MultiClamp 700Bでホールセル測定を行うための“Protocol”の設定方法を説明します。
最初に、Protocolの作成方法について説明し、次にMultiClamp 700BのMode Telegraph機能ついて 説明します。 Mode TelegraphはMultiClamp CommnaderのMode(voltage clamp/current clamp)の設定によって、ClampexのProtocolを読み分ける機能です。
Protocolを作成する手順は以下のようになります。
1.Digitizer-Amplifure Connections: DigidataとMultiClamp 700Bの接続 2.Configure Telegraphs: DigidataとMultiClamp 700Bの通信
3.Create Signals: Signalの作成
4.Configure Protocols: Protocolの設定
MultiClamp CommanderのSelect Deviceツールボタンを押します。 “MultiClamp Hardware”を選択してScan ボタンをクリックします。 MultiClamp 700Bを認識して、シリアル番号 が表示されます。 OKボタンをクリックして終了します。 ClampexはMultiClamp Commnaderを起 動させた後に起動して下さい。 コンピュータとMultiClamp 700BをUSBケーブルで接続し、MultiClamp 700Bの電源を入れます。 MultiClamp Commanderを起動させます。MultiClamp Commnaderのタイトルバーに“DEMO”と表示 されている場合は、MultiClamp 700Bを認識させる必要があります。
このセクションではDigidataとMultiClamp 700Bの接続について説明します。 MultiClamp 700BはChannel 1のみを使用することにします。
ClampexはDigidataの各Channelに、いくつかのSignalを作成することができます。（Channelと Signalの詳細は“Create Signal”セクションで説明します。）
各ChannelにSignalを作成すれば、Channelを共有することができ、ケーブル接続を単純化することがで きます。例えば、Voltage ClampとCurrent Clampの両方のモードでChannelを共有することができま す。
前ページのシグナルの場合は、下記３つの共有Channelを作成することができます。
前ページの6つの信号は、3つの共有Channelが作成でき、3本のケーブルで接続することができます。接 続図を次ページに示します。
Voltage ClampのMembrane currentとCurrent ClampのMembrane potential Voltage ClampのCommand potentialとCurrent ClampのCommand Current Voltage ClampのMembrane potentialとCurrent ClampのMembrane current
3本のケーブルで接続することができます。Channle 2を使用する場合は、さらに3本の接続が必要に なります。これで接続は完了しました。次にTelegraphsの設定を行います。
MultClamp 700のTelegraphはMultiClamp CommanderからClampexに設定を通信するソフ トウェアメッセージです。Clampexはこのソフトウェアメッセージを利用して、各種設定を自動的に行い ます。 TelegraphはClampexで簡単に設定することができ、同時にSignalも自動的に設定します。 最も重要なTelegraphはgainです。アンプのgainが変更されると、Clampexは自動的にgain設定 を変更してくれます。また、ローパスフィルタの設定値をリアルタイムで表示して、保存したファイルの ヘッダ情報に記録されます。もちろん、gain情報も記録されます。
さらに、MultiClamp 700Bはモード切替のためのMode Telegraphがあります。MultiClamp CommnaderのMode(voltage clamp/current clamp)の設定によって、ClampexのProtocol を読み分ける機能です。
メニューのConfigure/Telegraphed Instrumentを選択して下さい。
使用するすべてのChannelについて設定を行う必要があります。 まず、Primary Output 1端子と接続したAnalog In #0の設 定を行います。
“Telegraphed instruments”リストボッの“Axon MultiClamp 700B”を選択して下さい。 Multiclampの測定モードを変更した場合に、自動的 にclampexのProtocolを変更することができます。 この機能を使用する場合は、チェックボックスの“Start new trial…”を選択して下さい。詳細はConfigure Sequencing Keysセクションで説明します。
“Amplifier Configuration”セクションが有効になります。 “Serial number”に使用する Multiclampのシリアル番号を選択し て下さい。選択できない場合は、 “Scan”ボタンをクリックして下さい。 “Amplifuer output”の“Primary output 1”を選択して下さい。
COMMNAD 1端子と接続し たDigidataのAnalog OUT 端子を選択します。 Analog OUT #1と接続した ので、“Analog OUT #1”を 選択して下さい。
Primary output 1端子と同様に、COMMAND端子のtelegraphを設定することができます。Output Channelsセクションの“Command”を設定します。
Axoclamp900AのChannel 1 SCALED OUTPUT端子の telegraphの設定は完了です。オプションのCURRENT OUTPUT 端子にtelegraphは適用されません。
同様の手順でAxoclamp900AのChannel 2 SCALED OUTPUT 端子のtelegraphの設定を行います。
Secondary Output 1端子と接続した Analog In #1の設定を行います。 “Input Channels”の“Analog IN #1”と “Telegraphed Instrument”リストボックス の“Axon MultiClamp 700B”を選択して 下さい。 “Amplifuer output”nの“Secondary output 1”を選択して下さい。 “Serial number”は同一の番号を選択 して下さい。
COMMNAD 1端子と接続したDigidataの Analog OUT端子を選択します。
“Analog OUT #0”を選択して下さい。
Primary Output, Secondary Output, Command端子の設定しました。 Telegraphの設 定は完了です。OKボタンをクリックしてTelegraphed Instrumentウィンドウを閉じて下さい。 次に、Lab BenchでSignalを設定をします。
このセクションはSignalの作成方法について説明します。 MultiClamp 700Bで必要なSignalは6つです。
Primary Output 1 – Analog IN #0:voltage clampの膜電流, current clampの膜電位 Secondary Output 1– Analog IN #1:voltage clampの膜電位, current clampの膜電流 Command 1 – Analog OUT #0:voltage clampのコマンド電圧, current clampのコマンド電流
Signalは名前、単位、scale factor、offsetなどの各パラメータを持ち、Digidataの各 Analog channelに割り当てることができます。各Analog channelは複数のSignal を持つことによって共有することができます。
Channelはアンプなどと実際にケーブルで接続するDigidataのBNC端子のことをい います。Analog IN,Analog OUT,Digital IN,Digital OUTなどがあります。
SignalとChannelについて SignalとChannelについて
メニューのConfigure/Lab Bench…を開いて下さい。下 図のツールボタンからも開けます。
Lab Benchを開き“Input Signals”タ ブを選択して下さい。
“Digidata Channels”に使用する入 力Channleを設定します。
Primary Output 1端子は“Analog IN #0”に接続しました。
“Analog IN #0”を選択して下さい。 Voltage ClampとCurrent Clamp 用に２つのシグナルを作成します。
Signalを追加で作成します。“Signals”セ クションの“Add”ボタンをクリックすると “Add Signals”ダイアログが開きます。 Voltage Clamp用のmembrane currentのSignalを作成します。名前を “Im_prime”としましたが、“Im_prime1” としたほうが分かりやすいかもしれません。 OKボタンをクリックして下さい。 “Signals list”作成したSignalが選択され、各設定項 目が表示されます。 “Scaling”セクションはグレー表 示されて設定できないようになり ます。 これはTelegraphの設定を行っ たことによって、自動的に設定さ れるからです。
TelegraphはLab Benchの下の方 に表示されます。
図のように、Lab Benchと
MultiClamp Commnaderの設定 が同期します。
MultiClamp Commanderの設定を変更すると、Lab Benchの表示が変更されることを確認して下さい。 Filter, gain, capacitance compensationのTelegraphがリアルタイムで更新されるはずです。
MultiClamp CommnaderのGainを変 更して下さい。
MultiClamp CommnaderのPrimary Outputのスケーリングは変更されます。 10×0.5V/nA = 5V/nA
一方、Lab BenchのScale factorは変 更されません。Scale factorはgain=1 場合を表示しているからです。
Primary OutputのVoltage Clamp用のSignalの作成は完了しました。MultiClampのTelegraphはSignal を作成するだけで自動的に設定してくれます。
また、下記のオプション機能があります。 “Software RC Filter”セクションでソフト ウェアフィルタを設定できます。
“Hardware Signal Conditioning”セ クションでCyberAmpの設定ができます。
次に、Current Clamp用の membrane potentialのSignalを 作成します。 Voltage ClampとCurrent ClampでChannleを共有している ので、 “Digidata Channels” は “Analog IN #0”を選択して、Add ボタンをクリックして下さい。 “Vm_prime”としましたが、 “Vm_prime1”としたほうが分かり やすいかもしれません。 Signalの設定はTelegraphで自動的に設定されます。 MultiClamp CommanderのICモードに変更して、 MultiClamp Commanderの設定がLab Benchの Telegraph表示と同期することを確認して下さい。
次に、Secondary Output 1について、voltage clampとcurrent clampのSignalを作成します。 Secondary Output 1端子は“Analog
IN #1”に接続しました。
“Digidata Channels”に“Analog IN #1”を選択して、Addボタンをクリックして 下さい。
voltage clamp用のmembrane potentialのSiganlとして “Vm_sec”としました。 “Vm_sec1”としたほうが分かりやすいか もしてません。
同様に、“Analog IN #1”にcurrent clamp用のmembrane currentの Signalを作成して下さい。
“Im_sec”としました。“Im_sec1”とした ほうが分かりやすいかもしれません。
“Im_sec”はMultiClamp Commanderが ICモードのとき、Secondary Output の Menmrane CurrentのSignalとして使用さ れます。 MultiClampの測定範囲はヘッドステージのフィードバッ ク抵抗で決まります。 下図のOptionボタンをクリックして、Gainタブに移動し て下さい。（F10がシートカットキーになります） デフォルトでは500MΩに設定されています。また、 MultiClamp Commanderの右下の設定値が表示さ
次に、コマンドのSignalを作成しま す。
Lab Benchのoutput Signalsタ ブでAnalog OUT #0を選択して 下さい。
Analog OUT #0はvoltage clampとcurrent clampのコマン ドの共有Channleです。
AddボタンをクリックしてSignalを作成して下さい。 Signalの名前は“V_clamp”としました。
TelegraphセクションではAnalog OUT #0の TelegraphをAnalog IN #0とAnalog IN #1で有効となるように設定しました。グレース 表示されて、自動的にスケーリングが設定され ます。 Voltage clampのCommand端子のスケーリン グは20mV/V,100mV/Vの２つから選択できます。 下図のOptionボタンをクリックして下さい。 20mV/Vを選択し、Lab Benchと同期することを確認
holding levelの設定はグレー表示さ れて、設定できないようになります。 holding levelはProtocolの作成で設 定することになります。 次に、current clampのコマンドのSignalを作 成します。 AddボタンをクリックしてSignalを作成して下さ い。“I_clamp”としました。
MultiClamp CommanderをICモー ドに設定して下さい。 Lab Bemchのスケーリングと単位がcurrentに 変更されます。 current clampのコマンドのスケーリングは、 400 pA/V, 2 nA/Vの２つから選択できます。 今回は、400 pA/Vを選択して下さい。
6つのSignalを作成しました。
このセクションではMultiClamp Commanderを操作して、Telegraphの動作を確認しました。 Lab BenchではDigidataのChannelを選択し、Signalを作成して名前を付ければ、Scale factor、 単位などは自動的に設定されます。また、MultiClamp Commnaderのモード変更した場合でも、 Scale factorは自動的に変更されます。
これで、Signalの作成と設定は完了しました。つぎに、Protocolの作成して各種データ測定パラメータを設 定します。
ClampexのProtocolは、測定パラメータ、コマンド波形、解析パラメータなどを設定します。また、作 成したSignalもprotocolごとに設定する必要があります。
このセクションでは簡単な２つのprotocolを作成します。１つはVoltage Clamp用、もう１つは Current Clamp用です。
voltage clampの設定をします。 次のページに進んで下さい。 メニューのAcquire/New Protocolを選択し てProtocolエディタを開いて下さい。 Clampexウィンドウの下にあるステータスバー に読み込み中のProtocol名が表示されます。 保存されていないProtocolが読み込まれてい る場合は、 Protocolエディタのウィンドウタイ トルバーに“(untitled)”と表示されます。 読み込み中のProtocolを設定する場合は、 Acquire/Edit Protocolを選択します。もしく は、下図のツールボタンをクリックします。
Mode/Rateタブでは測定モードやサ ンプリングレートなどを設定します。 Acquisition Modeはデフォルトで Episodic stimulationが選択されて います。このモードのみcommand波 形を出力できます。 Runs/trialは測定の繰り返し数を設 定します。通常は“1”を設定します。 Trial delayは測定終了と次の測定 開始の時間を設定します。通常は“0” を設定します。 Sweep/runはSweep数(刺激を加 える数)を設定します。 Sweep durationはsweepの時間 を設定します。 Fast rateはサンプリング周波数を設 定します。 Start-to-Start IntervalsのSweepはMinimumに設定さ れています。これは、Sweep開始と次のSweep開始の時間間 隔を設定します。Sweep durationより長くする必要がありま
Inputsタブを選択して下さい。
DigidataのAnalog INのSignalを設定します。 使用するDigidataのAnalog INをチェックし、Lab Benchで作成したSignalを設定します。
voltage clampのmembrane currentのSignalと して“Im_prime”を作成しました。
voltage clampのmembrane potentialのSignal として“Vm_prime”を作成しました。
“Channel #0”をチェックして“Im_prime”を設定し て下さい。
“Channel #1”をチェックして“Vm_prime” を設定して下さい。 Inputsタブの設定は完了です。 Outputsタブを選択して下さい。 DigidataのAnalog OUTのSignalを設定します。 voltage clampのcommandのSignalとして “V_clamp”を作成しました。 “Channel #0”に“V_clamp”を設定して下さい。
各Signalにholding levelを設定することができます。 Protocolに“V_clamp”を読み込んでも、単位が“mV”ではなく “pA”になっている場合は、MultiClamp CommanderがICモー ドになっています。 これはTelegraphが有効になっていて、Signalのスケーリング や単位はMultiClamp Commanderのモードで決まるからで す。 holding levelを-50mVに設定します。 Holding levelフィールドに“-50”と入力してください。 もし単位が異なる場合は、OKボタンをクリックしてProtocol editorを閉じてください。 MultiClamp CommanderをVCに設定し、再度Protocol Editorを開いて下さい。 “V_clamp”の単位は“mV”になるはずです。
Triggerタブに移動して下さい。
デフォルトでは、Start trial withは“Immediate”に設定 されています。
“Immediate”を選択すると、ツールバーのRecordボタン もしくはView onlyボタン押した直後にデータ取得を開始さ れます。
デフォルトでは、Trigger sourceは“Internal Timer”に 設定されています。このトリガーはコマンド波形とデータ取 得する直後にtrialを開始します。
通常のプロトコルではTriggerタブの設定を変更する必要はありません。しかし、外部機器と同期する場合には、設 定を変更する必要があります。ここでは、外部機器と同期する場合の説明を省略します。
Waveform タブのChannel #0タブ を選択して下さい。 ANALOG OUT #0のコマンド電圧を 設定します。 デフォルト波形がすでに設定されてい ます。この設定を削除して、任意のコ マンド電圧を作成します。 Analog Waveformチェックボックス を有効にします。真ん中にあるテーブ ルに波形パラメータを設定します。 このテーブルは10セクションに分割さ れていて、この分割された単位を epochといいます。epochにはA-Jの 記号が指標付けられ、それぞれに波 形パラメータを設定します。 青丸で囲まれたところに“V_clamp”とSignal名が表示されます。すぐ 横のInfoボタンをクリックすると、“V_clamp”のパラメータが確認でき ます。
テーブルのパラメータFirst level,Delta levelの単位mVはSignalの 単位によって決まります。
テーブルに波形パラメータを設定します。 簡単な例として、Sweepごとに振幅が増加する ステップ波形を作成します。 epoch AのTypeは“Step”を選択し、First levelに“-50”と入力して下さい。 epoch Aの最初のsweepの電圧値を-50mV と設定したことになります。 これの数値はOutputタブで設定したholding level-50mVと同じ値です。
epoch AのDelta levelに“0”と入力して下さ い。増加が0なので、2 sweep以降もfirst levelを維持します。
epoch Aでは10 sweepのすべてが-50mV 出力することになります。
epoch Aの時間を設定します。First durationに“50”と 入力して下さい。epoch Aの時間は50msに設定されまし た。 テーブルの下に時間とサンプル数が表示されます。 サンプル数はサンプリングレート×時間で計算されます。 First rate=10kHzのとき、10kHz×50ms=500となり ます。 これでepoch Aの設定は完了です。次にepoch Bを設定 します。 epoch BのTypeは“Step”を選択して下さい。
epoch Bの設定をします。 First levelを-100mVに設定して下さい。 epoch Bにはsweepで振幅が増加するステップ波形 を作成することにします。 Delta levelを20mVに設定して下さい。sweepは振 幅が20mVずつ増加していきます。 1sweep目が100mVから始まり、20mVずつ増加し ていくので、10sweep目は80mVになります。これは テーブルの下にFinal levelとして表示されます。 First durationを100msに設定して下さい。これもテー ブルの下に表示されます。 今回、Delta durationは設定しません。Delta durationを設定すると、epochの時間が延びます。も し使用する場合は、Mode/Rateタブのsweep durationを変更する必要があるかもしれません。
Protocolエディターの右下にあるUpdate Previewボタンをクリックして下さい。 Waveform Previewウィンドウが開き、 設定したコマンド電圧が描画されます。 このウィンドウは、再度Waveform previewボタンを押すまで描画を保持しま す。 Waveform Previewウィンドウには、す べての出力チャンネルが表示されます。右 クリックのポップアップメニューから Maximize Signalを選択すると、拡大表 示されます。
Protocolエディタのウィンドウタイトルバーに
“(untitled)”と表示されている場合、protocolは保存 されていないので、保存する必要があります。
メニューのAcquire/Save Protocol Asを選択して、 ダイアログを開いて下さい。 任意のファイル名を入力して、Saveボタンをクリックし て下さい。今回は“Voltage Clamp 1”としました。 保存したprotocolはメニューのAcquire/Open Protocolから開くことができます。また、下図のツール ボタンから開くこともできます。
Mode/Rateタブそのままの設定に して、Inputsタブを選択して下さい。 current clampのmembrane potentialのSignalとして “Vm_prime”を作成しました。 “Channel #0”をチェックして “Vm_prime”を設定して下さい。 current clampのmembrane pcurrentlのSignalとして “Im_sec”を作成しました。 “Channel #1”をチェックして “Im_sec”を設定して下さい。
次に、current clampのProtocolを作成します。voltage clampのProtocolをそのまま利用します。
<注意>
Outputsタブを選択して下さい。 DigidataのAnalog OUTのSignalを設定します。 current clampのcommandのSignalとして “I_clamp”を作成しました。 “Channel #0”に“I_clamp”を設定して下さい。 holding levelはデフォルトのまま“0”に設定して下さい。 current clampのコマンド電流を設定 します。 左図のように、様々な設定を試して下さ い。
OKボタンをクリックしてProtocol editorを終了して下さ い。
Acquire/Save Protocol AsでProtocolを保存して下 さい。今回は“Current Clamp 1”としました。
Scopeウィンドウに設定した２つの入力Signalが表示さ れるのが確認できます。
“Voltage Clamp 1”と“Current Clamp 1”の２つのprotocolが完成しました。次にオプション機能である Mode Telegraphの設定を紹介します。
Mode Telegraph機能を使用すれば、MultiClamp Commanderのモード変更したときに、 ClampexのProtocolを自動的に読み込むことができます。Mode Telegraphを使用するには Sequencing keyを設定する必要があります。
メニューのConfigure/Sequencing Keysを 選択して下さい。 Sequencing Keysダイアログが表示されま す。 Sequencing Keysがデフォルト設定の場合 は、 Sequencing Keysテーブルは空の状 態です。 また、ウィンドウのタイトルバーに“Startup” と表示されます。
Addボタンをクリックして、“Add a key
definiton for”リストボックスは“V-Clamp IN 0” を選択して下さい。
“IN0”はAnalog In #0を意味しています。DigidataのAnalog IN #0とMultiClampのPrimary Outputは Telegraphが有効になっています。
“V-Clamp”はMultiClamp Commanderのモードを意味しています。 OKボタンをクリックして下さい。
Sequencing Keys – Propatiesダイアログが開き、 operationタブが選択されます。Protocolチェックボック スを選択して下さい。 “Action”リストボックスには動作を設定します。 “View”は記録なしで測定開始、“Run”は記録あり で測定開始します。 Protocol fileフィールドには読み込むProtocolファ イルを設定します。“Browse”ボタンをクリックして下 さい。
Open fileダイアログが開きますので、作成した“Voltage Clamp 1”を設定して、Openボタンをクリックして下さい。 Protocol fileフィールドにProtocolの ファイルパスが表示されます。 “Repetition count”は“1”に設定して 下さい。 Sequencing keyの設定は完了です。しかし、Propertiesダイアログを閉じる前にSequencingタブを選択して下さい。このタブ は、現在設定しているSequencing keyが終了した後、次に開始するSequencing keyを設定することができます。
別のSequencing keyを作成すれば、この機能を使用することができます。 OKボタンをクリックしてPropertiesダイアログを終了して下さい。
current clamp用のSequencing keyを 作成します。 Addボタンをクリックして下さ い。 “I-CLAMP IN 0”を選択して下さい。 MultiClamp CommanderがICモードに設定 されたSequencing keyを作成します。
Browseボタンをクリックして
Protocolを設定します。“Current Clamp 1”を設定して下さい。
Propertiesダイアログを閉じて下さい。 Sequencing keyが追加されます。
Optionボタンをクリックして下さい。
Sequencing keyのProtocolの保存について 選択ができます。
Sequencing keyの設定は完了です。Sequencing keyダイアログと閉じれば設定は自動的 に保存されます。
MultiClamp 700BのヘッドステージにPATCH 1Uモデルセルを接続して下さい。 MultiClamp CommanderのモードをVC,ICと変更してみて下さい。
ClampexでProtocolが“V-Clamp 1”,“I-Clamp 1”が読み込まれ、Scopeウィンドウの単位が変更され るはずです。
これでMultiClampの説明を完了します。この他に情報が必要な場合は、Online Helpやマニュアルを参 考にして下さい。
