海水より分離した寒天分解菌について

著者

日高 富男, 鮫島 宗雄

雑誌名

鹿児島大学水産学部紀要=Memoirs of Faculty of

Fisheries Kagoshima University

巻

3

号

1

ページ

158-164

別言語のタイトル

Studies on the Agar-decomposing Bacteria

Isolated from Sea-water

158

海水より分離した寒天分解菌について

日 高 富 男･鮫 島 宗 雄

Studies on the Agar-decomposing Bacteria isolated from Sea-water

Tomio HIDAXA and Muneo SAMESIMA

拷

liiJ 微生物による寒天分解現象は種々の寒天分解菌に関する記載には見られるが,寒天分解 酵素に関する報告は比較的少い.該酵素に関する従来の研究を見ると, GRANl) (1902)は Bac. glalicusに,大島2)(1931)は-ゾアワビ内臓に,森3)(1939)がサザエの消化管に 各iその存在を認めて居る.更に最近門田4)(1951)はVibrio burbreusより粗酵素液 を調製して該酵素の一般性質を明かにし,右舷5) (1952)はVibrio agarliquefacicnsに ついて酵素と培養条件の関係について報告して居る.著者等はアサクサノl)の磯燐現象を 追及申その葉体表面よりの分離菌7株中2株の寒天分解菌(Bacト5及びBacト7と仮称) を認めた.これらの寒天分解菌につきその性状性質即ち発育及び液化に対する最適培養条 件を調べ,更に粗酵素液を調製しその一般性質を研究したのでその結果を報告する. 実  験  の  部 Ⅰ.分離菌の性状 1) Bach-5 形態学的性質:短棒状,発端は円形, 0.8-1.OFLXl.0-1.6fL(0.8FLXl.2fL)･ 4FL内外の 単極毛を具え活掛こ運動す.胞子を形成せず, GRAM陰性･ 培養上の性質: (25'C, 7日間培養) 肉汁寒天平面一発育中庸,直径約4mmの瑛円形,湿光を有し不透明黄褐色を呈す･表 面は稽褒状で隆起し周縁は波状. 肉汁寒天割線一発育中庸,刺刺状,菌苔は膜状で固く粘性がある.平面培養と共に衆落 発生後5日目から菌苔の周辺より寒天を溶解し始め溝を作るが,寒天液化物の増加は著し くない. 肉汁寒天穿利一発育貧弱にして液化も認められず･ Gelatin穿利一発育せず. 肉汁一僅かに-様な潤濁.液表の発育は環状,少量の黄白色膜状沈澱を生ず･ 牛乳一変化なし. 馬鈴薯一発育せず. 生理的性質:硝酸塩を亜硝酸塩に還元するが微弱であり, 】もS, NH3は生産せず･

炭素源一Glucose, Sucrose, Lactose を利用するが酸又はGasを形成せず, Starch,

化のみを認む.

窒素源一NaNO3, (NH.)2SOJ, ･ Peptone,Asparagine,Aspartic acidを利用するが

Ureaは利用しない. 遊離酸素に対する性質一好気性. 分離源: 1952年4月鹿児島市の養殖海苔･ 特性:寒天を液化分解し還元糖を生産する･ 2) 石act-7 形態学的性質･.長梓帆先端は円形,やや轡曲せる細胞を混在す･ 0･6-0･8iLX4･0-8･OfL (0.8FLX6.4fL). 2-3FL の周毛を具し緩慢なる運動性を有す･胞子を形成せず, GRAM睦 悼. 培養上の性質: (25℃, 7日間培養) 肉汁寒天平面一発育中風直径5 mm程度の叛円形で湿光を有し不透明樫黄色･発育初 期には帯紅色の, 3-5日後には帯緑色の蛍光を有す･表面平滑,偏平で周縁は金縁･ 肉汁寒天割線一発育中庸,刺林状で薗苔の質は牛酪様･平面培養と共に衆落発生後2日 目から薗苔周辺より寒天を潜解し始め溝を作る･液化物は寒天の溶解に伴い増加する･ 肉汁寒天穿利一発育貧弱にして液化も認められず･ Gelatin穿利一殆んど発育せヂ 肉汁一滴濁中等で均質,液表発育は薄膜状で,少量の黄白色膜状沈澱を生ず･ 牛乳一変化なし･ 馬鈴薯-発育せず･ 生理的性質: N抗の生産を見るが微量であり,硝酸塩還元性及びn2Sの生産はない･ 其他の性質はBacト5に同じ 特性:寒天を液化分解し還元糖を生産する･叉発育初期に菌苔は蛍光を有する･ 分離源: 1952年4月鹿児島市の養殖海苔･

3)類縁関係

分離薗Bacト5ほFlavobacleriumに, Bact-7はPseudomonasに属せしむべき ものと思われる6). Ⅰ.培養条件の決定 次にこれらの菌の発育及び寒天液化作用に対する最適培養条件を検索した･ 実験方法:この実験では炭素源として寒天のみを使用することとしたので, Sucroseを 除いた次の様な修正CzAPEX培養基を基本培養液とし,上記の目的に応じて夫々次の如く 組成を変えた培養液を調製して実験した･

基本培養液の組成

NaN Os KaHPO4 MgSO4 ･ 7H90 KCI NaCl 3.0 g 1.0 0.5 0.1 25.0 Agar-agar    2.0 or 23.0 H90         1000.0

160 _{顔見島大学.水産学部紀葛 飾3各 節1号}

1)窒素源の種類

基本培養液に於けるNaNO3 3.0gを(NHl)BSO4 2.35g,Peptone 3.13g, Urea l･07g, Asparagine･2.67 gで置換えた5種の培養液を調製し,各窒素化合物の価値を比較した･ 何れの場合も窒素含量は0.O50/oである. 2) pHの影響 HCl或はNaOHを用いて前記基本培養液の pfI価を夫々5.8, 7.0, 7.4, 8.6, 9.6 と し, pHの影響を観察した.

3)食塩濃度の影響

この実験を行うために次の組成を有する基本人工海水培養液を調製し,更に食塩を加え てその濃度を夫々0.50/0, 3.00/0, 100/0, 200/oとした. MgC】2        5.0 g MgSO.       2.6 CaSOJ 1.0 KCI 0.7 Agar･agar  2.n or 23.0 H20       1000.0 以上の各培養基に於て寒天濃度2.3 0/Cのものは菌の発育状態観察用として供試菌の割線 培養を行い, 0.20/Cのものは寒天液化試験用とした.即ち此の場合は大型試験管に9cc宛 分注し常法により時々振塗しつつ培養を行った後1000に10分間加熱して残余の寒天を潜 解し,その6ccを用いOsTWAl-D粘度計により500に於て粘度を測定した.培養は25° で7日間行ったが別に培養温度の影響を見るために前記修正CzAPEX基本培養液を用いて 200, 300, 35oCの各温度に培養実験した. 此等各実験の結果は第1, 2表及び第1, 2, 3図に示した通りである. Table 1. aに示したように発育に対す

｡n the bacterial g,｡wth. (cultured for る窒素源はPeptoneが最も良く, NaNO3 7 days at 25oC･ + ‥ degree of growth) がこれに次ぎ AsparagiIle も亦良好であ

Table I. Influence oi culturalConditions

Bact. No. a. NISOurCe 5 1 7  るが(NH4)2SO4,Ureaは劣って居た.演 化はTabl6-2の如く NaN03が最も良い 結果を示した.有機窒素源を用いたものは 培養中粒状沈澱を生じたため測定値が不規 _ 則となり明確な結果が得られなかった.し かし割線培養中の寒天液化を見ると Pep･ toneは NaN03 に劣らず強力であった. 一一 以上の結果いずれの供託菌の場合も発育に 対してほPeptone及びNaNO3,寒天液 化に対してはNaN03が窒素源として好適 である事が分った. 発育に対する最適温度はTable 1. bの 如く 25oC附近にあり,液化に対する最適 温度はFiglに見られる如く Bact-5は 25けC, Bact- 7は250-30°C附近にある. 鼎+拙一服 鼎+冊l≠

Table 2. Effect of nitrgen source On the agar･liquefyiI一g activity of bacteria 5 and 7. (cultured for 7days at 25℃)

Vr Bact.5 Z Bact.7 Nitrogen source NaNO3 (NH4 )2SOJ Peptone Urea Aspragine この様に両菌共発育と液化に対する適温 がほぼ等しいことから見て,菌の発育と 酵素生産は大体並行して行われることが 分る. pHの影響はTable 1. C の如く発育 は両薗共7.0-7.4に於て最も良好であ るが,液化はFig2に見られる様にやや 酸性に偏し5.8-7.0の間に最適pHが 存在するもののようである. 次にTable 1. dによると発育に対す る最適食塩濃度は明かに3 0/o前後に存し, 液化もFig3に示す様に30/o附近の濃度 が最良で海水細菌としての性質の一端を 示しているものと思われる. 皿.培養時間の経過による培養 基粘度の変化 次に以上の実験によって明かにされた 寒天液化に対する最適諸条件下に培養を 行い,培養時間の経過による液化の進行 状態を実験した. 前記の液体寒天培養基70ccづつを 300cc窄フラスコに分注殺菌し,同組成 の培養基に7日間培養した各菌を5白金 耳づつ接種し,時々振麗しつつ25℃で 培養した.この培養液から所定時間後に 毎回6ccづつピペットでとり,これに ついて粘度測定を行い相対粘度を算出し た.その結果はFig4に示した.これに よると接種後48時間までは急激に液化 20       25       30       35

Fig I. Effect of temperature o‡l the

agar･liquefying activity of

bacteria-5and 7.

Vr

.5    8    7    8    9   10

Fig2. Effect of pH on the

agar-liqueiying activity of bacteria 5

and 7. Vr

他C/ (%)

/0      20

Fig3. Effect of NaCl on the

agar-liqueiying activity of bacteria 5 and 7.

vr - F-RY+vohn3-霊S medium-R. V. of.water

of water X 100 R.Ⅴ. ･･･ Relative viscosity 0   4   7   7   4 0   4   5   5   1 5   / b   8   8   7 9   ｣   . 1   4   0 っ ム   7   ｣ 7   -▲   0 4   5   5   ｣ 7   5

162      庫兇島大学水産学部紀要 節3各 節1普 が進行しているが113時間内外で液化の進 行が止り酵素の生産叉は作用も停止させら れるものと考えられる. Ⅲ.粗酵素液の最適作用条件

実験廿及びⅢにより寒天液化に対する好

適培養条件を知ったので其の結果を参照し て粗酵素液を調製し,酵素作用に及ぼす pH及び温度の影響を寒天液化の程度によ り検索し,更に粗酵素液による寒天分解経 過を,寒天の液化と還元糖の生成量を測定 することにより追及した. 0 24 48 72  1/3    ′68   2/6hrs

Fig 4･ The liquefying process Of

agar-agar by the agar-decomposing

bacteria (No.5 and 7)

実験Ⅲに用いたと同一組成の培養基100ccづつを300cc容フラスコに分注殺菌し,叉 これと同一培養基に25℃, 120時間培養した菌を1ccづつ接種し時々藻塩しつつ25oC, 96時間培養後REICHEL細菌通過器で通過した･かくして両者共其の培養液より約150cc の滅液を取り,これに5ccづつのChloroform及びToluolを加え粗酵素液とし以下の 実験に供した. 1)酵素作用に及ぼすpHの影響 基質として0.20/o寒天水溶液5ccを大型試験管に分注し,それらにpH 4･0, 5･0, 6･0, 7.0, 8.0,に調整した燐酸塩緩衝液如2cc及び粗酵素液1cc宛を加え, 40oCの恒温水槽 に4時間放置した後100oCに10分間加熱し酵素作用を停止させると共に残余の寒天を溶解 せしめ,粘度を測定した.なお対照試験として同一組成試料を粗酵素液注力峻直ちに100oC IO分節加熱したものを他の試料と同様に処理したが,粘度の変化は認められなかった･以 上の実験の結果ではpH6.0が寒天液化に対する最適条件であることが分ったがpI壬5･2か ら6.8までの間を5･2, 5.6, 6.0, 6.4, 6･8と細分し同法で再測定を行った･ Fig 5はこれら の実験の結果を示したものである.但し後者の場合基質として0･40/o寒天溶液を用いた･ 図に見られるようにpH 5.6附近に最適 pH条件の存在する事が分る. ReJa.tive vI.SCOSity 2)酵素作用に及ぼす温度の影響   /′2

前項1)と同じ方法で実験したが緩衝液

はpH 6.0のものを用い, 200, 300, 400, 50oCの各温度に調節した恒温水槽に4時 間保った.対照試験も同様に行ったが粘度 変化はこの場合も起らなかった. Fig. 6 はその実験成績で最適温度は 40cc附近にあることが分る. 上一ゆ /08 /〃g J〟 3)粗酵素液による寒天分解経過 0.20/o 寒天水溶液500ccを11容フラ スコに入れて基質とし,これにpH5.6の 燐酸塩緩衝液200ccと粗酵素液100ccを加え, o Bad. 5 ●  eaCt. 7 4    5  5.6 6 8･4  7    8

Fig 5. Effect of pH value on the activity of the crude agarlliquefying

en2;yme.

後に相対粘度を測定し,一方0, 3, 7, 24 時間後に反応液100cc づつをとり生成 還元糖を BERTLAND 法により定量L Galactose として算出した. Fig.7はこの結果を示したものであるが 液化は反応開始後3 - 5時間でほぼ最高に 連するが,還元糖の生成は液化より数時間 遅れ両も緩慢に行われる事がわかる.本実 験では還元糖の生成が微弱であったが,そ の原因としては,条件を液化に対して好適 状態におくことに留意し,還元糖生成条件 を考慮しなかった事及び,当時菌の活力が 低下して居た事が挙げられる.予備実験の 際得られた結果ではl o/o寒天溶液を基質と した場合,生成還元糖はGalactoseとして 100cc中Bacト5は40.6 mg (対照18.1 ), Bact-7は116mg (対照27.8)であ った. 要    約 20       30       40       510 I

Fig 6. Effect of temperature on the activity of the agar-liquefying en2;yme.

0 / 2  3  4  5  6  7      24 hFS

Fig 7. The decomposing process of

著者等はアサクサノリ葉体表面より2株   agar-agar by the crude

agar-liquefy-の寒天分解菌を分離し,それらの発育と寒  ing enzyme･ 天液化に対する最適培養条件を検索し,次いで該菌培養液より粗酵素液を調製して,その 一般的性質を研究し次の結果を得た. 1)分離菌は細菌学的性質より検索した結果それぞれFlavobacterium(Bact-5)及 びPseudomonas (Bact-7)に属して居た.両菌の最適発育条件は互に類似し,次にその 主なるものを列挙すれば,窒素源-･Peptone叉はNaNO3,温度･-25℃, pH-･7･0-7･4, 食塩濃度-･ 30/oで,叉寒天液化に対する最適培養条件は,窒素源-･NaNO3,温慶･･･250-30℃, pH･･･5.8-7.0,食塩濃度･･･0.5-30/0,であり,液化現象は薗壊種後約113時間で最 高に遷した. 2)粗酵素液の寒天液化作用に及ぼすpHと温度の影響を粘度測定により観察した結嵐 pH 5.6, 40oCに於て最も強力な作用を示した.更に寒天分解経過を見ると,液化現象は反 応開始後3 -5時間でほぼ平衡状態に連するが,還元糖の生成はそれより数時間遅れ級陵 に行われる事が分った. 終りに本研究を行うに当り終始御指導を賜わった恩師吉村貞彦先生,並びにこの発表に 際し多大の御配慮御後援を頂きました相田教授其他諸発生に謝意を表する･ r"oo,/Qw)J45hS BuJ等pay

164       顔見島大学水産学部紀要 夢3巻 夢1号

Resume

The authors isolated two strains of agar-decomposing bacteria from the surface of Porbhyra lenera, and studied on the optimum conditions to the

growth and agar-liquefying capacity of these bacteria, and the general properties of crude agar-decomposing enzyme prepared from the bacterial culture, was

also examined. And the following results were obtained.

1) The isolated bacteria Bact-5 and Bact-7 seemed to be a sort of Flavobac-terium and Pseudomonas, respectively.

2) Agar-liquefying by these bacteria was acomplished utmostly lュnder follwing

conditions,-at 250-30oC; in the medium containing 3 0/o of NaCl and NaNO3 aS

nitrogen source; pH 5.8-7･0･ And the activity reached to the maximum state

at about 113 hours.

3) The effects of pH value and temperature on the activity of the crude

agar･decomposing enzyme were studied by measuring the decreasing rate of relative viscosity of agar solution, and the most powerful activity was shown

at pH 5.6 and 40oC.

4) Liquefaction of agar-agar by the crude enzyme reached to the state of equilibrium between 3-5 hours from beginning of the action, but production of reducing sugar was late for a long hours.

文 献

1) Gran: Bergens Museum Aarbog., 14 (1902);Zentbl. Bakt. ⅡAbt･, 75, 330 (1928)

2)大島:農化., 7,328 (1931) 3)蘇:農化., 15,1070(1939) 4)門田:日水諒., 16,575 (1951) 5)石橡:酸工諒., 30, 472 (1952) 同上:同上 31, I(1953)