尿 路 感 染 症 由 来Enterococcus
faecalisの
病 原 性 因 子
に 関 す る分 子 疫 学 的 検 討
石
井
亜
矢
乃
キ ー ワ ー ド:尿 路 感 染 症,
Enterococcus faecalis, asaI,
cylA
緒 言 近 年,臨 床 各 科 領 域 に お け る腸 球 菌 の 分 離 頻 度 は 明 らか に 増 加 し,全 体 の 分 離 菌 の 約10%を 腸 球 菌 が 占め る に 至 っ て い る1,2).ま た,尿 路 に お け る 腸 球 菌 の 分 離 頻 度 も 増 加 傾 向 に あ り,約20%で あ る と の 報 告 が あ る3).尿 路 に お け る 腸 球 菌 の 病 原 性 は 必 ず し も 高 く な い と考 え ら れ て き た が,臨 床 現 場 で は 腸 球 菌 に よ る有 熱 性 尿 路 感 染 症 を 少 な か ら ず 経 験 す る よ う に な っ て き た.事 実,岡 山 大 学 附 属 病 院 泌 尿 器 科 で のE. faecalis分 離 症 例 に お け る有 熱 性 尿 路 感 染 症 の 頻 度 は, 1971∼1984年 は3.8%, 1985∼1994年 は16.5 %と 明 らか に 増 加 傾 向 を 示 して い る4).腸球 菌 の 病 原 性 因 子 と し て ヘ モ リ ジ ン, aggregation substance,
enterococcal surface protein, gelatinaseな ど が 報
告 さ れ て い る が5,6,7,8,9),臨床 に お け る 尿 路 で の 腸 球 菌 の 付 着 ・定 着 性,病 原 性 因 子 な ら び に 有 熱 性 感 染 症 の 発 症 メ カ ニ ズ ム に つ い て は い ま だ 十 分 に は 明 ら か に さ れ て い な い.動 物 実 験 で はaggregation sub stanceが 腸 球 菌 の 血 管 や 心 臓 の 内 皮 細 胞 へ の 付 着, 腸 や 腎 の 尿 細 管 上 皮 細 胞 へ の 付 着 を促 進 して 感 染 症 の 発 症 に 関 与 して い る こ とが 報 告 さ れ1,7,10,11,12,13,14,15), 付 着 そ の も の が 心 内 膜 炎 や 尿 路 感 染 症 の 病 原 性 に お い て 重 要 なvirulence factorと な り う る 可 能 性 が 考 え られ る. 方,腸 球 菌 の 臨 床 上 の 問 題 点 は,本 菌 が 院 内 感 染 症 の 原 因 菌 と な り,し か も 多 くの 薬 剤 に 自 然 耐 性 な ら び に 獲 得 耐 性 を示 す こ と で あ る.バ ン コ マ イ シ ン に 耐 性 を 獲 得 し た バ ン コ マ イ シ ン 耐 性 腸 球 菌 (VRE)は 院 内 感 染 菌 と し て 世 界 的 に 重 大 な 問 題 と な っ て い る と こ ろ で あ る16).腸球 菌 は 本 来 ア ミ ノ 配 糖 体 に 対 して 自 然 耐 性 で あ るが,耐 性 遺 伝 子 の 獲 得 に よ り高 度 耐 性 を示 す よ う に な る.ア ミ ノ配 糖 体 な ど の 薬 剤 耐 性遺 伝 子 は, aggregation substance産 生 遺 伝 子(asaI)や ヘ モ リ ジ ン産 生 遺 伝 子(cylA)と 同 様 に 高 頻 度 伝 達 プ ラ ス ミ ド上 に コ ー ドさ れ て い る こ と が 多 い た め1,8,17),院 内 感 染 の 繰 り返 し に よ っ て 種 々 の 病 原 性 因 子 と薬 剤 耐 性 遺 伝 子 が 濃 縮 さ れ た 菌 へ と変 化 し て い く可 能 性 が あ る . 本 研 究 で は,病 原 性 に 関 与 し う る 遺 伝 子 の 保 有 状 況 と各 遺 伝 子 の 連 関,な ら び に そ の 年 次 推 移,お よ び 病 原 性 遺 伝 子 保 有 株 の 患 者 間 で の 交 差 感 染 の 有 無 と そ の 状 況 に つ い て 解 析 し, E. faecalisの 尿 路 で の 病 原 的 意 義 と病 院 内 交 差 感 染 の 実 像 に つ い て 検 討 を 加 え た. 対 象 と 方 法 1. 対 象 菌 株 は 岡 山 大 学 附 属 病 院 泌 尿 器 科 で, 1991年 か ら 1998年 の8年 間 に,尿 培 養 で104CFU/ml以 上 分 離 さ (平 成12年12月19日 受 理) 岡 山 大 学 医 学 部 泌 尿 器 科 学 講 座 指 導:公 文 裕 巳 教 授(岡 山 大 学 医 学 部 泌 尿 器 科 学) 論 文 請 求 先:岡 山 大 学 医 学 部 泌 尿 器 科 学 教 室 電 話:086-235-7287 FAX: 086-231-3986 E-mail:[email protected]
れ た 尿 路 感 染 症 由 来E. faecalis 251株 を 用 い た.
2. 方 法
1) aggregation substance産 生 遺 伝 子(asaI)
とヘ モ リ ジ ン 産 生 遺 伝 子(cylA)の 検 出 法
asaI遺 伝 子 とcylA遺 伝 子 の 検 出 はHuyckeら10)
の 報 告 し た プ ラ イ マ ー を 使 用 し てmultiplex-PCR法
で 行 っ た. E. faecalisを0.5ml Todd Hewitt Broth
(Difco, Detroit, USA)に1夜 培 養 し た も の を 遠 心
し,上 清 を 捨 て て 再 蒸 留 水50μlに 懸 濁 し た 後, 94℃ 10
分 熱 処 理 しDNA調 製 液 を 作 成 し た.あ ら か じ め 調
製 し た 反 応 液(PCR buffer, dNTP, primer, Taq
polymerase) 22.5μlにDNA調 製 液 の 上 清2.5μl を 加 え,反 応 を 開 始 し た.反 応 は ま ず95℃ 2分 の 熱 変 性 後,熱 変 性, annealing,伸 長 反 応 を そ れ ぞ れ95℃ 1分, 46℃ 1分, 72℃ 5分 で35サ イ ク ル 行 っ た.そ の 後2%ア ガ ロ ー ス で 電 気 泳 動 を 行 っ た.電 気 泳 動 後 エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドで 染 色 し た もの を, UV transil
luminatorに て 撮 影 し た.マ ー カ ー は100 base DNA
Ladder (New England Biolabs, Beverly, USA)
を 使 用 し た.尚, cylA遺 伝 子, asaI遺 伝 子 の サ イ ズ は そ れ ぞ れ434bp, 379bpで あ る. 2) ア ミ ノ 配 糖 体(AGs)耐 性 遺 伝 子 の 検 出 法 aph(3')-Ⅲ お よ びaac(6')-aph(2'')遺 伝 子 の 検 出 は, Klundertら18)の 報 告 し た プ ラ イ マ ー を 使 用 し て multiplex-PCR法 で 行 っ た. asaIとcylAの 検 出 法 と 同 様 に, DNA調 製 液 お よ び 反 応 液 を 作 成 し た. 反 応 は ま ず94℃ 2分 の 熱 変 性 後,熱 変 性, annealing, 伸 長 反 応 を そ れ ぞ れ94℃ 1分, 54℃ 1分, 72℃ 1分 で30サ イ ク ル 行 い,最 後 に72℃ 10分 伸 長 反 応 を 行 っ た.そ の 後cylAとanaIの 検 出 時 と 同 様 に,電 気 泳 動,染 色,撮 影 を 行 っ た.尚, aac(6')-aph(2'')の サ イ ズ は220bp, aph(3')-Ⅲ の サ イ ズ は292bpで あ る. 3) ヘ モ リ ジ ン 産 生 株 の 検 出 法 ヘ モ リジ ン産 生 性 は4%ウ マ 血 液 加Todd Hewitt Agarに 画 線 し て, 37℃ で24時 間 培 養 後,判 定 し た. 溶 血 が 認 め ら れ た 場 合 を ヘ モ リ ジ ン産 生 株 と し た. 4) パ ル ス フ ィ ー ル ドゲ ル 電 気 泳 動 法(PFGE)に よ る 遺 伝 型 の 検 討 Donabedianら19)が 報 告 した 方 法 に よ り, asaI保 有 ヘ モ リ ジ ン 産 生 株 を 対 象 にPFGEに よ る 遺 伝 型 の
検 討 を 行 っ た.ま ず, 0.5ml Brain Heart Infusion
Broth (Nissui, Tokyo, Japan)に 一 晩 培 養 し,遠
心 後pelletに 調 製 し たbuffer (1.0M NaCl, 10mM
Tris, pH 7.6)を0.2ml加 え た.懸 濁 し た 後, 55℃,
1.6%low melt agaroseと60μlず つ 等 量 混 合 し,
moldに 入 れ ゲ ル ブ ロ ッ ク を 作 成 し た.リ ゾ チ ー ム,
proteinase Kを 用 い て 溶 菌 処 理 を 行 い, 1X TE
buffer (10mM Tris, pH 7.5, 0.1mM EDTA)で
3回 洗 浄 し た 後,制 限 酵 素Sma Iを 用 い て 切 断 し た. さ ら に 洗 浄 後0.8%ア ガ ロ ー ス にmoldを 埋 め 込 み, パ ル ス フ イ ー ル ドゲ ル 電 気 泳 動 法(PFGE)を 行 っ た . 泳 動 条 件 は 泳 動 電 圧6V/cm,泳 動 時 間18.5時 間,泳 動 温 度14℃,角 度120度 と し た.電 気 泳 動 後 エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドで 染 色 し た ゲ ル を, UV transilluminator
に て 撮 影 し た.マ ー カ ー はlamda ladder (Bio-Rad
Laboratories, Hercules, USA)を 使 用 し た.
5) プ ラ ス ミ ドプ ロ フ ァ イ ル の 検 討 asaI保 有 ヘ モ リ ジ ン 産 生 株 に つ い て プ ラ ス ミ ドプ ロ フ ァ イ ル の 検 討 を 行 っ た . 5.0ml Todd Hewitt Brothに1夜 培 養 し た も の を 遠 心 し,上 清 を 捨 て 冷 再 蒸 留 水1.0mlに 懸 濁 し た の ち, 37℃ で リ ゾ チ ー ム(15 mg/ml)処 理 し て ア ル カ リ 溶 菌 を 行 っ た .そ の 後,中 和 さ せ フ ェ ノ ー ル ク ロ ロ ホ ル ム 抽 出 を 行 っ た.エ タ ノ ー ル 沈 殿 を2回 施 行 し プ ラ ス ミ ドの 調 製 を 行 っ た. そ の 後,調 製 し た プ ラ ス ミ ド をEcoR Iに よ り切 断 し, 0.5%ア ガ ロ ー ス で 電 気 泳 動 し た.泳 動 電 圧 は20 Vと し た.電 気 泳 動 後 エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドで 染 色 し た ゲ ル を, UV transilluminatorに て 撮 影 し た20).
マ ー カ ー はLambda DNA Hind Ⅲ Digest (New
England Biolabs, Beverly, USA), 5Kb DNA
Ladder (Life Technologies, Rockville , USA)を
使 用 し た. 結 果 1. 各 遺 伝 子 の 保 有 状 況 251株 の う ちaggregation substance産 生 遺 伝 子 (asaI)保 有 株 は205株(81.7%),ヘ モ リ ジ ン 産 生 遺 伝 子(cylA)保 有 株 は94株(37 .5%)で あ っ た.
AGs耐 性 遺 伝 子 保 有 株 は251株 の う ち124株(49.4%)
で あ り, aph(3')-Ⅲ 遺 伝 子 の み を保 有 す る 株 は20株
(8.0%), aaC(6')-aph(2'')遺 伝 子 の み を保 有 す る 株
は23株(9.2%),両 遺 伝 子 を 保 有 す る 株 は81株(32.3
%)で あ っ た.
2. aggregation substance産 生 遺 伝 子(asaI)保
有 の 有 無 と他 の 遺 伝 子 保 有 と の 関 係
asaI保 有 株205株 の うちcylA遺 伝 子 も し くはAGs
耐 性 遺 伝 子 を保 有 して い た 株 は167株(81.5%)で あ り, asaI非 保 有 株46株 で は7株(15.2%)の み で あ っ た(Pく0.0001). cylA遺 伝 子 も し くはAGs耐 性 遺 伝 子 を 保 有 し て い たasaI保 有 株167株 の う ち49 株(23.9%)はcylA遺 伝 子 の み を, 74株(36.1%) はAGs耐 性 遺 伝 子 の み を, 44株(21.5%)はcylA 遺 伝 子, AGs耐 性 遺 伝 子 の い ず れ も保 有 して い た. cylA遺 伝 子 も し くはAGs耐 性 遺 伝 子 を保 有 して い たasaI非 保 有 株7株 の う ち1株(2.2%)はcylA 遺 伝 子 の み を, 6株(13.0%)はAGs耐 性 遺 伝 子 の み を保 有 し て お り, asaI保 有 株, asaI非 保 有 株 と の 間 に 有 意 差 を 認 め た(P<0.0001).逆 に, cylA遺 伝 子, AGs耐 性 遺 伝 子 の い ず れ も保 有 し て い な か っ た 株 はasaI保 有 株205株 の う ち38株(18.5%)に 過 ぎ な か っ た の に 対 し て, asaI非 保 有 株46株 で は39株 (84.8%)と 大 半 がcylA遺 伝 子, AGs耐 性 遺 伝 子 を 共 に 保 有 し て い な い 株 で あ っ た(P<0.0001) (表1).
表1 aggregation substance産 生 遺 伝 子(asaI)保 有 の 有 無 と 他 の 遺 伝 子 保 有 と の 関 係
ヘ モ リ ジ ン 産 生 遺 伝 子,ア ミ ノ 配 糖 体 耐 性 遺 伝 子(aph(3')-Ⅲ ま た はaac(6')-aph(2'')) Fisher's exact probability test
3. asaI遺 伝 子 を 中 心 とす る 遺 伝 子 保 有 率 の 年 次 推 移 asaI保 有 率 は1991年69.2%, 1992∼1995年83.8% (88/105)と 増 加 傾 向 を認 め, 1996年 は74.2%と 減 少 し た も の の そ の 後 再 び1997年80.4%, 1998年90.7% と 増 加 傾 向 を 認 め た. cylA保 有 率 は1991∼1994年 30.0% (30/100), 1995∼1998年42.4% (64/151)と 年 次 的 に 増 加 傾 向 を 認 め,最 近 の2年 間 で は45.7% ∼48 .8%で あ り,保 有 株 の分 離 頻 度 が 増 加 して い た. AGs耐 性 遺 伝 子 保 有 株 は 持 続 的 に36%∼58.7%の 範 囲 で分 離 さ れ て い た. aphi(3')-Ⅲ 遺 伝 子 の み を 保 有 す る株 は4.0%∼15.4%, aac(6')-aph(2'')遺 伝 子 の み を 保 有 す る株 は4.0%∼19.4%,両 遺 伝 子 を保 有 す る 株 は23.1%∼41.3%の 割 合 で 分 離 さ れ て い た が,い ず れ に お い て も分 離 頻 度 に お け る 明 らか な 年 次 推 移 は 認 め ら れ な か っ た. asaI, cylA遺 伝 子 を共 に 保 有 す る株 の 割 合 は18.8%∼48.8%で あ り,年 次 的 変 動 は あ る も の の1991∼1994年 で は30% (30/100), 1995∼1998年 で は41.7% (63/151)と 増 加 傾 向 を 認 め た. asaI, AGs耐 性 遺 伝 子 を共 に 保 有 す る株 の 割 合 は36.0%∼54.3%で あ り,年 次 的 に ゆ るや か な 増
加 傾 向 を認 め た. asaI, cylAお よ びAGs耐 性 遺 伝
子 の 全 て を 同 時 に保 有 す る 株 の 割 合 は0%∼32.6%
年 で は24.5% (37/151)と 明 ら か な 増 加 傾 向 を 認 め た(図1). 図1 asaI遺 伝 子 を 中 心 とす る遺 伝 子 保 有 率 の 年 次 推 移 ◆-asaI遺 伝 子 保 有 株 ▲-asaI遺 伝 子 お よ びAGs耐 性 遺 伝 子 保 有 株 ■-asaI遺 伝 子 お よ びcylA遺 伝 子 保 有 株
●-asaI遺 伝 子, cylA遺 伝 子 お よ びAGs耐 性 遺 伝
子 の 全 遺 伝 子 保 有 株 図2 asaI保 有 ヘ モ リ ジ ン 産 生E. faecalisのPEGE
表2 PFGEで 同 ー パ タ ー ン を示 すasaI保 有 ヘ モ リ ジ ン 産 生E. faecalis株 の分 離 状 況
K: aph(3')-Ⅲ, G: aac(6')-aph(2'') 4. PFGEに よ る 遺 伝 型 の 検 討 お よ び 同 ー パ ター ン を示 す 株 の分 離 状 況 251株 の う ち ヘ モ リジ ン 産 生 株 は30株(12.0%)で あ り, asaI保 有 ヘ モ リジ ン 産 生 株 は28株 で あ っ た. 28株 で のPFGEに よ る検 討 で は, 4バ ン ド以 上 の 違 い を 異 な るパ ター ン とす る と21),全部 で22種 類 の パ タ ン が 存 在 し た.同 ー パ ター ン を示 し た6ペ ア(図2) の 分 離 状 況 と し て,患 者 の 基 礎 疾 患,入 院 外 来 別, 入 院 時 期,分 離 日及 びAGs耐 性 遺 伝 子 保 有 状 況 を 表2に ま とめ た. 6ペ ア の う ち4ペ ア は 入 院 患 者 よ り分 離 さ れ, 2ペ ア は い ず れ も入 院 患 者 と 入 院 歴 の な い 外 来 患 者 よ り分 離 さ れ て い た.ま た,全 て の ペ ア に お い て,再 入 院 時 期 も含 め た 入 院 時 期,外 来 受
診 日に 重 な り は な く,各 ペ ア 内 で は 分 離 時 期 に 約1 ヶ 月 か ら6年 の 違 い が あ っ た. 6ペ ア の う ち3ペ ア はAGs耐 性 遺 伝 子 保 有 パ ター ン が 同 ー で あ り, 3 ペ ア で は 異 な っ て い た . 5. プ ラ ス ミ ドプ ロ フ ァ イ ル の 検 討 検 討 し た28株 の プ ラ ス ミ ドの プ ロ フ ァ イ ル に つ い て は 同 ー の プ ロ フ ァ イ ル は2株 存 在 し た.そ の2株 は 表2の 患 者I, Jよ り分 離 さ れ た 株 で あ り, PFGE で も 同 ー パ タ ー ン を示 し て い た.そ れ 以 外 のPFGE で 同 ー パ タ ー ン を 示 し て い た5ペ ア に つ い て は プ ラ ス ミ ドの プ ロ フ ァ イ ル はす べ て 異 な っ て い た(図3) .
考
察
近 年,腸 球 菌 の 尿 路 感 染 症 か らの 分 離 頻 度 な ら び に 腸 球 菌 に よ る 有 熱 性 尿 路 感 染 症 の 頻 度 は 増 加 傾 向 に あ る も の の3,4),尿 路 に お け る腸 球 菌 の 付 着 ・定 着 性,病 原 性 因 子 な ら び に 有 熱 性 感 染 症 の 発 症 メ カ ニ ズ ム に つ い て は い ま だ 十 分 に は 明 ら か に さ れ て い な い.一 方,腸 球 菌 は 感 染 症 全 体 の 原 因 菌 の 約10%を 占 め,院 内 感 染 の 主 な 原 因 菌 の1つ で あ り1,2),バ ン コ マ イ シ ン 耐 性 腸 球 菌(VRE)は 院 内 感 染 菌 と し て 極 め て 深 刻 な 問 題 を投 げ か け て い る16). 今 回,尿 路 感 染 症 由 来Enterococcus faecalisの 病 原 性 因 子 と病 院 内 交 差 感 染 に つ い て 分 子 疫 学 的 に 解 析 す る に あ た り,腸 球 菌 のaggregation substanceに最 も 注 目 し た. aggregation substanceは, Enter
ococcus faecalisの フ ェ ロ モ ン 反 応 性 プ ラ ス ミ ド上 に コー ドさ れ て い るaggregation substance産 生 遺 伝 子(asaI)が,フ ェ ロ モ ン に 反 応 して 発 現 す る 表 面 蛋 白 質 で あ る1,9). aggregation substanceの 病 原 性 因 子 と し て の 役 割 は 次 の2つ が あ る と思 わ れ る. 1 つ は 凝 集 素 と し て の 機 能 で あ る. asaI遺 伝 子 保 有 株 の 表 面 が プ ラ ス ミ ド非 保 有 株 の 放 出 す る フ ェ ロ モ ン に 反 応 し てaggregation substanceで 被 わ れ,そ の 結 果,プ ラ ス ミ ド保 有 株 と非 保 有 株 との 間 で 凝 集 形 成 が 起 こ る.す る と高 頻 度 伝 達 プ ラ ス ミ ド上 に コ ー ドさ れ て い る病 原 性 因 子 や 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 だ け で な く,そ の 他 の 接 合 伝 達 性 遺 伝 子 も伝 達 す る 可 能 性 が 高 くな る と報 告 さ れ て い る5,7,10,12,14,22,23,24,25).つま り, aggregation substanceは,菌 と菌 と の 凝 集 に 関 与 す る こ と に よ り遺 伝 情 報 を 交 換 す る役 割 が あ る.も う1つ は 付 着 因 子 と して の 機 能 で あ る. Chowら7)や
Kreftら14)の 動 物 実 験 でaggregation substanceは,
腸 球 菌 の 血 管 や 心 臓 の 内 皮 細 胞,腸 や 腎 の 尿 細 管 上 皮 細 胞 へ の 付 着 を 促 進 して,腸 球 菌 に よ る感 染 症 発 症 に 大 きな 役 割 を 果 た して い る可 能 性 が 示 唆 さ れ た. っ ま り,付 着 そ の もの が 心 内 膜 炎 や 尿 路 感 染 症 の 病 原 性 に お い て 重 要 な 因 子 に な り う る と考 え ら れ る. 以 上 の 文 献 的 考 察 に 基 づ き,尿 路 に お け るaggrega
tion substance産 生 遺 伝 子(asaI)を 中 心 とす る病
原 性 遺 伝 子 お よ び 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 の 保 有 状 況 を 解 析 す る こ と が, E. faecalisの 尿 路 で の 病 原 的 意 義 を 考 え る 上 で 重 要 と思 わ れ た. 図3 PEGEで 同 ー パ タ ー ン を示 す 株 の プ ラ ス ミ ドプ ロ フ ァ イ ル 岡 山 大 学 附 属 病 院 泌 尿 器 科 で8年 間 に 分 離 さ れ た 尿 路 感 染 症 由 来E. faecalisのasaI保 有 率 は81 .7%
で あ っ た. Coqueら8)の 報 告 に よ る とE . faecalisで
のasaI保 有 率 は 尿 路 感 染 症 で は67%,敗 血 症 で は
77%,心 内 膜 炎52%,健 康 人 の 便 か ら で は30%で あ
る と報 告 さ れ て お り,腸 内 に 常 在 定 着 す る株 と尿 路
見 ら れ た.今 回 の 検 討 で は1991年 のasaI保 有 率 は 69.2%で あ り, Coqueら の1989∼1993年 の 分 離 菌 で の 報 告 と極 め て 良 く一 致 し て い る.一 方,今 回 の 検 討 で 明 らか な こ と は 年 次 的 に そ の 保 有 率 が 増 加 し, 1998年 で は90.7%と な っ て い る こ と で あ る.腸 球 菌 の 病 原 性 因 子 の 年 次 的 推 移 に 関 し て,ヘ モ リ ジ ン 産 生 株 が 増 加 傾 向 で あ る と の 報 告 は あ る が1), asaI遺 伝 子 保 有 株 やasaIと 他 の 遺 伝 子 を 同 時 に 保 有 す る 株 の 割 合 に つ い て の 報 告 は,今 回 検 索 し た 限 り存 在 しな か っ た.病 原 性 因 子 に 関 与 す る 各 遺 伝 子 の 連 関 に つ い て の 解 析 で は, asaI遺 伝 子 保 有 株 の う ち81.5 %はcylAも し くはAGs耐 性 遺 伝 子 を保 有 し て お
り,逆 にasaI非 保 有 株 の う ち84.8%はcylA, AGs
耐 性 遺 伝 子 の い ず れ も 保 有 し て い な か っ た(P< 0.0001).つ ま り, asaI遺 伝 子 保 有 株 はcylAも し くはAGs耐 性 遺 伝 子 を 保 有 す る 割 合 が 有 意 に 高 い. さ ら に 今 回 の 尿 路 感 染 症 由 来 株 で の 検 討 で は, asaI 保 有 率 だ け で な く, asaI, cylA遺 伝 子 を共 に 保 有 す る 株 の 割 合, asaI, AGs耐 性 遺 伝 子 を 共 に 保 有 す る
株 の 割 合, asaI, cylA, AGs耐 性 遺 伝 子 全 て を保 有
す る 株 の 割 合 も年 次 的 に 増 加 傾 向 を 示 し て い た.以
上 の 成 績 は, asaI遺 伝 子 の 発 現 型 で あ るaggregation
substanceに よ り凝 集 が 起 こ り,細 菌 間 で 遺 伝 情 報
の 交 換 が 起 こ っ た 結 果 で あ る と推 測 さ れ る.さ ら に
asaI保 有E. faecalis株 の 増 加 傾 向,腸 球 菌 の 尿 路
感 染 症 か ら の 分 離 頻 度 が 増 加 傾 向 に あ る こ と をふ ま え る と3), asaI遺 伝 子 の 発 現 がE. faecalisの 尿 路 へ
付 着,定 着 とい う 尿 路 感 染 症 発 症 に お け る最 も重 要 な 病 原 性 因 子 と し て 機 能 し て い る可 能 性 が 高 い.つ ま り, asaI遺 伝 子 保 有 株 の 増 加 に よ る尿 路 へ の 付 着 定 着 性 の 増 強,さ ら にaggregation substanceに よ る凝 集 を介 し た 病 原 性 因 子,薬 剤 耐 性 遺 伝 子 の 細 菌 間 に お け る伝 達,そ れ に よ るasaI遺 伝 子 を 中 心 と し た 様 々 な 病 原 性 因 子,薬 剤 耐 性 遺 伝 子 保 有 株 の 増 加 が 臨 床 の 場 に お け る有 熱 性,難 治 性 尿 路 感 染 症 の 増 加 に 関 与 し て い る も の と思 わ れ る. 病 原 性 遺 伝 子 保 有 株 の患 者 間 での 交 差 感 染 の有 無 とその 状 況 につ い て解 析 す る 目的 で,腸 球 菌 の 重要 な病 原 性 因子 の1つ で あ るヘ モ リジ ンに 着 目 した. 今 回 の ウ マ 血 液 を用 い た 検 討 で は, cylA遺 伝 子 の 発 現 型 で あ るヘ モ リジ ン を 産 生 す る 株 はcylA遺 伝 子 保 有 株 の32%で 認 め られ た. asaI保 有 ヘ モ リ ジ ン 産
生E. faecalis 28株 を 対 象 と してPFGEに よ る遺 伝
型 の 比 較 検 討 を 行 っ た 結 果,同 ー の パ タ ー ン を 示 す 菌 株 が6ペ ア に 認 め ら れ た.そ の う ち5ペ ア は プ ラ ス ミ ドの プ ロ フ ァ イ ル を変 化 させ て い た が, 1ペ ア で は プ ロ フ ァ イ ル を 変 化 させ ず に 長 期 間 環 境 に 生 存 し て い た と思 わ れ る. Witteら26)やWendtら27)は ナ ス コー ル の ベ ル,下 水 汚 物,ス ト レ ッ チ ャ ー,風 呂 場,看 護 の 制 服,カ ー テ ンが 腸 球 菌 に よ り汚 染 さ れ て お り,腸 球 菌 が 環 境 に 長 期 間 棲 息 し た と報 告 し て い る.表2に ま と め た よ う に,ペ ア の そ れ ぞ れ は 全 て 入 院 時 期,外 来 受 診 日 の 重 な り は な く,分 離 時 期 に 約1ヶ 月 か ら6年 の 違 い が あ り,時 間,空 間 を 越 え て 分 離 さ れ て い た こ とか ら,患 者 間 で の 直 接 的 な 交 差 感 染 は 否 定 的 で あ っ た.し か し, E. faecalis 430 株(尿 培 養 で104CFU/ml未 満 も含 む)の う ち ヘ モ リ ジ ン産 生 株56株 を用 い て 検 討 した 結 果 で は28),分 離 日 の 違 い は6日 で 入 院 時 期 の 重 な りが あ り, PFGEの パ タ ー ン お よ び プ ラ ス ミ ドプ ロ フ ァ イ ル が 同 ー で あ っ た株 が1ペ ア 存 在 し,直 接 的 な 交 差 感 染 の 事 例 が 存 在 し て い た.結 局,病 院 とい う半 閉 鎖 的 空 間 に お い て は,尿 路 感 染 症 由 来E . faecalisに お け る 遺 伝 情 報 の 交 換 は,単 に 医 師 や 看 護 婦 と い っ た 医 療 従 事 者 の 手 指 な ど を 介 す る 患 者 間 で の 単 純 か つ 直 接 的 な 交 差 感 染(狭 義 の 院 内 感 染)だ け で は な い もの と思 わ れ る.汚 染 さ れ た 病 棟 の 環 境 と 患 者 と の 接 触,食 物 交 換 を 含 む 患 者 同 士 の 接 触 に よ る菌 の 伝 播 に 加 えて, 患 者 自 身 の 尿 路 内 で 生 育 す るE. faecalis同 士 な らび に 尿 中 生 育 菌 と腸 内 に 常 在 定 着 す るE. faecalisと の 接 合 伝 達 な ど に よ る遺 伝 情 報 の 交 換 な ど,極 め て ダ イ ナ ミ ッ ク な 遺 伝 情 報 の 交 換(複 雑 な 広 義 の 院 内 感 染)が 存 在 す る も の と考 え られ る.今 回 の 検 討 結 果
か ら,尿 路 で はasaI保 有E . faecalisが こ の 遺 伝 情
報 の 交 換 に お い て 中 心 的 な 役 割 を 担 っ て い る も の と
考 え られ る が,よ り直 接 的 な エ ビ デ ン ス の 集 積 が 必
要 で あ ろ う.バ ン コ マ イ シ ン 耐 性 菌 な どの 難 治 性 感
子 の 異 菌種 へ の 伝 達 を生 じさせ な い ため に も,医 療 現 場 で生 じて い る腸 球 菌 にお け る広 義 の交 差 感 染 の 実 像 を更 に明 らか にす る必 要 が あ る と思 わ れ る.
結
論
E. faecalisの 尿 路 で の 病 原 的 意 義 を考 察 す る 目的 で,岡 山 大 学 医 学 部 附 属 病 院 泌 尿 器 科 で,尿 培 養 で 104CFU/m1以 上 分 離 さ れ た 尿 路 感 染 症 由 来E. faecalis 251株 を 用 い て, E. faecalisの 病 原 性 因 子 と 病 院 内 交 差 感 染 に つ い て 解 析 し,以 下 の 結 論 を得 た. 1. 尿 路 感 染 症 由 来E. faecalis 251株 の う ち81.7% がasaI遺 伝 子 保 有 株 で あ っ た.ま た, asaI遺 伝 子 保 有 株 はcylAも し くはAGs耐 性 遺 伝 子 を保 有 す る 割 合 が 有 意 に 高 か っ た.年 次 的 検 討 で は,asaI遺 伝 子 保 有 株 お よ びasaI遺 伝 子, cylA遺
伝 子, AGs耐 性 遺 伝 子 す べ て を 同 時 に保 有 す る株 の 明 ら か な 増 加 傾 向 を認 め た.以 上 の 成 績 はasaI 遺 伝 子 の 発 現 型 で あ るaggregation substanceに よ り凝 集 が 起 こ り,細 菌 間 で 遺 伝 情 報 の 交 換 が 起 こ っ た 結 果 で あ る と推 測 さ れ た. 2. 病 院 と い う半 閉 鎖 的 空 間 に お い て は,尿 路 感 染 症 由 来E. faecalisは 患 者 間 で の 単 純 か つ 直 接 的 な 交 差 感 染(狭 義 の 院 内 感 染)だ け で な く,人 を 含 め た 環 境 に お い て 遺 伝 情 報 の ダ イナ ミ ッ ク な 交 換 (複 雑 な 広 義 の 院 内 感 染)を 行 っ て い る こ とが 示 唆 さ れ た.
3. 尿 路 で はasaI保 有E. faecalisが こ の 遺 伝 情 報
の 交 換 に お い て 中 心 的 な役 割 を 担 っ て い る もの と 考 え られ た. 謝 辞 稿 を終 え るにあ た り,本 研 究に 対 し終 始御 指 導,御 校 閲 を 賜 りま した恩 師 公文 裕 巳教授,狩 山玲 子助 手 に心 よ り深 謝 い た します.ま た,実 験 の御 指 導 を頂 いた 泌尿 器科学 講座 技術 補佐 員,光 畑律 子 氏に 感謝 します. 本 論 文 の 要 旨 は 第47回 日本 化 学 療 法 学 会 西 日本 支 部 総 会 (1999,優 秀 演 題 賞受 賞),第74回 日本 感 染 症 学 会(2000)で 発 表 し た. 文 献
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Molecular epidemiology of Enterococcus faecalis isolated
from patients with urinary tract infection Ayano ISHII
Department of Urology, Okayama University Medical School
Okayama 700-8558, Japan
(Director: Prof. H. Kumon)
Enterococcus faecalis is a frequent cause of hospital-acquired infection. Two hundred fifty one E. faecalis isolates from patients with urinary tract infection at Okayama University Hospital over an 8-year period from 1991 through 1998 were collected. The presence of the asaI, cylA, aac (6')-aph (2''), and aph (3') -‡V genes was analyzed by PCR methods . Of the 251 isolates, 205 (81.7%) were positive for asaI. The 81. 5% (167/205) of asaI-positive isolates also possessed either cylA or aminoglycoside resistance genes, compared to only 15.2% of (7/46) asaI-negative isolates (p<0.0001). The incidence of asaI gradually increased from 69.2% in 1991 to 90.7% in 1998. The number of isolates that contain asaI, cylA and aminoglycoside resistance gene (s) also increased. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) analyses of 28 asaI-positive and hemolysin-producing isolates revealed 22 different banding patterns, including 6 pairs with similar patterns. The plasmid analyses of these isolates showed different patterns except for 1 pair with similar PFGE pattern. These results suggest that E. faecalis possessing the asaI gene may play an important role in the exchange of genetic information among enterococci in the urinary tract.
