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Corg才cf〟∽rO折ffのβ−グルカン生産に対するチアミン
および亜鉛イオンの効果
梶明，佐藤 俊行，中村 八郎
緒 p 微生物には多糖類を培養液中に分泌するものが多い．（力γfよcよ∽”叫誠がβ−グルカンを培養汲中に分泌することば， Batraら（1）によって1969年に発表された… またBasidiomycetesQM806が細胞壁中にP−グルカンを生産する＝，とが Bush，Horisberger（2）らによって報貸されているが，この歯はReese，Mandelsの提供したもので，C・・r粥iiとは輿 をりP秒Cゐ聯血属のかびのようである（8）． 著者らの研究グループは，C画料去が生産する酸性酵素群について−迎の研究を行なってきたが，このかびは Aゆβγg肋s乃短e7・なとに比べると生育が遅い．しかし，これをふすまの抽出液または米糠の抽出液を含む培養液を使 用して培養するときは，単一炭素濾の糖類を使用するときよりもはるかに生育が速く，菌糸の歪も多い．そこで，生 育促因因子の一つであるチアミンの影響を検索中，その濃度がある盈を越すときは培養液の粘度が著しく高くをる現 象を見いだした．本報においてはCγ咄去よが生産するβ−グルカンの生産条件について報告する． 実 験 方 法 薗 Tablelに示す13strainが実験に使用された．，このうち，C。rOy；iiK2は京都大学植物病学研究室において 分離され，内藤，谷を通じて分譲されたいCγ0拘去ClO−2岬1∼ClO−2−5は農林省虚業技術研究所の富永博士から分譲 された． 培養方法 グルコース50g，ペプトン10g，NH4NO80．5g，KH2PO40．5g，MgSO4・71i200．2g，2％FeC130．3ml を11の脱イオ・ン水に溶解し，pHを5れ4に調節した．培養は500ml容撮とう■フラスコに培衣紋を50ml入れで菌を接 種し，270Cで往復放とう機上で振とう培養を行なった．種菌にはじゃがいも抽出液寒天ショ糖添加斜面培凝基に新 しく生育した菌糸または薗核を使用した． 洗浄菌体の調製法 上記の基本培養液を使用して7日間振とう培養を行なった後，菌体を布炉過で集め，0．1凡才 クエン酸ナトリウムーHCl緩衝液（pIi2．0）で3回洗浄し，次に10分間10，000×gで遠心分離して洗浄菌体を得た． この菌糸を同一腰衝披中に懸濁した．． 多糖類の調製法 C．頑砧IFO4476をチアミン添加培地で培養した後，菌糸をI吸引炉過し，粘凋を炉液を15 倍容のエタノール中に擬拝しながら添加すると白色放線状の沈殿が得られた．これを布炉過で集め，エタノ・−ルで洗 浄した後，脱イオン水に溶解する．以上の操作を6固練り返した1．つぎに，この溶液をViskingセロファンチューブ に入れ，水を外液として24時間透析した後，再度15倍容のエタノ・−・ル中に滴加して沈殿を生じせしめた」・沈殿を炉 過した後，50◇Cで真空乾燥した．乾燥物は粉砕して白色粉末を得た、 多糖類の定盤法 溶液の粘度測定によって行なった．培養炉液を過当に希釈した後，Ostwald粘度計を使用して 300Cで精度を測定した∩ 上記の方法で調製した多糖類を使用して，その濃度と比粘度との関係を測定すると，Fig・1 に示すとおり濃度0．2∼0小8mg／mlの範囲で直線関係が得られた付 この検盈線を使用して溶液中の多糖類の濃度を求 めた．． 糖の定盤法 培養液中および酵素作用液中の還元機宜は原則としてNelson−Somogyi法（帰）により定量した．金 地走塁にはPhenol−H2SO4法（6）も使用したL 菌体盈の測定法 菌糸を炉液で炉過して，熱水で充分洗浄した後乾燥してその重盈を測定した．香川大学農学部学術報告 l へ竜三．壬SOUSt・′Uこ⋮U茎s 0 02 0−4 06 0．8 IO CoIICe】lh雨iol10f glし1Call（l哨／Inl） Fig．1”Relationshipofspecificviscositytoconccntrationofglucan・ 酵素活性の測定法 （l）β−1，3一gluanasc o2％基質溶液1Oml，02MMcIIvaine絞衝液（pH4．5）02ml，酵素液0．2ml，脱イオ ン水016mlおよびトルエン1滴を配合し，300Cで30分葱いし24時間酵素作用を進めた後，作用液05mlを取り 0．1凡才Na2CO3溶液0、5mlを加え．て反応を停止した… 生成した還元糖を走塁し，グルコ1−スとして表わした．基質に は上記のC．ro師ii多糖類および市販のラミナリン（K＆KLaboratories，Inc）を使用した．β一1，3一glucanaseはC roy；iiが生産した酵素を本研究室において高度に精製したもので，eXO−β−1，3−glucanaseである（7）． （2）a−amyla＄e O小2％基質溶液0．5ml，02MMcIIvaine緩衝液（pH4，5）0．25ml，酵素液0．25mlを配合し， 300Cで2時間酵素作用を進めた後，上記同様に反応を停止して，生成還元糖鼠を求めた∩ 基磐には上記多糖類およ び可溶性澱粉（和光純薬工業株式会社）を使用した‖ 使用したα−amylaseはAゆβγgメ肋s orッgαβの柑製酵素（三共 株式会社）を使用した． （3）glucoamylase α−amylaseと同様の配合割合で酵素作用を進めた後，還元糖を定立した．使用したgluco− amylaseはCro折iiが生産した酵素を本研究室で浪越がほほ均N・タンパク質にまで精製した酵素である（未発表）。 ペーパークロマトグラフィー 東洋炉紙Noい51を使用し，糖を添付した後，下降法で展開した．溶媒A：n−ブ タノ・−ル，酢酸，水（4：1：5），B：n一ブタノ・−ル，ビリジン，水（6：4：3）C：■アユ．ノール，水（5：1）∴糖の呈 色にはアニリン水素ブターリレ酸またはアルカリ性 AgNO8溶液卵）を使用した． 実 験 結 果 Ⅰ各種strainによる多糖類の生産 予備実験の結果，培養液中にチアミンを添加するとき多糖類がよく生産されることが認められた… 上記の基本培地 にチアミン500／唱／1を加えて7日間振とう培養したとき，培養液中に分泌される多糖類の塵をTablelに示す．13の strainすべてが多糖類を生産し，ClO−2−4が最も良好な成撥を示し，ClO−2−5，ClO−2−3，IFO4878，4476などが良好 な成潰を示した… 以下の実験では，研究室で使いなれたIFO4476を使用した． ⅠⅠ多糖類生産に対する培養条件 1．炭素源の影響 すでに発表したとおり，C．rp脚fはベントースを資化する能力は小さい（10，11）∩本実験におい ても，アラピノ1−スおよびキシロースを炭素源とするときは菌の生育は悪く，多糖類生産盈もきわめて少盈であった． グルコース，マンノース，マルトース，ショ糖，可溶性澱粉は生育も良好であり，多糖類生産最も同じ程度であった． ガラクトース，t7ラクトースを炭素源とするときは生産丑はきわめて少量であった．そこで，以下の実験では炭素源
133 第27巻第59号（1976）
Tablel巾 Production of glucanbythirtcen strainsof Cbrticiumr榔ii Amount Orglucan Strain （mgper mlorcuト tureauide） （bγめ査〟∽γク折ま査 IFO4476（勧〃‘ゐ花〟‡CβJ言古γ掬α；） IFO4878（助加地閃戒砧） （C．ro拘iATCC24964） IFO5253（C．α椚わ邑ルgα∽） IFO6142（C．c♂乃わ・軸〟∽） IFO6146（C．r〃び主査ZATCC24965） IFO。5926 K2（C‖rO拘iATCC24963〉 ClO−2−1 ClO−2−2 ClO−2−3 ClO−2−4 ClO−2−5 IAM9028（CいCβ′Zfr拘g〟m） 5 7 7 0 1 6 0 2 0 4 6 0 2 L l 1 0 3 4 74 L
Culture medium was composed of’50gofglucose，10g ofpeptOne，Ol5g NH。NO3，0．5g ofKH2PO。，012gofMgSO。17‡‡20，0・3mlof■2％FeC18
solution，500FLg Ofthiamineandllofdcionizcd waterlTheinitialpH
was aqjustcd to 5。4The cultivation was carried out at30OC，fbr7days・
として主にグルコースを使用した1上記とl計様に，チアミンを添加した基本培地を用いて，グルコースの濃度を0∼ 10％として多糖類の生産故を検討した，Table2の結束が示すとおり，培養液中のグルコ−・ス濃度は3％または5％ が良好であった以下の実験ではグルコースの濃度を5％として培養液を調製したい Tablc2E拝もctofglucoseconcentrationonthcproductionofpolysaccharide
Amountofglucan
Dryweightofmycelia
if Concentration of glucose（pefCent） （mgpcrmlofculturefluid）
（f
（Or
5 7 9days 5 7 9days 5 7 9days 一426禰一一 ■1 6 3 0 0 2 ︻︺ 1 5 5 3 ︻︶ 5 ■︶ ︻︸ 一428381一一 2 3 5 7 0 3 6 りJ 7 ＊ 乳 3 2 2 ＊∽“一一 ＊開”一
蒜ほ＝
一川柑は膵
一⋮柑＝＊PolysaccharidcproduccdwasunabletobcassayedbyviscosltymCthodbecauseits conccntration
WaSVClylow． 3．窒素源の影響 各種窒素源を培養液中に加えて多糖類生産に及ぼす影響を検討した‖ 添加盟は基本培養液中， 窒素として約0．15％になるように調製したい各窒素源ごとにチアミン添加（500〃g／l）とチアミン無添加の2種類の培養液を定鼓した．いずれも8日培養後，多糖類を定丑したい チアミン添加培養基においては酵母エキス，ペプシン，
NH。NO8併用，カザミノ酸，ペプトン添加の場合には生産が順調であったが，その他の窒素源はよい結果を示さをか
った．チアミン無添加の場合には酵母エキスを窒素源としたときのみ良好な成艇を示した．．香川大学戯学部学術報告 134 3．金属塩の影響 酵母エキスの効果が明らかにをったので，代表的金属塩の効果を検討した．基本培地から FeC13を除き，チアミンを500FLg／1を含有する増益基に代表的金属塩を加えてその効果を調べた．Table3に示すと おり，Zn帥の効果が著しいことがわかった．この効果は菌糸の増殖にもみとめられた． Table3．E鮎ctofmetalionsontheproductionofglucan
Salt Concentration Amountofglucan Wcightofmycelia
Ratioofglucanto
dry wt of mycelia
（mg／mgpeTmlor Culture飢1id）（mgpcrmlof
（mgper50mlof
Culturc触id） culture飢Iid） （〃gperml） 1 7 9 1 5 8 6 5 2 6 6 4 0U 5 4 0 0 0 0 0 2 3 5 3 ■1 ︻hJ 5 7 2 2 4一3 8 ︹J ■J 3 3 9 3 1⊥ None FeC18 ZnSO47H20 MnS04 7Hz0 CuSO45H20 一6・0∽⋮M 4．ビタミンの影替 チアミンの効果が明快になったので，そのほかのビタミンの効果を検討した．Table4に 示す各種のビタミンを単独または混合して培養液に添加し，多糖類生産に対する効果を調べた‖ その結果，チアミン のみが効果を示し，その他のビタミンはまったく菌糸の生産および多糖類生産に対する効果を示さなかった． Tablc4．EfTcctofvitaminsontheproductionofglucan Concentration Amountofglucan （gpef1） （mgpermlor CultuIenuid）Wcightofmycelia
（mgper50mlof
Culture重iuid） Vitamin 98い7 568．8 107．0 100…0 87‖2 94 O 86．0 92“2 438．0 None Thiamine HCIsalt Riboflavine Pyridoxal phosphate Nicotillic acid Biotill Pantothcnic acid PqaminobenzoateNasalt Mixturcofvitamins（Bl，BB，B6） 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ハU ︻〇 〇 〇 〇 5 にJ ■．〇 〇 〇 ︻一︺ ︻〇 2 りム negligiblc 267 ne如igible negligible negligible negligible negligible negligiblc 2り82 5．酵母エキスの影響 上記のとおり，酵母エキスの効果が著しいので，その適当な濃度を検討したn 基本培地 中に酵母エキスを0∼0．2％添加し，語法どおり培養した後多糖類の生産盈を測定したい その結果，多糖類の生産盈は 酵母エキスの濃度の上男とともに高くなり，0．1％でその効果を著しく現わし，02％で最高を示したい 6．培養経過と多糖類生産 前項・までの実験をもとに，Croq；iiによる多糖類生産のための最適培養基をTable 5のように設定した‖ この戒適培養基を用いて常法通りC．rp折よ去を振とう培養し，経時的に多糖類の生産量を測定し た、培養液のpH，菌糸の盈をらびに糖類を追跡した．その結果をFig2にまとめた… 培養7日後多糖類の盈は最高， 93mg／mlに適し，対消費糖22％，対菌糸盈59％であった． 7．培養におけるチアミンの効果 培養の始めからチアミンを添加する実験では7日間振とう培養継続中，チア ミンの法度が250／唱／1までは歯糸の嵐，多糖類の立ともに直線的に増加したり そこで，上記の基本培養基（チアミン を含まをい）を用いて6日間C．γ0師宣まを振とう培養した後，チアミンを各種の濃度に細菌的に加え，再び2日間放 とう培養を継続した．培養終了後多糖類の盈および菌糸盈を測定し，結果をFig」・3に示す．菌糸の生育後チアミン を添加したときは，その濃度100／唱／1まで多糖類生産盈が増加し，対菌糸盈の比は0．29とをったい すなわちチアミン の効果は菌糸の生育に有効であるとともに多糖類生産に対しても直接的な効果があるようであった． 8．洗浄菌体による多糖類生産に対するチアミンの効果 実験方法の現に述べたとおり洗浄菌体を調製し，湿潤135 第27巻第59考（1976） 〓20爪＼NO−×警l︶d〓写真ゴ己＼晋t︶．喜l一lU
Table5．Typicalcultivationmediumfbr the
PrOductionofglucan
Composition Concentration（g／1） Glucose 50O Peptone lO・O NH4NO8 0り5 KH2PO4 0．5 MgSO。・7H20 0・2 ZnSO4∴7H20 O 006 ThiamineHCIsalt 500（FLg）The nutrients were dissolved in deionized
water andtheinitialpHwasaqjusted to54 Fig，2“Time course of cultivation and production of
glucan”ThefhnglWeregrOWninthesamemedium
asshowninTable5 −○−glucan，−○−myCelia，−㊥−−・reSidual Sugar，−△−pH。 ︵晋＼旨︶遥芦︵∈〇一亡召孟叫◇三遥 3 2 1 0 0 0 0 ＜U 5 0 5 ハU 5 2211 〓u−○竺眈∈︶克〓8ンーイl▲000〇
二≡＼り三−U一ご＝≡ Fig‖3爪 Efrbctofthiamineontheproductionofglucanincultivation”AfterthefhnglWeregrOWnin thebasalmediumwithout thiaminefbr6days， variousamountsofthiaminewerc added to the culturenuidand the cultivation wascarriedoutforfurther2day巾 pO−glucan，−●一myCelia，−Q＞−ratioofglucantomyceliar 状態の歪盟約130mg／mlの濃度に0．1Mクエン酸ナトリウムーHCl援衝液（pH20）中にけんだくさせた。このけん だく液6mlにグルコースを2％添加し，さらにチアミンを0∼100〝g／1添加して最終液盈8mlとした．この液をL 字型フラスコ（直径1”8cm，9．8×12．3cm）に入れ，300Cの湯浴中，モノ塑振とう機（60回／分）上で8時間振とう した後多糖類の生産盈を測定した爪 チアミン濃度0∼20／Jg／1までは直線的に多糖類の生産盈が増加し20J唱／1以上で は増加が認められをかった，．なお，けんだく液を8時間振とうした前後において菌糸の蕊に変化が認められなかった． ⅠⅠⅠ多糖類の性質 1．純度 乾燥多糖類粉末を用いて02％の溶液を作製し，その0．5mlに2ⅣH2SO40。5mlを加えてよく混合し， 1000Cの湯浴中で5時間加水分解を行をった後，アルカリで中和，炉過して得られた済液を10mlに定容した．その
香川大学虔学部学術報告 136 ー・定盈をとって還元糖塁を定盈した，．多糖類100．Omgから108Omgの還元糖（グルコい・・・・スとして）が得られたい ケ トースの検出反応，カルバゾール硫酸反応，ニンヒドリン反応はいずれも陰性であった、．これらの結果から，C． γ0折まfの生産する多糖類はアルド・−スのみを含みケトース ，ウロン酸ならびにアミノ酸は含有されないものと判定し た．但し，多糖類の均一・性は今後の研究課題である． 2・構成糖 試料を1ⅣH2SO4中で1000Cで5時間加熱した後，炭酸バリウムで中和し，生じた沈殿を炉過し， 洗浄してその折液を洗液をあわせて減圧下で濃縮乾閲した．これに脱イオン水を加えて溶解し，ペー・パ、− クロマトグ ラフイ・一にかけた．実験方法の項で記載した溶媒A，B，C，を使用して展開し，異色したところ構成糖の大部分はグル コー・スであることが確認された． 3．β・・1，3・glucanase，α・amylaseおよぴglucoamylaseの作用 実験方法の項目に記救した3種類の精製酵素を 使用して，C、rO師i’iの多糖類溶液に配合し，その酵素作用を検討したい 活性がみられたのはβ−1，3−glucanaseのみ であり，α−amylaseおよびglucoamylaseには活性はみられなかった… しかも，β−1，3Nglucanase作用もラミナリン を基質とした作用液に比較すれば，初速度は140分の1にすぎなかった．24時間作用後もC．㌢0歩壱云の多糖類の分解 率は16％にとど■まった、したがって，本多糖類はβ一1，3−グルコシド結合を有していると考えられるが，その他の結 合様式も併せ持っているので，酵素作用が速かに停止されるものと判断された 4・多糖類溶液の粘牲 本実験で得られた多糖類は粗製品であり，その均一・性については今後の問題であるが， 溶液の高粘性は特性である．市販の粘性多糖類と比較して，その粘度を測定した結果をFig．4に示す．pH4、0，300C において0．1％以下の低濃度溶液で高い粘度を示したぃ pH8，0の溶液においても同様な結果が得られた． 5 0 ■．hU ∧‖︶ 5 22110 ︵。遥∵ご還○︺St・：還七皇s 0．2 040610 2。0304．0 10 20 30 ConcentratioI10f pol〉SaCClはri（lesいⅥg／nll） Fig”4．Relationshipofspeci負cviscosltytOCOnCentrationofvariouspolysaccharides． PolysaccharidesweredissolvedindeionizedwaterandtheirpHwasa句usted to4小0‖ TheviscositymeasuIementWaSCarriedoutat30OC． −○−glucanofC・rOU主ii，−△−PeCtin，一口ーCarboxymethylcc11ulose （CMC），−◎−tamarindseedpolysaccharide，−＠−dextran 考 察 Batra ら（1）はC．m掛存をグルコ・−ス，酵母エキス等を含有する培養基中で培養して，多糖類を得，これがβ−D− （トヰ3）−グルコシド結合を主鎖とし，側鎖にβ−D−（1−−＞6）一緒合のグルコー・ス残基を有していることを証明した．彼等 は酵母エキスを使用したのでチアミン含有培養基を使用したことになるが，その効果については明記していをい．・一 方BendeI・ら（12）は動肋ぬγ・ゎか肋血瀾がプルランを生産する際，その収率増加にチアミンが効果のあることを報告 した． 本研究においては，Cれ坤誠のβ−グルカン生産に対してチアミンが明らかに有効であることを証明した．菌の生 育に対して効果を示すのみをらず，多糖類の生産または菌体外分泌についても有効であることを示した．Cれ郷道は 単糖類を炭素源とするとき，その糖消費率が低い．とくにベントースのときに著しい．ヘキソースを使用するときも
第27巻第59号（1976） 137 この傾向は強く，本研究においてもグルコースの糖消費率は28％であるにすぎをいが，培養液にチアミンを添加する ときは始発グルコース濃度56％がほとんど消費しつくされた，この結果から分るとおり，チアミンの添加はグルコ、− スの代謝に必須であり，この薗がチアミン合成能を欠くことを示す．菌の生育にも有効であることば当然であると考 えられる．．しかし，本実験結果はチアミンの添加は糖代謝のみをらずグルカン合成，分泌にも効果があることを示し ている… このチアミン効果の機構は今後の研究課題であろう小 本研究で得られた多糖類ほβ−グルカンを中心とするものと考えられるが，とくにその高い粘性は注月すべきであ る… 現在，食品工業において使用されているペクチン，カルポキシメチルセルロ−ズ，タマリンド種子多糖類に比べ ても，なお枯性は高い．今後，応用面における研究の発展が期待される‖ 要 約 1．C．ro歩iiに属する13strainはチアミン添加培養基を用いた場合いずれも粘性β−グルカンを分泌した． 2，．Cγ0師友去IFO4476を用い，多糖類の生産条件を検討した．グルコ・−ス5％，ペプトン1％，NH4NO39，、05％， KH2PO。0，05％，MgSO4・7H200．02％，ZnSO】・7H200．0006％，チアミン塩酸塩500FLg／1（脱イオン水使用）が好適な 培養基であった、270C，7日尚の振とう培養により多糖類の分泌量は93g／1であり，対消費糖生産比率は22％であ った． 3… 本菌の多糖類の生産にはチアミンを培養基に添加することが必要であり，この添加は菌糸の生育のみならず， グルカン生産または分泌機構にも関連があると判断した． 内藤中人名誉教授に対サーる謝辞 当研究室においては1963年三国直世志君の卒業論文にCro雛∠−よをとりあげて以来，このかびの接化学的研究が進 展し，とくに酸性酵素群については多数の新知見が得られている．この発見の契機は内藤先生によるC70〝∫去去の分 譲であ った．．ここに同先生の退官記念号の出版に際して，当研究室の小論文を捧げ，深甚なる感謝の意を表する． stI・ainClO−2−1∼5を分譲下さった農林省農業技術研究所富永時任博士に感謝する． 文 （1）BATRA，K。K。，NoRDIN，J、H。andKIRKWOOD，S．．： Gユγあ0昂ydRe5，9，221（1969） （2）BusH，D．A。，and HoRIS】∋ERGER，M‥：ibid，22， 361（1972）
（3）REESEE‖T、，and MANDELS M∴ an．J 碓croあ∠−og．，5，173（1959）小 （4）NEISON，N．：Jβわg、αg∽，153，375（1944） （5）SoMOOYI，M∴ 去鉱弟160，61（1954） （6）DtJBOIS，Mリ GILIES，K。A．，HAMILION，．J，Kり REBERS，PLA。and SMITH，F‖：Anal．Chem．， 28，350（1956） 献 （7）梶 明，大崎武久，菅原 収：農化，45，278 （1971）． （8）TREVELYAN，W。E”，PROCTER，DいP．and HARRI soN，．丁．S∴．Ⅳ如∽喝166，444（1950） （9）SMITH，R．H．：βよ■ocゐe∽．J，57，140（1954）． （10）KAIT，AいandYosHIHARA，0．：4抄l”Microbiol．， 17，910（1969） （11）KAJI，A．andIcI‡IMI，T∴ よあよ’d，18，1036（1969） （12）BENDER，H，LEHMANN，J，andWALLENFEELS，K、： βわcゐ∠椚∴説噌々γS．Acぬ，36，309（1959）
香川大学農学部学術報告 138
