第11回臨床遺伝情報検索講習会

(1)

2016年

ジェネティックエキスパート

認定試験の体験談

2017年6月11日第11回臨床遺伝情報検索講習会国立研究開発法人国立がん研究センター研究所基盤的臨床開発研究コアセンター・臨床ゲノム解析部門中央病院遺伝子診療部門牛尼美年子＃1

1.バックグラウンド（遺伝性腫瘍の遺伝学的検査に従事）

2.ジェネティックエキスパート認定試験に向けて

(2)

国立がん研究センター中央病院

遺伝相談外来（水・木曜日）

【発端者】【血縁者】・栃⽊県⽴がんセンター研究所・浜松医科⼤学・SRL、ファルコバイオシステムズ（⼀部の遺伝学的検査業務等）  遺伝カウンセリング  遺伝学的検査  サーベイランス等 #2

(3)

外来受診者数と遺伝学的検査数

（2017年3月31日現在）

44 43 42 53 45 38 43 56 30 30 31 41 52 52 64 94 110 124 175 35 21 21 30 19 21 9 18 ₁₆ 24 30 22 25 34 35 29 23 49 71 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 1 年目（1998FY) 2 年目（1999FY) 3 年目（2000FY) 4 年目（2001FY) 5 年目（2002FY) 6 年目（2003FY) 7 年目（2004FY) 8 年目（2005FY) 9 年目（2006FY) 10 年目（2007FY) 11 年目（2008FY) 12 年目（2009FY) 13 年目（2010FY) 14 年目（2011FY) 15 年目（2012FY) 16 年目（2013FY) 17 年目（2014FY) 18 年目（2015FY) 19 年目（2016FY)

• 1998〜2017年末までの受診者累計は、

1167家系・1,699名

• 約64%（1091名）に遺伝学的検査を実施

（2000年6⽉以降の集計）主な疾患受診者受検者(%) リンチ症候群（Lynch） 475 367(77) 網膜芽細胞腫（RB） 411 249(61) 遺伝性乳がん卵巣がん（HBOC） 408 257(63) 家族性⼤腸腺腫症（FAP） 220 150(68) 上記以外の遺伝性腫瘍（疑い含） 118 68(58) 発端者⾎縁者発端者⾎縁者 [受診者] [受検者] 2004-2005年 HBOCファルコ受託研究 2009年9⽉位〜内視鏡からのMSI検査開始 2011年9⽉〜 RB先進医療検査開始(認可2009年） 2013年5⽉頃 Angelina Jolieさんの報道 2013年12⽉〜卵巣がん治験開始 2014年9⽉〜乳がん治験開始 2015年5⽉〜 NCC oncopanel FC v1.0 開始＃3

(4)

Blood sampling DNA・RNA extraction DNA

PCR/Direct sequencing RT-PCR direct sequencingRNA

Positive Negative MLPA Positive Negative Mutation identified Positive Negative FISH Positive Negativ e Mutation identified Mutation identified (Mosaic) Negative cases (incl. SNP) Mutation identified

Check DNA test results （including

MLPA-positive ）

No pathogenic mutation identified Check other test

results Check other test results 5ʼ 3ʼ 1 2 3 4 7 8 10 13 16 17 18 19 20 23 25 P

 4.7kb mRNA coding a protein with 928 amino acid residues.

Ex1 ~ Ex8 _{Ex6 ~ Ex16} Ex10 ~ Ex18 _{Ex17 ~ Ex23} _{Ex21 ~ 3ʼ} : Regions analyzed

Direct sequencing

網膜芽細胞腫に対する遺伝学的検査実施

#4

• 13q14.1-14.2, >180kb, 27 exons (31~1,889bp) and 26 introns (80~71,712bp).

1日

2日

(5)

dHPLC(WAVE)

Sangar法

RT‐PCR/direct sequencing

PTT陽性（異常バンドの検出）

T A A



APC gene ; 5q21‐q22, >180kb,CDS 8532bp

Based on accession number ; NG_008481.4

1

4 6

.

18 1 12 PTT 3日（Protein Truncation Test） PTT（+）対象領域の RT‐PCR 2日 direct sequencing Genomic DNA 2日 direct sequencing MLPA 2日

PT2

PT6

PT5

PT4

PT3

PT7

A T T A T C A T C T T CDS

MLPA

FAPに対する遺伝学的検査実施

#5

(6)

HBOC, LS, FAP, RB

以外の

遺伝性腫瘍疑いの

外来受診者数と遺伝学的検査数

（2017年3月31日現在）

＃6 0 5 10 15 20 25 0 5 10 15 20 25 1 年目（1998FY) 2 年目（1999FY) 3 年目（2000FY) 4 年目（2001FY) 5 年目（2002FY) 6 年目（2003FY) 7 年目（2004FY) 8 年目（2005FY) 9 年目（2006FY) 10 年目（2007FY) 11 年目（2008FY) 12 年目（2009FY) 13 年目（2010FY) 14 年目（2011FY) 15 年目（2012FY) 16 年目（2013FY) 17 年目（2014FY) 18 年目（2015FY) 19 年目（2016FY) 発端者⾎縁者発端者⾎縁者 [受診者] [受検者] 若年性⼤腸がん 10名リ・フラウメニ症候群（LFS）5名カウデン症候群（CS) 4名家族性膵がん 3名若年性膵がん若年性多発⼤腸腺腫遺伝性びまん性胃がん（HDGC）胃腺がんおよび近位胃ポリポーシス（GAPPS）

脂肪⾁腫唾液腺がん（Salivary grand cancer)

肝多発⾎管筋脂肪腫 VHL LS or HBOC

[2015年4⽉以降その他の遺伝性腫瘍疑いで検査を受けた⼈の内訳] *LFS or HBOC/CS or HBOCの重複3

(7)

A:Other genes being tested at NCCH

ATM EPCAM PRKAR1A

BARD1 FANCC RAD50

CDK4 FANCG RAD51B

CHEK1 MRE11A RAD51C

CHEK2 PALB2 RAD51D

D: OMIM、CGC (germline),

Illumina TruSight Cancer,

etc.

B:ACMG (Cancer)

C: NCCN guidelines（Colorectal,

Gastric, Breast-Ovarian and

Pancreatic cancers)

APC（E1,

promoter） MET POLE

AXIN1 MUTYH RB1_(promoter)

AXIN2 NF1 TP53 CDH1 PMS2 VHL MEN1 POLD1 BRCA1 NF2 SDHD BRCA2 PTEN STK11 MLH1 RET TGFBR2 MSH2 SDHAF2 TSC1 MSH6 SDHB TSC2 NBN SDHC WT1

121 遺伝⼦

（v1.0）

遺伝性腫瘍探索のためのNGS：NCC oncopanel FC

#7



¥46,000, average depth=400

HiSeq 2500 Rapid Mode, 96

samples/run



¥80,000, average depth=300

MiSeq , 6 samples/run



¥53,000, average depth=1000

NextSeq, 24 samples/run

 Reagents for capture, library construction and NGS run only. Cost for other general consumables, human resource, equipment maintenance and bioinformatics not included.



¥46,000, average depth=400

HiSeq 2500 Rapid Mode, 96

samples/run



¥80,000, average depth=300

MiSeq , 6 samples/run



¥53,000, average depth=1000

NextSeq, 24 samples/run

 Reagents for capture, library construction and NGS run only. Cost for other general consumables, human resource, equipment maintenance and bioinformatics not included.

D74

C:15

B:18

A:14

147 遺伝⼦

（v2.0）

(8)



解析範囲条件

Coding エクソン＋UTRs＋5ʼUTR＋3ʼUTR

（イントロン25塩基を含む）



121遺伝⼦（123 ターゲット）

2262regions／24767probes



プローブサイズ 891kbp

Agilent, SureDesignによるプローブのカスタム

#8

version1.0

(9)

150ng gDNAをコバリスで断片化アダプタ付きDNA断片 (500ng) ハイブリダイゼーションバッファー溶液中で24時間ハイブリダイゼーションストレプトアビジン磁性ビーズビオチン化cRNAのBaits (120base) サイズ確認と定量後シークエンシングへキャプチャーされたDNAだけを回収、濃縮、増幅

●Agilent,SureSelect

●Illumina

MiSeq：150base PE

HiSeq 2500：Rapid Run

100base PE

NextSeq ：150base PE

ターゲットエンリッチメントシステム（Capture Sequence）

(10)

Clinical Sequencing Data Analysis Integrator (csDAI)

#10

CSV file

Variant position AA substitution

on reference Gene Clin_Var COSMIC

HGMD HGVD,ToMMo,NCC

dbNSFP



アミノ酸置換がSplicing、Frameshift、Stopgain、Stoplossである



ClinVar においてPathogenic / Likely pathogenic / Drug responseの登録がある



COSMICに登録がある



HGMDにおいてDM / DM? としての登録がある



dbNSFP の予測において⼀つでもDeleterious判定がある



下記のいずれかを満たすVariantのみが出⼒される



みずほ情報総研株式会社とNCCの共同開発のシークエンスのQC解析



バリアント毎のアノテーションレポート（CSVファイルとPDFファイルで出⼒）機能をもつアプリケーション

APC:NM_000038:exon16:c.2987G>A:p.S996N

nonsynonymous

(11)

臨床遺伝情報検索講習会の受講



病的原因と考えられる可能性のあるVariant/変異が検出されても、容易に判断が出来ない

#11

http://www.congre.

co.jp/gene/index.html

テーマ：

• CNV評価時のポイント

• がん関連遺伝⼦情報検索 COSMIC

• 遺伝⼦バリアントの表記法

• 遺伝性腫瘍

• 次世代シークエンサーによる単⼀遺伝性疾患

の遺伝⼦解析の実際と注意点について

等

(12)

ジェネティックエキスパート試験の受検

(13)

頻繁に参考としたWEBサイト（臨床について）

#13

 GeneReviews ⽇本語版：

http://grj.umin.jp/

 OMIM (Online Mendelian

Inheritance in Man):

http://omim.org/

 ⽇本⼈類遺伝学会

染⾊体異常を⾒つけたら：

http://www.cytogen.jp/index/ind ex.html

(14)

頻繁に参考としたWEBサイト（Variantについて）

#14

 HGMD (The Human

Gene Mutation

Database)

http://www.hgmd.cf.ac.u k/ac/index.php

 OMIM

 ClinVar

External links

(15)

その他に参考としたWEBサイト

#15

 TOGO TV⽣命科学系データベースの使い⽅

⽂部科学省統合データベースプロジェクト → バイオサイエンスデータベースセンター http://togotv.dbcls.jp/ja/

テーマ：

• Ensemblの使い⽅〜配列を取得する〜

• UCSC genome browserの使い⽅

• NCBI BLASTの使い⽅

(16)

その他の講習会

＃16

 家族性腫瘍学会家族性腫瘍セミナー



遺伝演習基礎（家系図作成等）



がん遺伝学総論



遺伝カウンセリング概論



臨床各論



倫理



ロールプレー



遺伝統計

（遺伝学的リスク評価等）

近畿⼤学主催

(17)

その他に参考とした書籍

＃17

 医療に役⽴つ遺伝⼦関連Web情報検索

⼿とり⾜とり教えますガイド

中⼭智祥著メディカルサイエンスインターナショナル

 トンプソン＆トンプソン遺伝医学

（現在第2版）

福嶋義光監修メディカルサイエンスインターナショナル

(18)

まとめ

＃18