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論文の内容の要旨
氏名：長 崎 真 希
博士の専攻分野の名称：博士（歯学）
論文題名：Effects of LPS and high concentrations of glucose on zoledronate-induced RANKL/OPG
expression and PGE
2production in osteoblasts
（骨芽細胞におけるゾレドロネート誘導性の
RANKL/OPG
発現とPGE
2産生に及ぼすLPS
と高濃度グルコースの影響）
ビスフォスフォネートは破骨細胞性骨吸収を強く抑制し，
Paget
病や骨粗鬆症，悪性新生物の骨転移 などの治療で高い有効性を示す一方で，副作用としてビスフォスフォネート系薬剤関連顎骨壊死(bisphosphonate-related osteonecrosis of the jaw; BRONJ)
が問題となっている。BRONJ
のリスク因子とし ては，長期のビスフォスフォネート製剤の投与，全身的基礎疾患である糖尿病，喫煙習慣，観血的処 置，および歯周病などがあげられる。特に，窒素含有ビスフォスフォネート製剤であるゾレドロネー トは安定した骨吸収抑制作用を示すが，その長期投与はBRONJ
のリスク因子の1
つである。歯周病では，歯周病原菌の内毒素 (LPS) が歯周組織におけるマクロファージ，線維芽細胞，骨芽細 胞，破骨細胞による炎症性サイトカインやプロスタグランジン
E
2(PGE
2)の産生のトリガーとなる。ま
た，歯周病は糖尿病の合併症の一つであり，慢性的な高血糖による易感染状態と創傷治癒の遅延によ って歯周病の症状が悪化することが知られている。骨芽細胞は，receptor activator of NF-kappa B (RANK) ligand (RANKL)
とosteoprotegerin (OPG)
を産生し，破骨細胞の分化を調節している。すなわ ち，RANKLが破骨細胞前駆細胞に結合すると，破骨細胞への分化が促進する一方で，OPGはおとり 受容体としてRANKL
とRANK
の結合を阻害する。また，炎症性サイトカインやLPS
は，骨芽細胞のcyclooxygenases (COX)-2
の発現増加を介してPGE
2の産生を誘導することが，また，PGE
受容体(EP)
を介したPGE
2のautocrine
作用がRANKL
とOPG
の産生に影響することが知られている。ビスフォスフォネートは，破骨細胞のみならず骨芽細胞にも作用し，
BRONJ
の発症に関与すると考 えられる。しかし，BRONJ
のリスクとなる糖尿病と歯周病を併発する症例へのビスフォスフォネート の使用が，骨芽細胞に及ぼす影響の詳細は不明である。そこで本研究では，歯周病と糖尿病を想定し たLPS
と高濃度グルコースの存在下でのビスフォスフォネート刺激が，骨芽細胞のCOX-2，EP，
RANKL
およびOPG
の発現，ならびにPGE
2産生に及ぼす影響を調べた。さらに，PGE
2のautocrine
作用がRANKL/OPG
比に及ぼす影響を，COX-2
選択阻害剤であるNS398
を用いて検討した。本研究では，骨芽細胞様細胞としてヒト骨肉腫由来
MG-63
細胞を，ビスフォスフォネート製剤とし てゾレドロネートを用いた。MG-63
細胞を6-well
培養プレートに播種後コンフルエントになった時点 で，Porphyromonas gingivalis
由来LPS (1 µg/mL)，高濃度 (25 mM)
グルコースまたは ゾレドロネート(1×10
-8, 1×10
-7, 1×10
-6, 5×10
-6, 1×10
-5M)
を含む培地で24
時間培養し，細胞を刺激した。COX-2， EP2, EP4，
RANKL
およびOPG
の遺伝子発現をreal-time PCR
法で調べた。また，NS398 (10 µg/mL)
の存在下ま たは非存在下で細胞をLPS
，高濃度グルコースまたは ゾレドロネートで刺激した培養上清中のRANKL
とOPG
タンパク，ならびにPGE
2の濃度をELISA
法で調べた。COX-2
の遺伝子発現は，培養1，3，5
日目において未刺激 (コントロール) に比べて5×10
-6M
また は1×10
5M
のゾレドロネートで増加した。また，このゾレドロネート刺激によるCOX-2
の遺伝子発現 の増加は，培養3
日目の5×10
-6M
のゾレドロネートで最も顕著であった。そこで，細胞を刺激するゾ レドロネートの濃度は5×10
-6M
に，刺激の期間は3
日目として，LPS
と高濃度グルコースの存在下で のゾレドロネートの刺激がCOX-2
の遺伝子発現とPGE
2産生に及ぼす影響を調べた。その結果，ゾレ ドロネート の単独刺激に比べて，LPS
と高濃度グルコースの存在下でのゾレドロネート刺激でCOX-2
の遺伝子発現とPGE
2産生が増加した。さらに，NS398は，LPS と高濃度グルコースの存在下のゾレ ドロネート刺激によるPGE
2産生増加を阻害した。次に，
EP2, EP4
，RANKL
およびOPG
の遺伝子発現を調べた結果，RANKL
とOPG
の遺伝子発現は，LPS
と高濃度グルコースの存在下でのゾレドロネート刺激で増加し，LPS
と高濃度グルコースの有無2
にかかわらず，EP2と
EP4
の発現にゾレドロネート刺激の影響は認められなかった。RANKLとOPG
のタンパク発現は，LPS
と高濃度グルコースの存在下でのゾレドロネート刺激で増加し，NS398
はゾ レドロネート刺激によるこれらのタンパク発現増加を阻害した。タンパク発現量からRANKL/OPG
比 を算出したところ，コントロールとゾレドロネートの単独刺激に比べてLPS
と高濃度グルコースの存 在下でのゾレドロネート刺激でRANKL/OPG
比が増加した。これらの結果から，LPSと高濃度グルコースは，PGE2の
autocrine
を介してゾレドロネート刺激による
RANKL
とOPG
の産生を誘導することがわかった。また，この産生増加はOPG
に比べてRANKL
で優位であることが明らかとなった。すなわち，糖尿病と歯周病を併発する症例へのビスフォスフォ ネートの投与は，
