Jpn. I. Oral Biol., 37: 152-161, 1995.
原
著
酸化電位水 による殺菌効果 と変異原性 の検討
浅 井 昭 士 郎 山 村 正 次 野 田 充 宏 高 瀬 市 將 平 田 健 一* 滝 永 一*南 晋 介*青 野 正 男*磯 貝 昌 彦**並 河 勇 朝 日大 学 歯 学 部 口腔 細 菌 学 講 座(主 任:並 河 勇 教 授) *朝 日大 学 歯 学 部 歯 科 保 存 学 第1講 座(主 任:青 野 正 男 教 授) **朝 日大 学 歯 学 部 口腔 外 科 学 第2講 座(主 任:兼 松 宣 武 教 授) 〔受 付:平 成6年11月30日,受 理:平 成7年1月30日 〕Antimicrobial effects of high oxidation potential water on various microorganisms and an evaluation of mutagenicity of the water
Shojiro Asai, Masatsugu Yamamura, Mitsuhiro Noda, Ichio Takase, Kenichi Hirata*, Eiichi Taki*, Shinsuke Minami*, Masao Aono*, Masahiko Isogai** and Isamu Namikawa
Department of Oral Microbiology, School of Dentistry, Asahi University (Chief: Prof. Isamu Namikawa)
*Department of Operative Dentistry
, School of Dentistry, Asahi University (Chief: Prof. Masao Aono)
**Department of Oral and Maxillofacial Surgery
, School of Dentistry, Asahi University (Chief: Prof. Nobutake Kanematsu)
1851 Hozumi, Hozumi-cho, Motosu-gun, Gifu Prefecture 501-02, Japan •k Received on November 30, 1994; Accepted on January 30, 1995•l
Key words: high oxidation potential water/killing effect/saliva/disinfectants/mutagenicity
Abstract: The purpose of this study was to examine the germicidal effect of the high oxidationpotential water (HOPW) on oral microorganisms, including pathogenic fungi, and the inhibitory effect of other factors such as whole saliva on this killing action of HOPW. In addition, we also evaluated the germicidal effect of HOPW on oral bacteria that had adhered to the impression material from a full mouth impression, and the mutagenicity of HOPW. Of the 12 bacterial species tested including MRSA, S. mutans, and T. rubrum, all microorganisms were killed by HOPW in 15 sec, except B. subtilis. B. subtilis, which is a spore-forming bacteria, was not affected by HOPW until 30 min. The killing potency of HOPW was similar level to that of other disinfectants, such as chlorhexidine gluconate (0.1%), sodium hydrochlorite (4%) and ethyl alcohol (70%). The killing action of HOPW was inhibited by adding yeast extract at a concentration of greater than 1% or whole saliva.
HOPW had no significant germicidal effect on oral microorganisms that had adhered to impression material. This result may be due to the inhibitory effect of organic substances found in oral fluid .
HOPW exhibited non-mutagenicity by the umu-test.
These results indicate that HOPW may be a very useful disinfectant in dental clinics due to its strong killing action.
抄 録:酸 化電 位水 を供 試 し,真 菌 を含 む 口腔 細菌 な どの微生 物 に対 す る殺 菌効 果 につ いて検討 した。 また,酸 化電 位水 に対 す る汚 染混 合唾 液 な どの影 響,さ らに,口 腔 か らの採得 印象 材 に付 着 した 口腔細 菌 に対 す る殺 菌効 果 お よび酸化電 位 水の変 異原 性 の有無 につ いて も検 査 した。
12菌 種 の 供 試 菌 の う ち,酸 化 電 位 水 の15秒 間 の 処 理 で, B. subtilis 以 外 のMRSA, S. mutans, T. rubrum 等
す べ て の 微 生 物 は殺 菌 され た 。 しか し,芽 胞 形 成 菌 のB. subtilisは,30分 間 以 内 ま で殺 菌 さ れ な か っ た 。 酸 化 電 位 水 と他 の 消 毒 薬,グ ル コ ン酸 ヘ キ シ ジ ン(0.1%),次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウム(4%),エ チ ル ア ル コ ー ル (70%)と の 比 較 で は,い ず れ も15秒 間 処 理 で 殺 菌 され,酸 化 電 位 水 は,他 の 消 毒 薬 と同 等 の 消 毒 効 果 を 示 した 。 イ ー ス トエ キ ス(1%以 上)お よ び混 合 唾 液 は,酵 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 を著 し く阻 害 した 。 採 得 印 象 材 に付 着 した 酸 化 電 位 水 の殺 菌 効 果 は,効 果 的 な作 用 を示 さ な か っ た。 こ の事 実 は,口 腔 液 中 の 有 機 物 が 影 響 し て い る 可 能 性 が 考 え られ た 。 umuテ ス トを 用 い た 試 験 の 結 果,酸 化 電 位 水 の変 異 原 性 は認 め ら れ な か っ た 。 以 上 の 結 果 か ら,酸 化 電 位 水 は 歯 科 診 療 に お い て,従 来 の 消 毒 薬 と比 較 して も遜 色 の な い消 毒 効 果 を示 し,安 全性 の あ る 有 用 性 の 高 い消 毒 薬 と し て 使 用 で き う る と考 え ら れ る。 緒 言 近 年,抗 生 物 質 に耐 性 を獲 得 した メ チ シ リン耐 性 黄 色 ブ ドウ球 菌(MRSA)に よ るMRSA感 染 症 やAIDS,血 清 肝 炎 等 の ウ イ ル ス 性 疾 患 の 院 内 感 染 が 重 大 な 問 題 と な っ て い る1,2)。 医 療 担 当者 に お い て は,常 時 これ らの 病 原 微 生 物 に よ る感 染 防 止 の た め,医 療 施 設,器 材 また 手 指 等 を消 毒 し な けれ ば な らな い 。 その た め,消 毒薬 に よ る ア レル ギ ー や皮 膚 の炎 症 等 の対 策 に苦 慮 して い る。 現 在 まで に,開 発,使 用 され て きた 消 毒 薬 は,人 体 に対 す る毒 性,刺 激 性,過 敏 症 誘 発 な どの 為 害 性 や器 具類 に対 す る腐 食 性, 消 毒 薬 の 排 出 等 に よ る公 害 な どの 欠 点 を有 して い た 。 そ こで,生 体 に対 す る毒 性 が少 な くて,し か もこれ ら の疾 患 を引 き起 こす微 生 物 に対 して効 果 的 な 殺 菌 お よ び 殺 ウ イル ス剤 と して の 消 毒 薬 の 開発 が 望 まれ て い る。 最 近,奥 田 ら3)は,食 塩 を添 加 した水 道水 を電 気 分 解 す る こ とで 得 られ るpH2.5以 下,酸 化 還 元 電 位1,100mV 以 上 の 酸 化 電 位 水 が,各 種 ウ イ ル ス,細 菌,真 菌 な ど に 対 して 消 毒 効 果 を示 し,か つ,人 体 の皮 膚 等 に も安 全 に 使 用 で き る と報 告 して い る。 そ の後,こ の 酸 化 電 位 水 の 各 種 微生 物 に対 す る消 毒 効 果 に つ い て の研 究報 告 が 散 見 され る よ う に な った4∼7)。 しか し,歯 科 領 域 で対 象 と な る微 生 物 に対 す る酸 化 電 位水 の消 毒 効 果 や 口腔 と関連 が 深 い唾 液 等 の 蛋 白 質 の 影 響 に つ い て の研 究 報 告 は極 め て 少 な い。 そ こで,本 研 究 で は各 種 微 生 物 お よ び各 種 口腔 細 菌 に 対 す る本 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 を検 討 し,各 種 使 用 条 件 に つ い て検 討 した 。 さ らに,生 体 に対 す る酸 化 電 位 水 の 安 全 性 を調 べ るた め,umu-テ ス トを キ ッ ト化 した ウム ラ ッ ク に よ り,酸 化 電 位 水 の変 異 原 性 に つ い て も検 討 を加 えた8)。 材 料 お よ び方 法 1. 供 試 菌 メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌(MRSA), Staphylococcus aureus G67,G86,G112,G120;メ チ シ リ ン感 受 性 黄 色 ブ ドウ球 菌(MSSA),S. aureus 209P, 23266, 23295; S. haemolyticus JCM 2416; Pseudomonas aeruginosa CZT-1, ATCC 7700; Strepto-coccus mutans LM-7, OMZ-175, ATCC 25175; Escherichia coli ATCC 25922: Candida tropicalis ATCC 750, C. albicans ATCC 18804, C. glabrata ATCC 2001; Epidermophyton floccosum TIMM 0343, Tricho-phyton mentagrophytes TIMM 1189, T. rubrum TIMM
2659;お よ び Bacillus subtilis IAM 1114の8属,12菌
種 の 合 計21菌 株 を使 用 した 。 2. 供 試 消 毒 薬 市 販 消 毒 薬 は,グ ル コ ン 酸 ク ロ ル ヘ キ シ ジ ン(5%ヒ ビ テ ン 液 住 友 製 薬),エ チ ル ア ル コ ー ル(ナ カ ラ イ テ ス ク),次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム(キ シ ダ 化 学)お よ び グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド(キ シ ダ 化 学)を 使 用 し た 。 3. 供 試 酸 化 電 位 水 pH2.5で 酸 化 還 元 電 位1,100mV以 上 を 示 す 酸 化 電 位 水 を 酸 化 電 位 水 生 成 器(日 本 イ ン テ ッ ク 製,035型)か ら 採 取 し,使 用 し た 。 4. 殺 菌 効 果 試 験
Brain Heart Infusion(BHI,Difco)寒 天 培 地 で18時
154 歯 基 礎 誌37:152-161,1995. を 酸 化 電 位 水 の0.9ml接 種,15,30,60,120,180秒 間, お よ び,10,30,60分 間 そ れ ぞ れ 作 用 後,0.6%チ オ 硫 酸 ナ ト リ ウ ム(ナ カ ラ イ テ ク ス)1ml加 え 反 応 を 止 め た 。 そ の 後,BHI broth培 地(5ml)に0.5ml加 え,37℃, 48時 間 培 養 し,菌 増 殖 の 有 無 で 殺 菌 効 果 を 判 定 した 。 た
だ し, E.floccosum,T. mentagrophytes,T. rubrum に
つ い て は,培 地 は す べ て サ ブ ロ ー培 地(日 水 製 薬)を 使 用 した 。 5. 酸 化 電 位 水 と各 種 消 毒 薬 の 殺 菌 効 果 との 比 較 酸 化 電 位 水 の効 果 を各種 消 毒 薬 と比 較 す るた め に,前 述 した 殺 菌 効 果 試 験 と同様 な方 法 で,グ ル コ ン酸 ク ロル ヘ キ シ ジ ン(0.1%),エ チ ル アル コ ー ル(70%)お よ び 次 亜 塩 素 酸 ナ トリ ウム(4%)を そ れ ぞ れ,各 種 菌 液 と 一 定 時 間 作 用 させ た後 ,た だ ちにBHI broth培 地 に加 え,培 養 後,判 定 した. 6. 蛋 白 質 添 加 の 影 響 健 康 成 人 女 子2名(21歳 お よ び33歳)の 口 腔 に 自然 に 貯 留 させ た 混 合 唾 液 を そ れ ぞれ 試 験 管 に採 取 し,等 量 で 混 合 した 唾 液 を遠 心 し(3,000rpm),沈 澱 物 を取 り除 い た後,上 清 を ミ リポ ァー フ ィル タ ー(ポ ァー サ イ ズ0.22 μm)で 濾 過 した。この 無 菌 混 合 唾 液 お よび イ ー ス トエ キ ス(Difco)を,無 菌 生 理 食 塩 液 で段 階希 釈 後,そ れ ぞれ の0.1mlに 酸 化 電 位 水0.9mlを 試 験 管 に加 え,混 和 後, さ ら に各 種 調 整 菌 液20μlを 添 加,混 和 し反 応 させ た 。 次 に,各 作 用 時 間 ご との 酸 化 電 位 水 の殺 菌 効 果 に対 す る 影 響 を判 定 した。 7. 印 象 採 得 材 料 に付 着 した 微 生 物 に対 す る酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 印 象材 とし て ア ル ギ ン酸 印 象 材(G-C社)を 用 い た 。 対 照 消毒 薬 と して,グ ル タ ー ル アル デ ヒ ド(2%)を 使 用 した。 被 験 者 は健 康 成 人 男 子2名(29歳 お よ び48歳)で,酸 化 電 位 水 とグ ル ター ル ア ル デ ヒ ド処 理 の消 毒 効 果 判 定 の た め に,口 腔 の 有 歯 下 顎 を対 象 と し て,そ れ ぞ れ 個 別 に 行 っ た。 口腔 無 洗 浄 の 被 験 者 の有 歯 下 顎 を前 記 印 象材 料 で 採 得 し,た だ ち に,そ の 印 象 材 を400mlの 酸 化 電 位 水 お よ び被 験 消 毒 薬 液 中 に それ ぞ れ,5分 間 浸 した 。 次 に,取 り出 した 印 象材 の 表 面 の部 分(5mm2)を 滅 菌 綿 棒 で 擦 り,こ の 綿 棒 を10mlの 滅 菌 生 理 食 塩 水 に浸 し,菌 浮 遊 液 を調 整 した。 菌 浮 遊 液 の0.1mlをBHI寒 天培 地 に塗 抹 し,37℃,48時 間培 養 後,形 成 した コ ロ ニ ー数 を算 定 し,対 照 消 毒 薬 と比 較 し,酸 化 電 位 水 の殺 菌 効 果 を調 べ た。 8. 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 に対 す る保 存 方 法 の 影 響 酸 化 電 位 水 を採 取 直 後 の もの と,採 取 後8日 間 にわ た り,遮 光 密 閉(4℃),開 放 遮 光(4℃),遮 光 密 閉(室 温) お よび 開放 遮 光(室 温)の 状 態 で 容 器 に そ れ ぞ れ 保 存 し た酸 化 電位 水 に つ い て P.aeruginosa ATCC 7700, S.
aureus 209P お よ びE. coli ATCC 25922の 菌 株 に対 す
る殺 菌 効 果 を調 べ た 。
9. 各pH域 に 調 整 した酸 化 電位 水 の 殺 菌 効 果 採 取 直 後 の 酸 化 電 位 水 のpHを,pH3.5,4.5,5.5お よ び6.5にpHメ ー タ ー(Compact pH meter, HORIBA) を 用 い て,1N NaOHで 調 整 した 液 を そ れ ぞ れ 作 製 した 。 これ らの 各pH域 の 酸 化 電 位 水 の 各 種 菌 株 に対 す る殺 菌 効 果 を 前述 の 方 法 と同様 に検 討 した 。な お,対 照 と して, 蒸 留 水 に1N HCIを 加 え,pH1.5お よ び2.5に そ れ ぞ れ 調 整 した 強 酸性 液 を作 製 し,強 酸 性 下 で の各 種 微 生 物 に 対 す る殺 菌効 果 を検 討 した。 10. 変 異 原 性 試 験 酸 化 電 位 水 の 変 異 原 性 はumu-テ ス トを キ ッ ト化 した ウ ム ラ ッ ク(大 塚 製 薬 徳 島)に よ り検 討 した 。 本 キ ッ トは,ネ ズ ミチ フ ス 菌( Salmonella typhimurium TA 1535/pSK 1002)を 用 い て,DNA損 傷 時 に誘 導 され る SOS反 応 を検 出 す る系 で あ る。 この キ ッ トを使 用 し,以 下 の手 順 に よ り試 験 を行 っ た 。 本 キ ッ ト付 属 の菌 凍 結 乾 燥 菌 に培 養 液2mlを 加 え, 37℃ で4時 間 培 養 を行 った 。 こ の間,酸 化 電 位 水(検 体) を溶 媒(10% DMSO)で 倍 数 希 釈 し,希 釈 系 列 を作 成 し た。そ の 各10μlを マ イ ク ロ プ レ ー トの ウエ ル(well)に そ れ ぞ れ 分 注 した。培 養 を終 了 した 菌 液 に は,さ ら に18 mlの 培 養 液 を加 え,そ の100μlを 各 ウ エ ル に分 注 した。 な お,変 異 原 物 質 の 中 に は そ の ま まで はDNAに 損 傷 を 与 えな い が,菌 体 内 で代 謝 され て初 め て 変 異 原 性 を示 す もの が あ る。 した が って,代 謝 活 性 を必 要 とす る場 合 の 変 異 原性 も評 価 す るた め,ラ ッ トの肝 臓 か ら調 整 され た S-9を 残 りの 菌 液 に10%の 割 で 加 え,そ の100μlを 各 ウ エ ル に分 注 した。37℃ で2時 間 培 養 した後,全 ウエ ル に100μlの 発 色 基 質 を加 え,さ らに,1時 間 培 養 し,SOS 反 応 に よ り菌体 内 に 産 生 さ れ た β-ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ 活 性 を分 光 光 度 計(OD655)で 測 定 した 。 また,ウ ム ラ ッ ク に は 陽 性 対 照 物 質 と して,代 謝 活 性 を 必 要 とす る2-aminoanthracene(2AA)お よ び代 謝 活 性 を必 要 と しな
Table 1 Germicidal effect of high oxidation potential water on microorganisms
a MRSA
, methicillin-resistant S. aureus; b MSSA, methicillin-susceptible S. aureus;
c
-, absence of growt; d+, growth; e Cont., without HOPW
いfurylfuramide(AF-2)の2種 類 の 変 異 原 物 質 が あ
り9,10),こ れ ら に つ い て も 同 じ プ レ ー トで 検 査 し た 。
結 果
1. 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果
MRSA, P, aeruginosa, S. mutans, C. albicans お よ び
T. rubrunを 含 む11菌 種(20株)は15秒 処 理 で 殺 菌 さ れ た 。 し か し,B. subtilisの よ う な 芽 胞 形 成 菌 は30分 間 処 理 後 ま で 殺 菌 さ れ な か っ た(Table 1)。 2. 酸 化 電 位 水 と 各 種 消 毒 薬 と の 殺 菌 効 果 の 比 較 酸 化 電 位 水 と 同 様 に,グ ル コ ン 酸 ク ロ ル ヘ キ シ ジ ン (0.1%),エ チ ル ア ル コ ー ル(70%)お よ び 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リ ウ ム(4%)は, S. aureus 209P, S. aureus G86
(MRSA)お よ び P. aeruginosa ATCC 7700に す べ て15
秒 間 処 理 で 殺 菌 が 認 め ら れ た(Table 2)。 3. 蛋 白質 添 加 の影 響 イ ー ス トエ キ スの1%以 上 で酸 化 電 位 水 を処 理 す る と 酸 化 電 位 水 の殺 菌効 果 は阻 止 され た(Table 3)。 ま た, 混 合 唾 液 で酸 化 電位 水 を処 理 す る と殺 菌 効 果 は阻 止 さ れ た。 しか し,5倍 に希 釈 した 混 合 唾 液 の処 理 で は,殺 菌 効 果 に影 響 は認 め られ なか っ た(Table 4)。 4. 印 象 採 得 材 料 に付 着 した微 生 物 に対 す る酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 形 成 され た コ ロニ ー 数 で5分 間処 理 の 殺 菌 効 果 を判 定
156 歯 基 礎 誌37:152-161,1995.
Table 2 Bactericidal effects of high oxidation potential water and other disinfectants on
micro-organisms
a HOPW
, high oxidation potential water; b-, absence of growth; c+, growth.; d Cont., without
HOPW.
Table 3 Inhibitory effect of yeast extract on the killing action
by high oxidation potential water
a Exposure time
, 15 sec; b-,absence of growth; c+, growth.;
d Cont ., without HOPW.
Table 4 Inhibitory effect of saliva on the killing action by high oxidation
potential water
a•~1
, original saliva; b•~5, five-fold dilution of saliva;
C+
Table 5 Germicidal effect of high oxidation potential water on the
oral microorganisms adhered to impression materials
from the full dental mouth of individuals
*Exposure time: 5 min.
**Note: After taking dental impression from the lower jaw of the two individuals, the impression materials were immersed in 400 ml of high oxidation potential water or glutaraldehyde (2%) for 5 min, respectively. The organisms were harvested from the impression materials of the area per 5 mm2 by the sterile cottons and suspended in 10 ml of sterile physiological saline. The bacterial suspension (0.1 ml) was used for examining the number of bacterial colonies in Petri dish.
Table 6 Bactericidal effect of high oxidation potential water on microorganisms
in conditions of preservation
a-, absence of growth; b +, growth. c, Cont., without HOPW.
*Note: After creating high oxidation potential water
, the water was divided into the
four parts and kept in vessel with or without stopper at different temperatures. The
bactericidal effect of the water were examined at exposure time of 15 sec.
す る と,酸 化 電 位 水 処 理 で は1.3×107cells/5cm2,グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド(2%)処 理 で は ゼ ロ,対 照 の 無 菌 生 理 食 塩 液 で は,細 菌 数 は,1.9×107cells/5cm2で あ っ た (Table 5)。 し た が っ て,酸 化 電 位 水 処 理 に よ る5分 間 処 理 の 口 腔 細 菌 の 減 少 率 は,31.6%で あ っ た 。 こ れ に 対 し,供 試 消 毒 薬 の グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド処 理 で は,同 一 条 件 下 で完 全 に殺 菌 さ れ る こ とが 認 め られ た。 5. 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 に対 す る保 存 方 法 の 影 響 採 取 直 後 お よび8日 間,ビ ンの 開 口 部 を密 閉 遮 光 保 存 (4℃)し た 酸 化 電 位 水 は, P. aeruginosa ATCC 7700, S.
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Table 7 Germicidal effect of the high oxidation potential water adjusted at different pH ranges on microorganism
a- absence of growth; b
,+, growth.
aurreus 209P お よび E. coli ATCC 25922 す べ て に殺 菌
効 果 を示 した 。 しか し,同 じ8日 間 保 存 した場 合 で も, 4℃ で 開 放 保 存,ま た,室 温 で 開放 お よ び密 閉 保 存 の い ず
れ の 場 合 に お い て も, P. aeruginosa 以外 には殺菌効 果 を
示 さ な か っ た(Table 6)。
6. 各pH域 に お け る酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果
供試菌株, P. aeruginosa ATCC 7700, S. aureus 209P, E. coli ATCC 25922, C. albicans ATCC 18804, S.
mutans LM-7 のMcF0.5の 菌 濃 度 に 調 整 した溶 液 を酸
化 電 位 水 で15秒 間 処 理 した 。そ の 際,殺 菌 され たpH域 は,4.5以 下 で, P. aeruginosa, E. coli, C. albicans, S.
mutans の 菌 種 で あ っ た 。 ま た,pH2.5の 溶 液 の 処 理 で
は,す べ て の 供 試 菌 が 殺 菌 さ れ た 。
一 方,pH3.5の 溶 液 で は,pH4.5と 同 様 に P.
aerugi-nosa, E. coli, C. albicans, お よび S. mutans が殺菌 さ
れ た 。 し か し,S. aureus は 殺 菌 さ れ な か っ た(Table 7)。
7. ウ ム ラ ッ ク に よ る変 異 原 性 試 験
酸 化 電 位 水 の 変 異 原 性 を ウ ム ラ ック に よ り調 べ た。 Figure 1Aお よ び1Bは 陽 性 対 照 のAF-2お よ び2AA のβ-ガ ラ ク トシダ ー ゼ 活 性 を 示 す 。AF-2は 代 謝 活 性 を 必 要 とせ ず,0.1μg/mlで 最 高 の β-ガ ラ ク トシ ダー ゼ活 性 を示 す こ とが認 め られ た。 また,2AAは,代 謝 活 性 を 必 要 とす る系 で 濃 度 の 上 昇 に伴 い,β-ガ ラ ク トシダ ー ゼ 活 性 が 上 昇 し,変 異 原 性 を有 す る こ とが 認 め られ た 。 し か し,被 験 液 の酸 化 電 位 水 は,キ ッ ト付 属 の代 謝 活 性 化 用 のS-9の 添 加 の 有 無 に か か わ らず,い ず れ の 濃度 にお い て も β-ガ ラ ク トシ ダー ゼ活 性 の 上 昇 を示 さ な か った (Fig.1C)。 この 結 果 は,酸 化 電 位 水 に変 異 原 性 が な い こ とを示 し て い る。 考 察 今 回 の 実 験 で 供 試 した 酸 化 電 位 水 は,水 道 水 に電 解 促 進 剤 と して 約0.05%の 食 塩 を添 加 し,電 気 分 解 した強 酸 性 水 で あ りpH2.5以 下,酸 化 還 元 電 位 は1.100mV以 上 で,溶 存 塩 素(20∼30ppm)お よ び溶 存 酸 素(15∼20 ppm)を 含 んで い る。 この酸 化 電 位 水 の殺 菌 機 構 は明 確 に され て い な いが,強 酸 性,高 い酸 化 還 元 電 位 お よ び溶 存 塩 素 が組 み 合 わ さ っ て,強 力 な殺 菌 効 果 を発 揮 して い る もの と考 え られ て い る11)。 今 回 の 実 験 成 績 か ら,従 来 の 報 告 と同様 に,芽 胞 形 成 菌 以 外 の ほ と ん どの 細 菌 お よ び 真 菌 は,酸 化 電 位 水 に よ って15秒 以 内 の処 理 で,殺 菌 さ れ る こ とが確 認 され た。 岩 沢 ら6)およ び 清 水 ら5,11)は,酸化 電 位 水 が コ ク サ ッ キ ー ウイ ル ス,エ ン テ ロ ウ イ ル ス,単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス お よび イ ン フル エ ン ザ ウ イ ル ス に殺 ウ イル ス効 果 が あ る こ と を報 告 し て い る。 また 安 倍 ら12)は,HBs抗 原 の抗 原 性 の検 出 方 法 を用 い て,HBウ イ ル ス に も殺 ウ イ ル ス 効 果 が あ る可 能 性 を報 告 して い る。 現 在 まで の 研 究 報 告 と著 者 ら の今 回 の 成 績 か ら,本 酸 化 電 位 水 は,芽 胞 形 成 菌 に は効 果 は 弱 い が,歯 料 領 域 で 問 題 とな る ほ とん どの微 生 物 に消 毒 効 果 が あ る こ とが 確 認 され た 。 塩 素 系 消 毒 薬 は,芽 胞 を除 く各 種 微 生 物 に殺 菌 効 果 が あ り,HBウ イ ル ス,HIVな どの各 種 ウ イ ル ス を不 活 化 で き る。 また,耐 性 菌 は獲 得 さ れ難 い とい わ れ て い る。 これ らの 事 実 か ら,本 酸 化 電 位 水 は,今 後,著 者 らが
A
B
C
Fig. 1 ƒÀ-Galactosidase activity of furylframide (A),
2-aminoanthracene (B), and high oxidation potential
water (C). -●-●- ,+S-9;-〇-〇-,-S-9 示唆 した よ うな 工 夫 を す れ ば,理 想 的 な消 毒 薬 に 一 歩 近 づ い た もの とな りう る と考 え られ る。 従 来,用 い ら れ て きた グ ル コ ン酸 ク ロ ル ヘ キ シ ジ ン (0.1%),エ チ ル ア ル コー ル(70%)お よび 次 亜 塩 素 酸 ナ ト リウム(4%)な どの消 毒 薬 と酸 化 電 位 水 の殺 菌 効 果 を比 較 し,消 毒 薬 と酸 化 電 位 水 の 両 者 の 殺 菌 効 果 に は ほ とん ど差 異 は な く,本 酸 化 電 位 水 は,十 分 消 毒 薬 と して 利 用 で き うる もの と考 え られ る。 酸 化 電 位 水 の殺 菌 効 果 に及 ぼ す 蛋 白質 の影 響 を調 べ る た め に,ヒ トの 口腔 か ら汚 染 混 合 唾 液 を採 取 し,濾 過 滅 菌 した濾 液 お よび イ ー ス トエ キ ス を事 前 に,菌 液 に添 加 した 系 とで殺 菌 効 果 を調 べ た 。 そ の結 果,蛋 白 質 の 存 在 は,そ の 濃 度 に よ っ て は著 し く殺 菌 効 果 が 阻 止 され る こ とが 確 認 され た 。 岩 沢 ら13)はイ ー ス トエ キス(0.0005%) の 存 在 で,P.aeruginoSa,MRSAな どに対 す る殺 菌 効 果 が 阻 止 され る と報 告 して い る。 今 回 の 結 果 よ り,そ の濃 度 は低 い が,こ れ は使 用 菌 液 の 濃 度,イ ー ス トエ キ ス の 製 造 会 社 や ロ ッ ト等 の 違 い に よ る もの と考 え られ た。 従 来 唾液 の影 響 に つ い て は報 告 は ほ とん どな か っ た が,今 回 の 成績 か ら,唾 液 が 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 に対 して 阻 止 的 に作 用 す る こ とが 明 らか に認 め られ た。した が っ て, 口腔 内 で 本 酸 化 電 位 水 を使 用 す る際 に は,唾 液 を含 めた 口腔 液 等 の有 機 物 と して の蛋 白質 の影 響 を排 除 す るた め に,大 量 の酸 化 電 位 水 で,洗 い 流 す よ う に し て使 用 す る 必 要 が あ る と考 え られ る。 印 象採 得 材 料 に 付 着 した 微 生 物 に対 す る酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 を調 べ る と,消 毒 薬 の グル タ ー ル ア ル デ ヒ ドは 100%殺 菌 で き るが,本 酸 化 電 位 水 は約30%ぐ らい し か 殺 菌 で き なか った 。 これ は,酸 化 電 位 水 が 印 象 材 と直 接 反 応 して,殺 菌 効 果 が 減 少 した か,口 腔 液 中 の 有 機 物 が 口腔 細 菌 を覆 っ て い るた め,あ るい は 口腔 細 菌 の 中 に, 酸 化 電 位 水 の殺 菌 作 用 に抵 抗性 の 菌 種 が 存 在 す るた め な どが考 え られ る。 歯 科 診 療 に 際 して 印 象 採 得 材 料 の消 毒 は,一 般 にHB ウイ ル ス お よびHIVな どを対 象 と して,グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド,次 亜 塩 素 酸 ナ トリウ ム,ヨ ウ素 剤 お よ び フ ェ ノー ル 等 が 用 い られ て い る14,15)。 今 回 の成 績 か ら,歯 科診 療 で 本 酸 化 電 位 水 を積 極 的 に 印 象 採 得 材 料 の 消 毒 薬 と して 使 用 す る た め に は,各 種 印 象 材 の表 面 を 直 接 効 果 的 に消 毒 す る よ うな 工 夫 と酸 化 電 位 水 処 理 後 の 印 象 材 表 面 再 現 精 度 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て も今 後 一 層 検 討 が 必 要 とな ろ う14)。 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 に対 す る保 存 方 法 の影 響 を調 べ る と,8日 間 低 温 で ビ ン開 口部 を密 閉,遮 光 保 存 を し た 際 に は,酸 化 電 位 水 は充 分 殺 菌 力 を保 持 して い た 。 この 結 果 は,酸 化 電 位 水 を低 温 で 密 閉 遮 光保 存 す る こ とが 基 本 的 に大 切 で あ る こ とを示 して い る。 著 者 らの報 告 と同 様 に,芝 ら16)は,低 温 で の 密 閉 ・遮 光 保 存 が 最 も良 好 な も
160 歯 基 礎 誌 37: 152-161, 1995. の で あ る と述 べ て い る。 今 回 の 実 験 に用 い た 本 酸 化 電 位 水 生 成 器 か ら生 成,採 取 され た 酸 化 電 位 水 はpH2.5以 下 で あ るが,こ のpH域 で は 口腔 内 で 長 期 間 にわ た っ て使 用 す る と酸 脱 灰 が 起 き る こ とが 想 定 され る。 その た め,少 しで もpH域 は 中性 付 近 に近 づ く方 が 良 い 。歯 科 領 域 で の 使 用 を考 え る場 合, エ ナ メ ル 質 酸 脱 灰 が,pH5.4以 下 で起 こ る とい う事 実 を 考 慮 し な けれ ば な らな い。 一 時 的 な 口 腔 内 で の 使 用 な ら ば,た だ ち に 問題 とな る こ とで は な い が,今 後 長 期 に わ た って,本 酸 化 電 位 水 を使 用 す る な らば,そ のpHは5.5 以 上,あ る い は そ の 付 近 のpHの 酸 化 電 位 水 の 使 用 が望 まれ る。 そ こで,酸 化 電 位 水 は そ のpH域 を2.5以 上 に上 げ る た め に は,生 成 器 か らの 分 当 た りの 流量 を多 くす れ ば, pHの 高 い液 を得 られ る。 しか し,そ の 際,溶 存 す る塩 素 お よび 酸 素 量 は減 量 す る と報 告 さ れ て い る16)。 そ こで,著 者 ら は,1N NaOHを 酸 化 電 位 水 に添 加 し て,各pHを 示 す 酸 化 電 位 水 調 整 液 を作 製 した。本 液 で, 各 種 細 菌 に対 す る殺 菌 効 果 を調 べ る と, S. aureus 以外の
P. aeruginosa, E. coli, C. albicans, S. mutans は,pH4.5 以 下 の 酸 化 電 位 水 で殺 菌 され た。 岩 沢 ら4)はMRSA,P aeruginosa, Serratia marcescens に もNaOHで 調 整 し た酸 化 電 位 水 に よ る殺 菌 効 果 を報 告 して い る。 これ らの こ とか ら,歯 科 診 療,特 に 口腔 内 で 用 い る酸 化 電 位 水 は 生 成 器 の 構 造 の改 造 を行 い,溶 存 塩 素 や溶 存 酸 素 濃 度 を 通 常 用 い る強 酸 性 水 と同 等 あ る い は高 濃 度 に す る こ とが 必 要 で あ る。 酸 化 電 位 水 生 成 器 で 酸 化 電 位 水 を生 成 す る際,使 用 す る水 道 水 に 食 塩 を最 終 濃 度0.05%に な る よ う に 添 加 す る が,こ の 食 塩 の濃 度 を変 え る こ とで溶 存 塩 素 の 濃 度 が 変 化 す るの で,食 塩 の濃 度 を高 くし,溶 存 塩 素 を 高 濃 度 に す る。 この よ うに す れ ば,消 毒 効 果 と併 せ,一 方 で は エ ナ メ ル 質 酸 脱 灰 の危 惧 も少 し は解 決 で き る か も知 れ な い し,ま た 口腔 内 で の利 用 に安 全性 が 高 ま る こ とが考 え られ る。 これ らの理 由 か ら,今 後,酸 化 電 位 水 のpHを 上 げ て 効 果 的 な酸 化 電位 水 の 生 成 を試 み る価 値 が あ る こ とを 示 して い る。 umu -ƒe ƒX ƒg ‚Í,umu C 遺伝子 とい う突然変異 に直接 関 与 す る遺 伝 子 の 発 現 をみ て い る とい う点 で 突 然 変 異 の 本 質 に よ り近 づ い た 系 で あ る。 umu -テ ス トは大 腸 菌 の DNA損 傷 時 に誘 導 され るSOS遺 伝 子 の う ち突 然 変 異 に直 接 関 与 して い る umu- 遺 伝 子 の 発 現 を β-ガ ラ ク ト シ ダ ー ゼ 活 性 を指 標 と して 簡 便 に検 出 す る方 法 で あ る。 ま た,本 テ ス トの 特 徴 は,一 つ の 試 験 菌 株 で 種 々 の作 用 機 序 を もつ変 異 原物 質 を検 出 で き る こ と と,栄 養 源 な ど を含 む,尿 や血 液,食 品 な どの被 験 体 もそ の ま ま簡 単 に テ ス トで き る点 で あ る17,18)。 本 テ ス トを用 い て 酸 化 電 位 水 の 変 異 原 性 を2段 階 希 釈 で64倍 まで 調 べ て も,ど の 希 釈 段 階 で も β-ガ ラ ク トシ ダ ー ゼ 活 性 の上 昇 は認 め られ ず,酸 化 電 位 水 に は 変異 原 性 の な い こ とが 明 らか に な っ た。 これ は in vitro の デ ー タ で は あ るが,極 め て 信 頼 性 の高 い もの で,本 酸 化 電 位 水 の 生 体 に対 す る高 い安 全 性 を示 す 指 標 で もあ っ て,生 体 に対 す る傷 害 リス クが ほ とん どな い と考 え られ る。 今 回 の 実 験 結 果 か ら,手 指,歯 科 用模 型,フ ァイル, リー マ ー,床,壁,器 具,ス ピ ッ トンお よび イ ン プ ラ ン ト材 な どの 消 毒 に十 分 利 用 で き る と考 え られ る。さ ら に, 今 後 生 体 に対 す る細 胞 毒 性 が な い こ とな ど確 実 な安 全 性 が認 め られ れ ば,う が い水,歯 肉 炎 や歯 周 炎 部 位 の 洗 浄 水,抜 歯,外 科 処 置 時 の除 菌 ・洗 浄 水 お よび 根 管 内 洗 浄 水 等 に幅 広 く利 用 され る と考 え られ る。 この よ うな観 点 か ら,本 酸 化 電 位 水 は,今 後,院 内 感 染 防 止 や環 境 衛 生 施 策 に活 用 が 期 待 さ れ る。 結 論 1. 酸 化 電 位 水 の 効 果 15秒 間 の 処 理 時 間 で,殺 菌 され た 供 試 菌 株 は21株 中 20株 で あ っ た。 殺 菌 され な か っ た 一 株 は 芽 胞 形 成 菌 の B. subtilis で あ っ た 。 し か し, B. subtilis で も60分 間 処 理 す れ ば,殺 菌 され る こ とが 認 め られ た。 2. 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 に対 す る蛋 白質 の影 響 1） 唾 液 の影 響:殺 菌 効 果 が 阻 害 さ れ た 。 2)イ ー ス トエ キ スの 影 響:1%以 上 の 添加 で 殺 菌効 果 が 阻 害 さ れ た 。 3.酸 化電位 水の保存方法 に よる殺菌効果 への影響 1) P.aeruginosa ATCC 7700, S. aureus 209P で は, 酸 化 電 位 水 採 取 後,8日 間 まで は,4℃ で 密 閉 遮 蔽 の状 態 で の 保 存 で も,採 取 直 後 と同 等 の殺 菌効 果 が 認 め られ た。 し か し, E. coil ATCC 25922 で は,同 条 件 で 完 全 に は 殺 菌 され な か った 。 4. 印 象 採 得 材 料 に付 着 した 微 生 物 に対 す る酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 グル タ ー ル ア ル デ ヒ ド(2%)処 理 は100%の 殺 菌 効 果 が 認 め られ た が,酸 化 電 位 水 処 理 は約30%の 細 菌 数 の 減 少効 果 しか認 め られ な か っ た 。
5. 各pH域 に調 整 した 酸 化 電 位 水 の 殺 菌 効 果 酸 化 電 位 水 のpHを3.5,4,5,5.5お よび6.5と 調 整 した液 で は,pH3,5∼4.5で はP.aeruginosa,E.coli, C.albicansお よ びS.mutansは15秒 処 理 で殺 菌 され た 。しか し,S.aureusは15秒 間 処 理 で は殺 菌 され な か っ た 。pH5.5以 上 で は.い ず れ の 供 試 菌 株 も殺 菌 され な か っ た。 6. 酸 化 電 位 水 の 変 異 原 性 ウ ム ラ ッ ク を 用 い た 酸 化 電 位 水 の 変 異 原 性 試 験 結 果 は,陰 性 で,本 酸 化 電 位 水 に変 異 原性 は認 め られ なか った 。 以 上 の結 果 よ り,本 酸 化 電 位 水 は芽 胞 形 成 菌 以 外 の広 範 囲 の消 毒 効 果 を示 した 。 しか し,唾 液 な どの 存 在 で消 毒効 果 が 阻止 され るの で,臨 床 的 に は酸 化 電 位 水 を大 量 に使 用 す る必 要 が あ る。 一 方 ,酸 化電位水 には変異 原性 は示 されず,生 体 に対 す る安 全 性 は 高 い と考 え られ る。 酸化 電位 水 は,今 後 歯 科 診 療 で 消 毒 薬 と して の有 効 性 が 期待 され る。 稿 を終 え るにあた り,酸 化電位 水生 成器 の提供 をいただ いた ウイラ ・コーポ レー シ ョン(株)な らびに 日本 イ ンテ ッ ク(株)に 心 よ り感謝 の意 を表 します。 なお,本 研究 の要 旨 は,第99回 岐 阜歯科 学会例 会(平 成 6年9月17日)で 発 表 した。 文 献
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