﾄﾞ 682.39 pos 407.85>273.80 407.85>255.75 -18 -15 4.6 35 ﾍﾞﾝﾁｵﾋﾟﾗﾄﾞ 359.41 pos 360.00>177.00 360.00>275.90 -32 -14 3.8 36 ｲﾝﾄﾞｷｻｶﾙﾌﾞ 527.83 pos 528.00>202.90 528.00>249.00 -37 -20 3.1 37 ﾄﾘﾌﾛｷｼｽﾄﾛﾋﾞﾝ 408.4 pos 409.05>186.00 409.05>145.00 -19 -16 6.0 38 ﾃﾌﾙﾍﾞﾝｽﾞﾛﾝ 381.1 pos 380.85>141.00 380.85>158.00 -30 -11 1.6 39 ﾌﾟﾛｼﾞｱﾐﾝ 350.3 pos 351.05>249.95 351.05>266.95 -27 -18 2.2 40 ｵｷｼｶﾙﾎﾞｷｼﾝ 267.3 pos 267.95>174.90 267.95>43.00 -13 -31 2.0 41 ﾎﾗﾑｽﾙﾌﾛﾝ 452.44 pos 453.15>182.05 453.15>83.05 -20 -52 2.7 42 ﾌｪﾘﾑｿﾞﾝ(Z E) 254.33 pos 256.05>91.05 256.05>133.05 -32 -20 0.7 43 ﾌﾛﾗｽﾗﾑ 359.28 pos 359.95>129.05 359.95>109.05 -22 -53 1.1 44 ｼﾉｽﾙﾌﾛﾝ 413.41 pos 414.00>183.05 414.00>157.10 -16 -20 1.8 45 ｶﾌｪﾝｽﾃﾛｰﾙ代謝物 251.3 pos 252.05>119.10 252.05>105.05 -20 -30 4.4 46 ﾋﾟﾘﾍﾞﾝｶﾙﾌﾞ 361.8 pos 362.05>239.05 362.05>207.00 -17 -27 2.3 47 ﾊﾛｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ転移体 327.72 pos 327.90>296.00 327.90>197.05 -16 -31 1.3 48 ﾌﾙｾﾄｽﾙﾌﾛﾝ 487.46 pos 488.15>156.05 488.15>272.95 -21 -24 3.9 49 ﾋﾟﾘﾐﾉﾊﾞｯｸﾒﾁﾙ-Z 361.4 pos 361.90>330.15 361.90>244.15 -15 -26 3.3 50 ﾋﾟﾘﾐﾉﾊﾞｯｸﾒﾁﾙ-E 361.4 pos 361.90>330.15 303.00>124.95 -15 5.2 51 ﾒﾁﾙﾀﾞｲﾑﾛﾝ 268.36 pos 269.05>151.05 269.05>134.05 -12 -21 1.7 52 ｲｿｷｻﾍﾞﾝ 332.4 pos 332.95>165.05 332.95>107.00 -20 -55 3.6 53 ﾒﾄｷｼﾌｪﾉｼﾞﾄﾞ 368.47 pos 369.10>149.10 369.10>313.10 -18 -8 3.7 54 ｵﾘｻﾞﾘﾝ 346.4 pos 347.05>288.10 347.05>305.05 -17 -13 16.4 55 ﾄﾘｱｼﾞﾌﾗﾑ 333.4 pos 333.90>192.15 333.90>314.20 -24 -18 2.2 56 ｼｱｿﾞﾌｧﾐﾄﾞ 324.8 pos 325.00>108.00 325.00>261.10 -13 -9 5.6 57 ｵｷｻｼﾞｸﾛﾒﾎﾝ 376.3 pos 375.95>190.10 375.95>161.10 -14 -26 0.5 58 ｸﾛﾙﾌﾙｱｽﾞﾛﾝ 540.65 pos 541.85>385.05 541.85>157.95 -23 -20 2.6 IS ﾄﾘｽ-p-ﾘﾝ酸ｸﾚｿﾞｰﾙｄ21 pos 390.15>174.05 -47 表1 分析対象農薬と各農薬の測定条件
No. 農薬名 分子量 極性 定量ｲｵﾝ：m/z 参照ｲｵﾝ： m/z 定量CE 確認CE IDL （pg)
平均 回収率 ± S.D. 平均 回収率 ± S.D. 平均 回収率 ± S.D. 平均 回収率 ± S.D. 平均 回収率± S.D. 1 ｱｼｭﾗﾑ** 102.0 ± 3.55 129.1 ± 3.55 136.9 ± 2.90 119.5 ± 12.7 122.4 ± 3.40 2 MBC** - - - -3 ﾒｿﾐﾙ** 108.2 ± 3.96 111.6 ± 1.45 111.4 ± 1.25 101.3 ± 9.01 87.0 ± 1.68 4 ﾁｱﾒﾄｷｻﾑ 107.8 ± 3.87 108.7 ± 1.37 110.4 ± 1.68 106.2 ± 10.99 103.0 ± 1.58 5 ｸﾛﾁｱﾆｼﾞﾝ 114.0 ± 3.61 117.3 ± 1.20 118.4 ± 1.98 113.0 ± 11.28 105.1 ± 1.55 6 ｲﾐﾀﾞｸﾛﾌﾟﾘﾄﾞ 108.8 ± 3.85 112.6 ± 1.32 112.4 ± 1.01 107.0 ± 10.37 98.9 ± 0.73 7ﾁｵﾌｧﾈｰﾄﾒﾁﾙ *（MBC換算） 73.3 ± 3.46 114.5 ± 14.6 68.2 ± 1.96 60.2 ± 5.87 76.8 ± 15.01 ﾁｵﾌｧﾈｰﾄﾒﾁﾙ 25.7 ± 3.10 66.8 ± 25.8 15.7 ± 1.65 6.1 ± 0.09 49.5 ± 19.9 8 ﾒﾄｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 103.8 ± 3.36 105.4 ± 1.41 104.3 ± 1.26 98.3 ± 9.82 101.5 ± 1.70 9 ﾁｵｼﾞｶﾙﾌﾞ 109.2 ± 3.85 105.4 ± 1.52 108.9 ± 0.44 102.7 ± 10.85 103.2 ± 1.67 10 ﾘﾑｽﾙﾌﾛﾝ 90.2 ± 3.09 95.5 ± 1.97 89.3 ± 0.77 75.3 ± 7.85 72.0 ± 2.03 11 2.4-D 98.8 ± 9.02 91.5 ± 8.91 40.0 ± 6.04 91.4 ± 12.08 97.7 ± 4.28 12 ﾄﾘﾌﾛｷｼｽﾙﾌﾛﾝ 108.5 ± 3.31 105.4 ± 1.71 110.4 ± 1.81 103.8 ± 10.28 103.5 ± 1.76 13 ﾄﾘﾎﾘﾝ 103.7 ± 4.15 104.7 ± 1.43 99.8 ± 3.30 99.4 ± 10.90 99.7 ± 2.21 14 ﾄﾘｸﾛﾋﾟﾙ 108.5 ± 4.79 107.1 ± 5.48 48.2 ± 5.14 106.8 ± 12.66 101.4 ± 3.52 15 ﾄﾘﾈｷｻﾊﾟｯｸｽｴﾁﾙ 105.5 ± 3.64 106.0 ± 3.21 109.2 ± 3.89 101.3 ± 10.75 98.1 ± 2.23 16 ﾌﾗｻﾞｽﾙﾌﾛﾝ 101.3 ± 4.57 103.4 ± 1.75 101.8 ± 2.89 94.7 ± 9.11 91.6 ± 1.24 17 ﾒｺﾌﾟﾛｯﾌﾟ 97.7 ± 7.65 96.4 ± 3.15 82.0 ± 6.97 95.0 ± 12.42 95.4 ± 5.24 18 ﾖｰﾄﾞｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 111.9 ± 4.26 113.2 ± 0.88 116.6 ± 1.89 110.9 ± 11.26 106.7 ± 1.12 19 ｲﾏｽﾞｽﾙﾌﾛﾝ 106.9 ± 3.63 105.3 ± 1.96 106.7 ± 2.71 103.6 ± 10.10 97.4 ± 2.23 20 ｸﾛﾗﾝﾆﾄﾘﾙﾌﾟﾛｰﾙ 112.2 ± 2.67 112.4 ± 0.80 114.4 ± 2.63 109.9 ± 9.97 107.8 ± 1.93 21 ﾋﾟｽﾋﾟﾘﾊﾞｯｸﾅﾄﾘｳﾑ 107.3 ± 2.79 107.7 ± 4.62 101.7 ± 0.96 108.1 ± 11.10 96.5 ± 2.35 22 ﾌﾙﾙﾌﾟﾙﾐﾄﾞｰﾙ 105.1 ± 2.97 102.8 ± 1.97 103.2 ± 0.97 101.1 ± 10.23 90.1 ± 1.50 23 ﾋﾟﾗｿﾞｽﾙﾌﾛﾝｴﾁﾙ 106.4 ± 4.02 101.9 ± 1.78 107.6 ± 1.42 101.7 ± 8.79 100.2 ± 1.22 24 ｼﾌﾟﾛｺﾅｿﾞｰﾙ 104.6 ± 3.38 106.4 ± 1.45 107.0 ± 0.76 103.7 ± 9.48 101.2 ± 1.67 25 ﾊﾛｽﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 110.9 ± 4.97 109.4 ± 3.40 112.5 ± 2.28 107.4 ± 10.65 105.1 ± 1.32 26 ｱｿﾞｷｼｽﾄﾛﾋﾞﾝ 105.6 ± 3.96 100.6 ± 1.86 114.0 ± 2.37 106.7 ± 10.17 109.8 ± 1.94 27 ｴﾄｷｼｽﾙﾌﾛﾝ 106.1 ± 4.78 102.2 ± 1.59 108.3 ± 1.60 102.6 ± 10.38 104.1 ± 2.52 28 ｼﾒｺﾅｿﾞｰﾙ 106.3 ± 4.15 102.7 ± 2.62 104.3 ± 2.65 99.7 ± 9.41 93.7 ± 7.75 29 ｼｸﾛｽﾙﾌｧﾑﾛﾝ 99.1 ± 3.94 92.2 ± 2.04 104.8 ± 1.98 97.4 ± 11.28 90.8 ± 1.16 30 ｶﾌｪﾝｽﾃﾛｰﾙ 102.0 ± 4.03 94.1 ± 1.03 106.6 ± 2.62 99.8 ± 9.95 95.7 ± 0.78 31 ﾃﾌﾞｺﾅｿﾞｰﾙ 109.0 ± 3.67 99.7 ± 1.33 105.8 ± 0.95 100.7 ± 9.83 98.8 ± 1.96 32 ﾃﾌﾞﾌｪﾉｼﾞﾄﾞ 113.0 ± 4.27 110.9 ± 1.82 109.3 ± 9.17 105.5 ± 9.39 103.8 ± 1.48 33 ﾋﾞﾃﾙﾀﾉｰﾙ 94.7 ± 3.29 87.3 ± 1.24 100.7 ± 2.18 96.9 ± 9.52 97.3 ± 2.18 34 ﾌﾙﾍﾞﾝｼﾞｱﾐﾄﾞ 89.3 ± 3.65 86.1 ± 1.68 93.0 ± 1.81 87.8 ± 8.53 90.3 ± 0.88 35 ﾍﾞﾝﾁｵﾋﾟﾗﾄﾞ 100.6 ± 3.52 92.7 ± 1.36 104.6 ± 0.63 99.2 ± 9.71 106.7 ± 1.56 36 ｲﾝﾄﾞｷｻｶﾙﾌﾞ 76.1 ± 3.38 72.4 ± 0.59 81.3 ± 1.35 78.3 ± 8.25 85.7 ± 0.89 37 ﾄﾘﾌﾛｷｼｽﾄﾛﾋﾞﾝ 86.3 ± 3.46 81.1 ± 1.74 87.4 ± 3.26 82.3 ± 8.21 95.3 ± 1.26 38 ﾃﾌﾙﾍﾞﾝｽﾞﾛﾝ 87.0 ± 2.85 79.9 ± 0.93 89.5 ± 1.65 83.0 ± 8.89 90.0 ± 1.45 39 ﾌﾟﾛｼﾞｱﾐﾝ 86.7 ± 3.89 79.0 ± 0.62 89.6 ± 2.41 80.1 ± 8.49 84.9 ± 1.68 40 ｵｷｼｶﾙﾎﾞｷｼﾝ 103.8 ± 1.64 101.4 ± 1.63 123.2 ± 5.73 120.2 ± 6.42 106.8 ± 2.82 41 ﾎﾗﾑｽﾙﾌﾛﾝ 120.2 ± 3.54 108.1 ± 1.95 115.1 ± 4.95 108.6 ± 7.23 117.8 ± 2.44 42 ﾌｪﾘﾑｿﾞﾝ(Z E) 116.4 ± 1.65 111.3 ± 2.86 93.4 ± 12.79 81.6 ± 1.65 119.2 ± 2.43 43 ﾌﾛﾗｽﾗﾑ 117.1 ± 2.80 111.7 ± 2.60 128.2 ± 3.29 121.2 ± 2.88 117.7 ± 2.14 44 ｼﾉｽﾙﾌﾛﾝ 120.1 ± 3.30 113.5 ± 3.00 115.5 ± 3.47 109.6 ± 3.21 118.1 ± 2.34 45 ｶﾌｪﾝｽﾃﾛｰﾙ代謝物 - - - ± -46 ﾋﾟﾘﾍﾞﾝｶﾙﾌﾞ 105.7 ± 3.24 96.6 ± 2.30 107.7 ± 4.21 97.9 ± 3.82 107.2 ± 2.56 47 ﾊﾛｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ転移体 - - - ± -48 ﾌﾙｾﾄｽﾙﾌﾛﾝ 104.4 ± 2.76 91.6 ± 2.52 121.1 ± 3.35 116.3 ± 2.24 106.6 ± 3.27 49 ﾋﾟﾘﾐﾉﾊﾞｯｸﾒﾁﾙ-Z 118.9 ± 4.93 109.0 ± 1.15 108.9 ± 5.32 101.8 ± 4.31 117.5 ± 2.40 50 ﾋﾟﾘﾐﾉﾊﾞｯｸﾒﾁﾙ-E 109.0 ± 4.78 97.7 ± 1.10 108.7 ± 3.75 102.1 ± 3.33 106.7 ± 2.04 51 ﾒﾁﾙﾀﾞｲﾑﾛﾝ 112.5 ± 3.34 107.7 ± 2.04 106.7 ± 5.69 94.5 ± 3.41 115.2 ± 1.66 52 ｲｿｷｻﾍﾞﾝ 121.5 ± 3.15 112.2 ± 2.60 111.2 ± 3.33 102.7 ± 4.63 121.2 ± 1.50 53 ﾒﾄｷｼﾌｪﾉｼﾞﾄﾞ 109.9 ± 3.29 103.4 ± 2.62 117.8 ± 2.64 110.5 ± 6.14 109.2 ± 1.25 54 ｵﾘｻﾞﾘﾝ 111.6 ± 5.25 98.8 ± 3.36 104.6 ± 4.74 104.5 ± 7.73 109.0 ± 3.87 55 ﾄﾘｱｼﾞﾌﾗﾑ 102.1 ± 3.88 90.2 ± 1.90 98.2 ± 3.19 87.4 ± 2.58 108.6 ± 1.73 56 ｼｱｿﾞﾌｧﾐﾄﾞ 111.9 ± 2.93 100.1 ± 2.30 112.4 ± 6.75 100.7 ± 2.99 111.2 ± 2.28 57 ｵｷｻｼﾞｸﾛﾒﾎﾝ 100.1 ± 2.88 89.7 ± 0.78 90.3 ± 6.55 100.2 ± 42.09 103.8 ± 2.20 58 ｸﾛﾙﾌﾙｱｽﾞﾛﾝ 55.9 ± 2.08 59.6 ± 1.79 60.7 ± 1.53 58.1 ± 3.06 55.9 ± 1.79 IS ﾄﾘｽ-p-ﾘﾝ酸ｸﾚｿﾞｰﾙ d21 最少 25.7 59.6 15.7 6.1 49.5 最大 121.5 117.3 128.2 121.2 121.2 *MBCを代謝物として換算 **ピーク形状不良のため参考値とする ％ ％ ％ ｵｰﾄﾌﾟﾚｯﾌﾟⓇ PS@Liq （昭和電工㈱製） ｾｯﾌﾟﾊﾟｯｸRⓇﾌﾟﾗｽ PS-2ｶｰﾄﾞｯﾘｯｼﾞ (日本ｳｫｰﾀｰｽﾞ㈱製) ｵｱｼｽⓇHLBﾌﾟﾗｽｴｸｽﾄﾗｸ ｼｮﾝｶｰﾄﾞﾘｯｼﾞ (日本ｳｫｰﾀｰｽﾞ㈱製) ｲﾅｰﾄｾｯﾌTMｽﾘﾑ-J PLS-3 (ｼﾞｰｴﾙｻｲｴﾝｽ社製) 表3 各固相における添加回収結果 ﾉﾋﾞｱｽRP-SG1L (日立ﾊｲﾃｸｻｲｴﾝｽ㈱製) ％ ％
1 ｱｼｭﾗﾑ** 2 MBC** 3 ﾒｿﾐﾙ** 4 ﾁｱﾒﾄｷｻﾑ 5 ｸﾛﾁｱﾆｼﾞﾝ 6 ｲﾐﾀﾞｸﾛﾌﾟﾘﾄﾞ 7ﾁｵﾌｧﾈｰﾄﾒﾁﾙ *（MBC換算） ﾁｵﾌｧﾈｰﾄﾒﾁﾙ 8 ﾒﾄｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 9 ﾁｵｼﾞｶﾙﾌﾞ 10 ﾘﾑｽﾙﾌﾛﾝ 11 2.4-D 12 ﾄﾘﾌﾛｷｼｽﾙﾌﾛﾝ 13 ﾄﾘﾎﾘﾝ 14 ﾄﾘｸﾛﾋﾟﾙ 15 ﾄﾘﾈｷｻﾊﾟｯｸｽｴﾁﾙ 16 ﾌﾗｻﾞｽﾙﾌﾛﾝ 17 ﾒｺﾌﾟﾛｯﾌﾟ 18 ﾖｰﾄﾞｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 19 ｲﾏｽﾞｽﾙﾌﾛﾝ 20 ｸﾛﾗﾝﾆﾄﾘﾙﾌﾟﾛｰﾙ 21 ﾋﾟｽﾋﾟﾘﾊﾞｯｸﾅﾄﾘｳﾑ 22 ﾌﾙﾙﾌﾟﾙﾐﾄﾞｰﾙ 23 ﾋﾟﾗｿﾞｽﾙﾌﾛﾝｴﾁﾙ 24 ｼﾌﾟﾛｺﾅｿﾞｰﾙ 25 ﾊﾛｽﾌﾛﾝﾒﾁﾙ 26 ｱｿﾞｷｼｽﾄﾛﾋﾞﾝ 27 ｴﾄｷｼｽﾙﾌﾛﾝ 28 ｼﾒｺﾅｿﾞｰﾙ 29 ｼｸﾛｽﾙﾌｧﾑﾛﾝ 30 ｶﾌｪﾝｽﾃﾛｰﾙ 31 ﾃﾌﾞｺﾅｿﾞｰﾙ 32 ﾃﾌﾞﾌｪﾉｼﾞﾄﾞ 33 ﾋﾞﾃﾙﾀﾉｰﾙ 34 ﾌﾙﾍﾞﾝｼﾞｱﾐﾄﾞ 35 ﾍﾞﾝﾁｵﾋﾟﾗﾄﾞ 36 ｲﾝﾄﾞｷｻｶﾙﾌﾞ 37 ﾄﾘﾌﾛｷｼｽﾄﾛﾋﾞﾝ 38 ﾃﾌﾙﾍﾞﾝｽﾞﾛﾝ 39 ﾌﾟﾛｼﾞｱﾐﾝ 40 ｵｷｼｶﾙﾎﾞｷｼﾝ 41 ﾎﾗﾑｽﾙﾌﾛﾝ 42 ﾌｪﾘﾑｿﾞﾝ(Z E) 43 ﾌﾛﾗｽﾗﾑ 44 ｼﾉｽﾙﾌﾛﾝ 45 ｶﾌｪﾝｽﾃﾛｰﾙ代謝物 46 ﾋﾟﾘﾍﾞﾝｶﾙﾌﾞ 47 ﾊﾛｽﾙﾌﾛﾝﾒﾁﾙ転移体 48 ﾌﾙｾﾄｽﾙﾌﾛﾝ 49 ﾋﾟﾘﾐﾉﾊﾞｯｸﾒﾁﾙ-Z 50 ﾋﾟﾘﾐﾉﾊﾞｯｸﾒﾁﾙ-E 51 ﾒﾁﾙﾀﾞｲﾑﾛﾝ 52 ｲｿｷｻﾍﾞﾝ 53 ﾒﾄｷｼﾌｪﾉｼﾞﾄﾞ 54 ｵﾘｻﾞﾘﾝ 55 ﾄﾘｱｼﾞﾌﾗﾑ 56 ｼｱｿﾞﾌｧﾐﾄﾞ 57 ｵｷｻｼﾞｸﾛﾒﾎﾝ 58 ｸﾛﾙﾌﾙｱｽﾞﾛﾝ IS ﾄﾘｽ-p-ﾘﾝ酸ｸﾚｿﾞｰﾙ d21 最少 最大 *MBCを代謝物として換算 **ピーク形状不良のため参 平均 回収率 ± S.D. 平均 回収率 ± S.D. 平均 回収率 ± S.D. 平均 回収率 ± S.D. 95.8 ± 10.0 127.9 ± 2.60 33.3 ± 3.00 134.0 ± 2.70 - - - -83.7 ± 0.69 113.0 ± 1.14 24.7 ± 0.87 124.6 ± 2.60 78.0 ± 1.94 105.0 ± 1.68 51.6 ± 1.30 114.2 ± 3.15 76.6 ± 0.72 100.9 ± 2.21 49.1 ± 1.97 112.4 ± 3.32 72.7 ± 0.89 97.0 ± 2.14 79.8 ± 1.21 104.5 ± 3.27 70.7 ± 3.50 88.3 ± 15.71 97.5 ± 4.36 81.4 ± 7.53 52.2 ± 5.11 57.1 ± 19.1 93.2 ± 5.95 62.7 ± 9.52 76.9 ± 1.31 101.7 ± 2.00 101.8 ± 0.57 108.4 ± 1.94 76.6 ± 1.05 98.7 ± 1.56 99.1 ± 1.23 106.2 ± 2.93 49.1 ± 1.15 71.3 ± 0.76 69.0 ± 1.23 76.8 ± 1.71 76.6 ± 1.85 97.5 ± 3.81 65.2 ± 5.48 110.2 ± 15.50 77.1 ± 0.40 101.9 ± 1.17 102.2 ± 0.71 110.1 ± 2.04 69.9 ± 2.59 95.7 ± 2.71 96.3 ± 4.52 100.6 ± 4.98 78.3 ± 1.75 105.5 ± 2.91 65.3 ± 1.58 109.3 ± 5.57 71.5 ± 1.84 95.7 ± 2.24 96.1 ± 1.41 100.0 ± 2.43 66.8 ± 1.42 89.9 ± 0.36 89.5 ± 1.62 99.1 ± 2.69 68.6 ± 3.79 93.5 ± 6.08 79.1 ± 8.26 98.4 ± 9.45 79.7 ± 0.89 106.8 ± 2.23 108.7 ± 1.19 114.7 ± 2.83 73.1 ± 1.63 94.8 ± 1.71 96.9 ± 1.08 99.3 ± 1.74 82.0 ± 0.64 108.6 ± 1.62 109.1 ± 0.73 115.7 ± 2.03 76.6 ± 2.43 96.3 ± 3.17 93.1 ± 2.12 90.0 ± 1.55 67.0 ± 0.66 87.4 ± 1.02 90.9 ± 0.91 92.9 ± 2.69 75.1 ± 0.38 98.2 ± 1.28 98.1 ± 1.19 102.6 ± 3.00 77.0 ± 2.00 100.1 ± 2.00 102.2 ± 1.67 103.7 ± 2.18 78.4 ± 2.22 102.2 ± 2.22 101.3 ± 1.36 104.5 ± 3.61 82.6 ± 2.54 105.2 ± 2.54 104.8 ± 0.87 111.0 ± 3.05 79.5 ± 0.59 104.0 ± 0.59 104.8 ± 1.48 109.9 ± 1.88 71.9 ± 11.28 92.5 ± 11.3 89.1 ± 8.96 82.3 ± 3.44 66.6 ± 0.87 84.7 ± 0.87 84.7 ± 0.98 92.3 ± 2.07 70.4 ± 1.21 89.2 ± 1.21 91.3 ± 1.32 99.0 ± 1.70 75.2 ± 0.75 97.8 ± 0.75 99.2 ± 0.78 101.9 ± 2.03 77.9 ± 1.48 100.4 ± 1.48 99.1 ± 2.83 100.8 ± 1.05 74.5 ± 1.46 96.1 ± 1.46 98.4 ± 1.33 104.4 ± 3.78 74.5 ± 1.27 95.1 ± 1.27 95.3 ± 1.25 98.8 ± 2.04 81.5 ± 1.04 107.6 ± 1.04 107.9 ± 1.09 113.2 ± 2.01 70.0 ± 2.09 86.1 ± 2.09 91.1 ± 1.29 102.4 ± 3.27 76.2 ± 2.00 90.2 ± 2.00 94.3 ± 2 101.0 ± 2.21 72.6 ± 2.90 83.4 ± 2.90 88.9 ± 1.18 96.6 ± 2.56 66.5 ± 3.62 72.5 ± 3.62 77.4 ± 2.43 86.1 ± 3.95 121.5 ± 0.70 99.5 ± 3.45 99.2 ± 5.38 99.0 ± 10.16 118.4 ± 7.16 123.08 ± 5.20 115.2 ± 6.99 105.4 ± 10.81 75.4 ± 13.99 123.09 ± 4.55 95.1 ± 3.64 108.1 ± 11.41 128.4 ± 2.76 121.6 ± 4.76 132.6 ± 5.86 106.9 ± 11.47 120.1 ± 3.85 124.88 ± 5.23 121.8 ± 4.09 108.1 ± 10.53 - - - -117.0 ± 1.70 110.56 ± 3.35 110.2 ± 2.37 96.6 ± 10.00 - - - -128.5 ± 4.02 112.27 ± 3.32 126.1 ± 3.22 96.7 ± 9.31 111.8 ± 3.88 121.44 ± 3.31 114.1 ± 2.84 106.7 ± 9.40 112.5 ± 3.17 112.11 ± 4.21 112.9 ± 2.44 97.4 ± 8.99 107.7 ± 2.46 118.14 ± 3.78 108.7 ± 1.56 103.6 ± 12.12 115.2 ± 4.10 125.29 ± 3.15 116.9 ± 4.2 108.8 ± 11.57 121.9 ± 4.52 112.95 ± 1.99 121.4 ± 5.38 98.4 ± 10.23 115.2 ± 3.02 113.57 ± 4.06 115.3 ± 6.97 79.3 ± 40.10 119.2 ± 1.26 111.67 ± 3.79 92.1 ± 1.99 98.1 ± 10.84 115.2 ± 2.18 114.92 ± 3.17 103.6 ± 2.07 96.7 ± 9.81 106.3 ± 16.93 99.66 ± 2.73 103.6 ± 5.28 93.1 ± 10.51 61.7 ± 2.76 59.3 ± 2.09 68.5 ± 1.41 47.6 ± 18.21 49.1 57.1 24.7 47.6 128.5 125.3 132.6 124.6 (n=5) *MBCを代謝物として換算 **ピーク形状不良のため参考値とする ※化学物質環境実態調査実施の手引（平成20年度）に従って70-120％を合格とした ％ ｴﾑﾎﾟｱﾃﾞｨｽｸEZｶｰﾄﾞﾘｯｼﾞ RP-1 （住友3M㈱製） ｴﾝﾋﾞｸﾛﾑ-P (ｽﾍﾟﾙｺ製) ｲﾅｰﾄｾｯﾌﾟTM miniRP1 (ｼﾞｰｴﾙｻｲｴﾝｽ社製) ％ ｲﾅｰﾄｾｯﾌﾟTMｽﾘﾑ-J RP-C18 (ｼﾞｰｴﾙｻｲｴﾝｽ社製) ％ ％
