酵母Lipomyces starkeyi IAM4753の栄養要求性 利用統計を見る

酵母Lipomyces starkeyi IAM 4753の栄養要求性

（昭和46年9月13日受理）

秋山翹一

兎東保之

田中健太郎

Nutritional Requirements for Growth of a Yeast

Lipomyces starkegi IAM 4753

KyoichiAKIYAMA YasuyukiUZUKA KentaroTANAKA

       Synopsig       ↓  Nutritional requirements for growth at 30°C， pH 6．2∼6．3， in chemically defined liquid media under aerobic condition of a yeast Lipomyces starkeyi IAM 4753 have been studied．  Biotin is essential to support normal growth and trace elements stimulate growth rate of the organism．

1．緒

言   LiPomyces starkeyiは， R． L． Starkey1）が土壌中  より発見した子のう酵母で，菌体中に多量の脂質を脂  肪球として蓄積する性質を有する。しかしStarkeyの ．報告以来約20年経過しているにもかかわらず，この菌  に関する学術的興味は主として分類学の分野2｝A’5）にと  どまっており，生理的，あるいは生化学的研究は，断  片的なもの6’ ”’8）が散見されるにすぎない。   われわれは，このL伽卿cθsstarleayiの増殖に伴  って菌体中に脂肪球が形成され，肥大する過程を菌体  内器官（organelle）の分化，発達としてとらえ，これ  を微生物生理学あるいは，生化学的手法を用いて解明  することを最終的な目的としている。   R・L・Starkeyは， L・starleeyiの脂肪球脂質の生  産量を大きくする目的で，培地組成に検討を加えた。  その結果，無機塩と，ブドウ糖および酵母エキスを含  み，pH 6．0に調整した培地が，これに最も適すると  した。   本研究においては，このStarkey半合成培地中の  酵母エキスに含まれる各種栄養素のうち，L． starleayi   ＊日本農芸化学会 昭和46年度大会にて発表。 の生育にとって必須栄養物質となっているものを明ら かにすることを目的としている。        2．実 験 方 法  2．1供試菌株  LiPomyces starleeyi IAM 4753  2．2 使用培地  1） 半合成培地  R．L・Starkeyが脂質生産培地 として報告した液体培地の一部を改変したもので，組 成はつぎのとおりである。  グルコース 3．0％， KH2PO40．1％， （NH4）2SO4  0．5％，MgSO，・7H200．05％， CaCI2・7H20， NaCl  おのおの0．001％，酵母エキス0．1％  2） グルコース・ミネラル培地  半合成培地から 酵母エキスを除き，trace elementsを添加したものと した。なおtrace elementsの培地ll中の添加量は つぎのとおりである。   H3BO3500μg， CuSO4・5H2040μg， Kl 100μg，   FeCl3・6H20， Na2MoO4・2H20おのおの200ptg，   MnSO4・H20， ZnSO4・7H20おのおの400μg  3） 完全合成培地  グルコース・ミネラル培地に， 核酸塩基，アミノ酸，ビタミンを添加したものとし

昭和46年12月 山梨大学工学部研究報告 _第22号 た。なお核酸塩基，アミノ酸，ビタミンの添加量は， Wickerhamg），高橋1°）， Brackenli）らの報文を参照し て以下のごとく定めた。  核酸塩基：アデニソ，グアニン，キサンチン，ウラ シルおのおの10mgを培地11中に添加した。  アミノ酸：アラニソ，アルギニン・HCI，アスパラギ ン酸，シスチソ，グルタミン酸，グリシソ，ヒスチジン HC1・H20，ロイシン，イソロイシソ， リジソ・HCI， メチオニン，フェニルアラニン，プロリン，セリソ， スレオニン，トリプトファン，チロシン，バリンおの

おの50mg。これら18種のL型アミノ酸（グリシソ

を除く）を培地11中に加えた。  ビタミソ：ビオチン2μg，イノシトール2，000μg， p一アミノ安息香酸（PABA），リボフラビソおのおの 200μg，パントテン酸カルシウム，ニコチソ酸アミ ド，ピリドキシン・HCI，チアミン・HCIおのおの 400μgを培地ll中に添加した。  4） その他の合成培地  完全合成培地からおのお の1種の栄養成分を除いた培地，あるいはグルコース ・ミネラル培地に1種の栄養成分を加えて，合成培地 とした。詳しくはそのつど示す。  いずれの培地も1N水酸化カリウム溶液を用いて pH 6．2∼6．3に調整した。  栄養物質の要求性の判定は，半合成培地と，完全合 成培地の生育状態を基準として，それぞれの合成培地 の生育を比較して，特にexPonential Phase開始時期 によってその栄養素の必要性を判定した。 いずれの培地も，あらかじめ重クロム酸硫酸混液で処 理した500 ml振湯フラスコ（坂ロフラスコ）・に100ml まで注入し，綿栓して115°C，10分間オートクレープ で滅菌して実験に供した0  2．3 培養方法  供試菌株は，麦芽エキス2．5％，i寒天1．5％の斜面 培地上に30°C，3日間生育させたのち10°Cにて保 存した。  前々培養：この保存培地より，半合成培地に2白金 耳接種して，30°C，48時間振蓋培養（120strokes／ min）した。  前培養：半合成培地に0．D．660 mμで0．01（約 6×105cells／ml）になるように植えつぎ，前々培養と 同じ条件で24時間培養した。  本培養：前培養液を室温にて3，500rpm，5分間遠 心して集菌し，採取量とほぼ等量の滅菌蒸留水で2回 洗浄遠心したのち，菌体を蒸留水に懸濁し，これを本 培養培地に0．D．．660 m，cLで0．01になるよう、に接種し た。同一試料について2∼3本を平行して培養した。 培養条件は，前々培養，前培養と同じで，培養開始時 から24時間おきに無菌的に培養液を採取した。各試料 は，一定量を3，500rpm 5分間遠心して上澄と菌体区 分に分け，菌体区分は，蒸留水を用いて洗浄遠心を2 回行なったのち，蒸留水に再懸濁し，660mμにおけ る濁度を測定した。 3．実 験 結 果  3．1Trace elementsの要求性  完全合成培地からtrace elementsを除くと， exPo・ nential phase開始時期は，半合成培地，完全合成培 地と差はないが，その後の生育速度が遅れ，最終菌体 量は著しく減少した（図一1）。  3．2 有機栄養物質（核酸塩基，アミノ酸，ビタミ    ン）の要求性  半合成培地および完全合成培地では24時間目には， exPonential Phaseが開始するのに比し，グルコース・

ミ14

』 旦 ∩ 10

0

1

2     0      50     100    150     200       −hrs．  △一△ Complete medium  ●  ● Semi defined medium  ロー□ Complete medium−trace elements 図一1 Trace elementsの影響 Fig．1 Effect of trace elements on the growth． 言 量

2

1

_／

∠二・

／

／

o＿」《b，一      50     100     150     200     250       −hrs．  △一△ Complete medium  ●一● Semi defined medium  ◎一◎ Glucose miheral medium 図一2 有機物質の影響 ’ Fig．2 Effect of organic、nutrients on the growth

ミ14

ξ 旦

2

1

     50     100    150    200    250       −一・hrs． △一△ Complete medium ●一● Semi defined medium O−O Complete medium−nucleic acids 口  口 Glucose mineral medium十nucleic acids ㊦一◎ Glucose mineral medium 図一3 核酸の影響 Fig．3 Effect of nucleic acids on the growth． ミ

量14

；1°

い

2      ム

   ／n△∨・ざL。i（°『一

ノ  ノ

  0     50    100    150    200    250

      −hrs．

△一△ Complete medium ●一● Semi defined medium O−O GIucose mineral medium十vitamins ロー□ Complete medium−vitamins ◎  ◎ Glucose mineral medium 図一5 ビタミソの影響 Fig．5 Effect of vitamins on the growth．

314

量 き1°

16

2

   ／一△、÷プー一一

  0      50     100     150     200     250

      −hrs．

△一△ Complete medium ●一一● Semi defined medium O−O complete medium−aminO acids ロー□ Glucose mineral medium十amino acids ◎一◎ Glucose rpineral medium， 図一4 アミノ酸の影響 Fig．4 Effect of amino acids on the growth ミネラル培地では，100時間以上の長い1ag phaseを 経てから徐々にexPonential Phaseカミ開始することか ら，この菌は有機栄養物質を要求することを認めた （図一2）。  そこで核酸塩基，アミノ酸，ビタミソのおのおのに ついて詳細な検討を行なった。  3．3 核酸塩基の要求性  完全合成培地から核酸塩基を除いても，、，生育曲線 は！一ほぼ完全合成培地の生育曲線に等しく，またグル コース・ミネラル培地に核酸塩基のみを添加しても， 生育は促進されなかった。（図一3）。  この2マρ結果から，核酸塩基はこの菌にとって必 須栄養物質でないと考えられた。   ．、  3．4 アミトノ酸の要求性  完全合成培地と，そこから1isptのアミノ酸を除いた 合成培地では，exponential ph4se開始時期が，ほぼ 等しくなった。一方，グルコース・ミネラル培地とこ れに18種アミノ酸を添加した合成培地における生育 は，いずれも長い1ag phaseを必要とした（図一4）。  その結果18種のアミノ酸は，いずれも必須栄養物 質でないと考えられた。  3．5 ビタミンの要求性  グルコース・ミネラル培地に，ビタミンを添加した 合成培地では，exPonential Phase開始時期が完全合 成培地のそれとほぼ等しくなった。しかし，完全合成 培地からビタミンを除いた培地における菌の生育は長 い1ag phaseの後にはじめてはじまった（図一5）。  これらの結果から，使用したビタミン中に，この菌 の生育に関する必須栄養物質が含まれていることが明 らかになった。そこで使用したビタミン9種のうち何 が，必須栄養物質であるかを詳細に検討した。  表一1には，おのおの1種ずつビタミソを除去したビ タミン欠合成培地における生育を培養開始後64時間目 の濁度で示した。表一2には，グルコース・ミネラル 培地におのおの1種のビタミンを添加した合成培地に おける生育を88時間目の濁度で示した。  ビオチンを除去すると，ほとんど生育を示さず（表一 1．），ビオチンを添加すると，完全合成培地とほぼ同様 に生育がはじまっていたe（表一2）。これらの事実から L・starkeyi IAM 4753はビオチンを要求することが 明らかとなった。 4． 考 _察  Lψo〃2ycζs starleeyiに関する分類学的あるいは形 態学的研究は，いくつか報告2） ’一 5）されており，それに 伴って培地組成に検討が加えられている。まk，この 菌は多量の脂質を脂肪球として菌体内に蓄積する性質

昭和46年12月 山梨大学工学部研究報告 第22号 表一1種々のビタミン欠培地における64時間後の   L．starkeyiの生育 TabPe l Growth of L． starkeyi， after 64 hours，     in the absence of various vitamins．

Medium

G．M．＊    （Control No．1） Complete M．＊＊（Control No．2） Complete M．−biotin Complete M．−Ca・pantothenate Complete M．−niacin Complete M．−thiamine・HCl Complete Mrpyridoxine・HCl

Complete MrPABA

Complete M．−ribo且avin Complete Mrfolic acid Complete M．−inosito1 Turbidity O．D．（660mμ）  0．02   5．71   0．92  10．20   8．57   6．32   7．04   5．05   5．97   5．61 l

I5・36

＊glucose mineral medium ＊＊medium 表一2種々のビタミン添加培地における88時間後   のL．starlleyiの生育 Table 2 Growth of L． starkeOri， after 88 hours，     in the addition of various vitamins．

Medium

O．D．（660mμ）Turbidity

た。しかし，本研究で使用した栄養物質検索用の培地 は，Slooffの採用した培地とはpHが異なっており （SlooffはpH 5．2∼5．6），さらに培養温度も一致して いない（Slooffは25°C）○酵母のビタミン要求性は 培養温度によって異なることは，すでに報告13）されて いることであり，またわれわれの研究室の知見では， L．sta，rleeyiのビオチン要求性は培地のpHによって も変化する14）。これらのことより，L． starleeyi IAM 4753は，30°C，培地pH 6．2∼6．3で培養したとき， ピオチソを要求すると結論するのが最も正しいであろ う。  図一5において明らかなように，ビタミソ無添加の 培地中でも，100時間以上にわたる長いlag phaseの 後に生育が開始された。この長い1ag phaseの間に 菌はビオチンの合成能を獲i得して生育を開始したもの と考えられる。  図一4において，完全合成培地を含めてアミノ酸を 添加した培地における生育の最終菌体収量が常に高か った。多量の有機窒素源が最終菌体収．量を高めたもの と考えられる。 G．M．＊    （Control No．1） Complete M．＊＊（Control No．2） G．M．十A．A．＊＊＊十biotin G．M．十A．A． G．M．十A．A． G．M．十A．A． G．M．十A．A． G．M．十A．A． GM．十A．A． G．M．十A．A． G．M十A．A． 一トCa・pantothenate 十nlacln 十inositol 十 thiamine ． HCI 十pyridoxine・HCl

十PABA

十riboflavin 十folic acid 0．75 13．21 6．99 0．12 0．25 0． 35 0．39 0．．42 0．12 0．05 0．18

5．結

言  LiPomyces starkεyi IAM 4753の生育に関する栄 養要求性を検索した。  30°C，pH 6．2∼6．3の培地を用い，振濃培養をし たとき，ピオチンを要求することが明らかとなった。  Trace elementsは本菌の増殖速度を高めた。  本研究を行なうにあたり種々有益なご助言を賜わり ました山梨大学工学部醸酵化学研究施設の後藤昭二助 教授に深謝致します。  ＊glucose mineral medium ＊＊medium ＊＊＊amino acids があるので，脂質の生産手段として利用することが考 えられており，この目的にあった培地の検討uも行な われている。しかしそのいずれを見てもL・starleeyi の正常な生育に必要な栄養物質という点からは，明確 な考察が行なわれていない。        ．  本研究の進行途上に，Slooff12｝は，酵母分類学の立 場からL．stαrhayiの標準記．載事項を発表し，本菌は ビタミン無添加培地中における生育が，“positive or negative”とし，さらにnegativeな菌株ではビオチ ソが必須栄養素であると述べている。  本研究の結果から，供試菌株L．starkeyi IAM 4753 はビオチン要求性菌株に属することが明らかになっ 1） 2） 3） 4） 5） 文 献 R．L． Starkey：Lipid production by a soil yeast， J． Bacterio1．，51， p．33−50、（1957） J．Lodder and N． J． W． Kreger’Van Rij： The Yeast， A taxonomic就udy， p．338， North− Holland publishing company， Amsterdam （1967） C．Roberts：Observation on the yeast Lipo・ 〃2yces， Nature，17g， p．1198−1199（1957）「 G．H、 Conner， C． E． Skinner and R． C． Hurd： Lipo〃zyces sταγ〃綬ソi on the skin surface of the htiman body， Mycologia，46， p．12−15 （1954） M．E． Slodki and L． J． Wickerham：Extra・ cellular polysaccharrides and” clas・i fication of the genus LipomYces， J． Gen． Microbiol．，42， p．381−385 （1966）

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