N 2 F i x a t i o n a n d G r o w t h o f C h r o m a t i u m s p . w i t h a n d w i t h o u t N H + / 4 A d d i t i o n

N2 Fixation and Growth of Chromatium sp. with and without NH+/4 Addition

Sang-Wook Moon* and Michiro Matsuyama

N2 fixation and growth of Chromatium sp., isolated from Lake Kaiike, were examined with and without NH+/4 addition. The bacterial N2 fixation was inhibited by exogenous NH+/4. Added NH+/4 was rapidly assimilated by the bacterium. The resumption of N2 fixation was found when NH+/4 was reduced to a level of 100 M.

Without the addition of NH+/4, the bacterium could grow. However, growth yield added with NH+/4 was larger than that without NH+/4 addition. Different growth yields between the two nitrogen sources seemed to be strongly related to light and H2S. A low light limited the bacterial growth on N2 resulting in the lowest of all the yields.

Intracellular sulfur was shown to be promotable to the bacterial growth on NH+/4 rather than that on N2.

Since the bacterial growth on N2 was expected to require more light and H2S than that on NH+/4, the bacterial N2 fixation at the site of original habitat in Lake Kaiike was suggested to barely maintain the bacterial number.

Chromatium sp., N2 fixation, NH+/4 addition, Growth yield.

108 Moon， Matsuyama： N2 Fixation and Growth Chromatium sp， with and without NH I Addition

 The bacterial numbers and its relative one containing in−

tracellular sulfur globules were quantified microscopically using aThoma hemacytometer． ln counting work， few drops of 10 oro formalin solution were used and enough for stopping the bacterial movement and the de novo deposition of in−

tracellular sulfur globules．iO）

  Measurement of the bacterial N2 fixation （C2H2 reduction method） was performed as previously described．ii）

  Measurement of NHI concentration was done by the Indophenol method．i2）

  Known volume of neutralized Na2S．9H20 solution was added to the bacterial suspension with a microsyringe．

Time−serial changes of H2S concentration in the bacterial suspension were determined by Cline method．13）

Results ＆ Discussion

 N2 fixation rate of Chromatium sp． in the different amounts of NH； （Ot−700 ptM） is shown in Fig． 1． The rate was decreasing with increasing NHI concentration， and com−

pletely inhibited by 700 ptM． Fig． 2 shows time−serial changes of NH： and H2S concentration in bacterial suspen−

sion， and formation of C2H4． The bacterium was shown to resume fixing N2 when NH； was reduced to a level of 100 ptM．

  Fig． 3 shows the bacterial growth with and without NH；

addition at light levels of 250 and 1000 lux， and concurrent bacterial consumption of H2S． Without the 一addition of NH；，

the bacterium could grow， but growth yield added with NHI was larger than that without NH； addition． Sig−

nificantly different growth rates were not observed， while apparently different growth yields at the same light intensity were found， showing those differences became larger in low light intensity． Different growth yields seemed to be strongly related to light and H2S， in connection with kinds of nitrogen sources used for the growth．

 At an high light intensity， difference of the bacterial num−

ber between both growths began to be large when H2S in suspension became depleted likely found in a stationary growth phase， shown in Fig． 3． ln NHI−growth at that period， a significnant increase in bacterial number was ob−

served， ascribed to the bacterial utilization of intracellular sulfur． However， those inctease in N2−growth was a slight one， which implied intracellular sulfur did not contribute much to a net increase in bacterial number．

  At a low light intensity， slow but， continuous growth was observed in NHI−growth， resulting in a high yield． Even af−

ter exhaustion of suspension s H2S the growth could be continued for another 3 days at an expense of intracellular sulfur． ln N2−growth， a decrease in growth rate even in the moderate presence of H2S concentration was found from the 4th day of the incubation （Fig． 3）． From that time， only a

 り         ヨ

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Fig． 1． Effect of NHI upon N2 fixation of Chromatizam sp． The bacterium grown on NHI at 1000 lux， were harvested        at exponential phase and washed by NHI−free medium （for details， see the text）． lnitially， H2S （1．5 mM） and        each NHI concentration were added to each bacterial suspension， and the experiment was started with        turning on the light （1000 lux）． Each NH； concentration of the bacterial suspension was as follows．

       e， Control （NHI was not added）； i， 50 ptM；  ， 100ptM； A， 200 ptM； V， 400 pM； ×， 700 ptM．

       Vertical bars denote standard deviation of two replicate samples．

Bull． Fac． Fish．， Nagasaki Univ．， Nos． 77 （1996） 109

4．0

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2

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Fig． 2． Effect of NHI upon N2 fixation of Chromatium sp． associated with change of H2S concentration at 1000 lux．

       Initial concentrations of added H2S and NH： at zero time were 4．6 mM and 313 ptM， respectively．

       e ， H2S concentrations； 一 ， NHI concentrations； O ， C2H4 formed．

       Vertical bars denote standard deviation of two replicate samples．

108

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︵丁哺E．・︒＝8︶            10

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Fig． 3． Changes of the bacterial number， relative abundance of sulfur−containg cells and H2S consumption in culture        of Chromatium sp． illuminated with 250 and 1000 lux． lnitial H2S concentrations were in the range of 2．2 to        2．4 mM． ln NH；一growth， NHI concentration of 2．3 mM was equally added to the bacterial suspensions．

       （e） Bacterial number grown at N2 and 250 lux． （一） NHi， 250 lux． （ ） N2， 1000 lux． （A） NH I， 1000 lux．

       （○   ○）Change of H2S concentration at N2 and 250 lux．（日   □）NHI，2501ux．（◇   ◇）N2，10001ux．

       （A−A） NH；， looo lux．

       （○  ○）Change of relative abundance of sulfur−containing cells grown at N2，2501ux．（ロ  ロ）NHI，

       250 lux． （Q−O） N2， 1000 lux． （A−A） NHI， 1000 lux．

NH+/4の添 加 有 無 に よるChromatium  sp.の 窒 素 固 定 お よび 生 長 文  尚郁 ・松 山  通 郎

貝池 か ら分 離 したChromatium spの 窒素 固 定 お よび生長 をNH＋／４ の添加 、無 添加 に よって調 べ た。 本菌 の窒 素 固定 は添 加 したNH＋／４ に よって阻害 された 。添 加 され たNH＋／４ は本菌 に よって迅 速 に 同化 され た。 窒素 固定 の 再 開は100μM以 下 の濃度 で進 行 した。

NH＋／４ の添加 が な くて も本 菌 は生長 したが、一 定期 間培 養 した後 の生 長量 は常 にNH＋／４ を添 加 した方 が 高 か った 。 そ れ ぞれ異 な る窒 素 源 に よる生長 量 の差 は光 及 びH2Sと 強 く関わ って い る と考 え られた。 低 照 度 は本菌 の窒素 固 定 に よる生長 を制限 し、最 も低 い生長 量 を もた ら した。 細胞 内い お う粒子 はN2生 長 よ りNH＋／４ 生長 に対 して よ り促進 効果 を示 した。

本菌 の窒素 固定 に よる生長 はNH＋／４ に よ る生長 に比較 し、 よ り多 くの光 お よびH2Sを 要 求 す る こ とか ら、 貝池

の 棲息地 におけ る本 菌 の窒素 固定 は辛 う じて菌 の個 体数 を維持 す る もの と推 察 され た。