IRUCAA@TDC : (2)共同研究プロジェクト : 研究成果報告

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Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

(2)共同研究プロジェクト : 研究成果報告

Journal

歯科学報, 115(6): 517-546

URL

http://hdl.handle.net/10130/3908

Right

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５１７歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）

⑵共同研究プロジェクト

― 研究成果報告 ―

① 新素材と新たな臨床応用

歯科用 CAD/CAM の積層造形への展開 研究代表者武本真治（東京歯科大学・歯科理工学講座）研究分担者河田英司（東京歯科大学・歯科理工学講座），櫻井薫（東京歯科大学・有床義歯補綴学講座），服部雅之（岩手医科大学・医療連携講座），天谷浩一（松浦機械製作所）１．研究の概要近年，歯科臨床において歯科用 CAD/CAM がセラミックス製または金属製修復物／補綴物に多く応用されている。その発展は著しいものがあるが，従来の切削法では精度に限界があり，辺縁の適合に課題が残る。近年，従来の切削法による歯科用 CAD/ CAM の欠点を補完する方法としてレーザー焼結による金属積層造形法を利用して補綴物や修復物を作製する新規歯科用 CAD/CAM システムが注目されている。レーザー焼結によるコバルトクロム合金のメタルフレーム作製システムが，歯科用 CAD/CAM として実用化されてはいるものの，チタン合金への応用や歯科補綴物に要求される表面性状と加工精度の課題など，積層造形法には材料粉末を始めとして克服すべき課題も多い。本研究では，フッ化物や過酸化物に優れた耐食性を有することが明らかになっているチタン－クロム合金をレーザー積層造形により成形し，歯科臨床での応用することを目的として，チタンおよびクロム粉末の混合粉末を用いて積層造形により造形し，その組成や機械的性質，耐食性について明らかにする。２．取組状況昨年度は，チタンクロム合金粉末を，レーザーと切削加工が可能な金属光造形複合加工機（Lumex Avance-２５，松浦機械製作所）により，金属光造形複合加工機で造形が可能であり，レーザーのエネルギー密度が高い条件において，ワークの空孔が少なく合金化が確認することができた。一方で課題として，クロム粉末が粒子として残存している部分が確認されたことから，レーザー条件のさらなる最適化について検討が必要であることが明らかになった。また，金属粉末のコストの低減とその造形の最適化が必要であると考えられた。今年度は，昨年度使用していた３２５mesh 以下の微細クロム粉末（４５ μm 以下）とチタン粉末とを用いてレーザーのエネルギーの最適化を検討した。また，市販されている微細クロム粉末（１０ μm 以下と２０ μm 以下）を用いてスキージングテストの検討を行った。１）チタンクロム合金粉末の調製チタン粉末とクロム粉末（ともに粒径４５ μm 以 № スポット径（mm）走査速度（mm/s）ハッチングピッチ（mm）エネルギー密度（J/mm２）パワー密度（W/mm２）６（基準）０．３２０００．２０３．０１，６９８１００．３１６００．２０３．８１，６９８１１０．３１２００．２０５．０１，６９８１２０．３２０００．１５４．０１，６９８１３０．３２０００．１２５．０１，６９８１４０．２２０００．２０３．０３，８２０１５０．２１６００．２０３．８３，８２０１６０．２１２００．２０５．０３，８２０１７０．２２０００．１５４．０３，８２０１８０．２２０００．１２５．０３，８２０

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５１８東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ下）を重量比５kg：１kg で混合した粉末（組成比約 Ti-１７Cr）を V 型粉末混合機（池本理化工業製 IVM-５，容量：５L）で１時間混合して，チタンクロム合金粉末を調製した。一方で，粒径を１０ μm または２０ μm と小さくしたクロム粉末とチタン粉末（粒径４５ μm 以下）を上記同様に V 型粉末混合機で１時間混合して，チタンクロム合金粉末を調製した。２）造形テスト昨年度最もワークの空孔が少なかった条件６を基準として，スポット径，レーザー走査速度，ハッチングピッチを変えることにより，直径２０ mm×厚さ３mm の円柱形状を各条件下（前頁に示す９条件），アルゴンガス雰囲気下にて造形，切削加工を行った（レーザーパワー：１２０W，積層厚さ：０．０５mm）。３）造形物の成分評価 EPMA による面分析を行ったところ，いずれの試料においてもクロムリッチの部位が観察された。したがって，今回のともに４５ μm 以下のクロム粉末とチタン粉末とを粉末混合器を用いて混和し，光造形複合加工機では均質な合金化は困難であることが示唆された。４）スキージングテスト粒径の小さなクロム粉末（１０ μm 以下または２０ μm 以下）とチタン粉末（４５ μm 以下）を V 型粉末混合機で混合し，ベースプレート状で凝集を起こさず粉末の層を形成できるかを確認したところ，微細クロム粉末ではともにベースプレート上に粉末が凝集し，チタンクロムの混合粉末を供給することができなかった。３．本事業の成果チタン粉末とクロム粉末を混合し，レーザーと切削加工が可能な金属光造形複合加工機（Lumex Avance-２５，松浦機械製作所）により，歯科臨床への応用に向けたチタン－クロム合金製補綴物の基礎技術の確立を目的として実験を行った。試作チタン－クロム混合粉末は，クロム粉末粒径が大きい場合において金属光造形複合加工機で造形が可能であった。今回の設定条件下では，スポット径，レーザー走査速度，ハッチングピッチを変えることでワークの空孔が少ないチタンクロム合金化を目指したが均質な合金化は困難であった。１０ μm 以下または２０ μm 以下のクロムの混合粉末を用いたスキージングテストでは，一部で凝集が認められたことから，現時点では，微粉末混合法では均質な合金の創製は困難であると推測された。今後，チタンクロム合金インゴットからガスアトマイズ粉を調整することでチタンクロム合金の積層造形への応用が期待できると考えられた。【関連業績】学会発表服部雅之，武本真治，副島寛貴，長谷川晃嗣，愛知徹也，吉成正雄，河田英司，小田豊 Ti-Cr 混合粉によるレーザー溶融積層造形合金の性質日本歯科理工学会誌２０１４；３３⑵：１４５．（発表優秀賞を受賞） 口腔インプラント手術シミュレーターの開発 研究代表者松永智（東京歯科大学・解剖学講座）研究分担者木下英明（東京歯科大学・歯科理工学講座），阿部伸一（東京歯科大学・解剖学講座），矢島安朝（東京歯科大学・口腔インプラント学講座），高野直樹（慶應義塾大学・理工学部機械工学科）１．研究の概要口腔インプラント治療のスペシャリストが知覚している手術時の感覚を，マイクロモータを用いた出力によって経験することができるシミュレータ開発を目的とする。特に稀有な症例や偶発症を引き起こしやすい事例において，正しい治療が行われている時の感覚，あるいは失敗した時の感覚を疑似的に体験できるため，習熟に時間を要する高度医療の経験の場を増やすことにつながり，エキスパート育成に貢献することができる。このシミュレータには，インプラント治療経験の浅い歯科医師が偶発症を起こしやすい様々なシチュエーションが用意されている。与えられる情報から手術計画を立案し，実際にインプラント埋入操作を行うことで，PC 上の動画，サウンド，振動からエキスパートの感じている

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５１９歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）感覚を疑似体験することが可能となる。２．取組状況慶應義塾大学理工学部高野教授らと進めてきたハードウェアの開発は，下顎骨におけるモデルに関してこれを完了し，筐体の設計も終了した。これと並行して東京歯科大学が行っていた基礎的データ算出および視聴覚素材の作製も順調に進行し，すでに口腔インプラント学講座医局員，臨床実習中の当大学５年生および一般臨床医数十名が試用したことで，アンケート結果など更なる評価データの採取を行った。３．本事業の成果歯科インプラント埋入手術時の偶発症がクローズアップされている昨今，手技の徹底はもちろん，共通の指標に基づく安全確保が最優先事項とされている。しかしながら，高度な先進医療が多分に経験に依るところが多いのは大きな問題である。本事業はシミュレータを用いて疑似的に体験することで，これまで補うことが非常に難しかった経験の溝を埋め，特に‘失敗’を体感して注意を喚起するところに大きな特徴があると考えている。またシミュレーション後に，実際の手術時にはみえないはずのたくさんの情報を，フィードバックとして多角的な視点から与えることで，隠されたパラメータの存在を知覚し，意識することができるようになることを目的としている。これは歯科インプラント埋入手術に限らず，経験が重要視される一方で，失敗することが許されない医療において，今後必ず進めていかなければならない事業であり，その先駆けになるものと考えている。シミュレーション結果はもちろん，実際に埋入した顎骨の三次元構造や埋入後に発生するであろう荷重の状態，偶発症の説明などを体感的に ‘遊び’ながら学習できる。当初の想定以上に高い評価を受けており，日本口腔インプラント学会のデンツプライ賞（２０１３年度）を受け，２０１４年の学術集会で木下講師（現在歯科理工学講座所属）が記念発表を行った。【関連業績】雑誌論文

１．Matsunaga S, Naito H, Tamatsu Y, Takano N, Abe S, Ide Y : Consideration of shear modu-lus in biomechanical analysis of peri-implant

jaw bone. Dental Materials Journal, ３２⑶：４２５－３２，２０１３．

２．Matsumoto T, Matsunaga S, Morioka T, Nakano T, Yoshinari M, Yajima Y : Relation-ship between preferential alignment of biologi-cal apatite and Young’s modulus for human mandible cortical bone. Journal of Hard Tis-sue Biology, ２２⑵：１６３－７９，２０１３．

３．Kinoshita H, Nakahara K, Matsunaga S, Usami A, Yoshinari M, Takano N, Ide Y, Abe S : Association between the peri-implant bone structure and stress distribution around the mandibular canal : a three-dimensional finite element analysis. Dental Materials Journal, ３２ ⑷：６３７－４２，２０１３．

４．Abe S, Yamamoto M, Noguchi T, Yoshimoto T, Kinoshita H, Matsunaga S, Murakami G, Rodríguez-Vázquez JF : Fetal development of the mediobasal segment（S７） of the human right lung. Anatomy and Cell Biology, ４７：１２－１７，２０１４．

５．Ikari Y, Kinoshita H, Agematsu H, Saka H, Matsunaga S, Ide Y, Abe S：Three-dimensional analysis of pulp chambers in mandibular sec-ond deciduous molars. Journal of Hard Tissue Biology, ２３：２１１－２１６，２０１４．

６．Matsunaga S, Shimoo Y, Kinoshita K, Yamada M, Usami M, Tamatsu Y, Abe S : Morphologic Classification of Root Canals and Incidence of Accessory Canals in Maxillary First Molar Palatal Roots : Three-Dimensional Observation and Measurements using Micro-CT. Journal of Hard Tissue Biology, ２３：３２９－３３４，２０１４．学会発表１．木下英明，松永智，高野直樹，井出吉信，阿部伸一顎骨海綿骨をドリリングする際の力覚体感型インプラント手術シミュレーターの開発第３３回日本骨形態計測学会，２０１３年７月，浜松市２．高野直樹，木下英明，中野貴由，松永智，井出吉信

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５２０東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ海綿骨の力学的特性の確率的予測と口腔インプラント手術シミュレーターへの応用第３３回日本骨形態計測学会，２０１３年７月，浜松市３．笠原正彰，木下英明，松永智，吉成正雄，森岡俊行，井出吉信，阿部伸一ヒト上顎骨前歯部及ぶ臼歯部皮質骨における生体アパタイト結晶配向性解析第２９５回東京歯科大学学会（例会），２０１３年６月，千葉市４．大峰悠矢，福田真之，野口拓，木下英明，松永智，井出吉信，阿部伸一ヒト上顎骨における大口蓋管の局所歯科学報１１３⑵，１９７，２０１３．第２９５回東京歯科大学学会（例会），２０１３年６月，千葉市５．小高研人，笠原正彰，木下英明，松永智，吉成正雄デジタルインプラント周囲顎骨における生体アパタイト（BAp）結晶配向性第２９６回東京歯科大学学会（総会），２０１３年１０月，千葉市６．山内正人，木下英明，松永智，井出吉信，阿部伸一舌神経の解剖学的走行形態第２９６回東京歯科大学学会（総会），２０１３年１０月，千葉市７．木下英明，松永智，高野直樹，矢島安朝，井出吉信，阿部伸一力覚体感型インプラント手術シミュレーターを用いた口腔インプラント学教育に向けて第３２回日本歯科医学教育学会総会および学術大会，２０１３年７月，札幌市８．木下英明，松永智，高野直樹，矢島安朝，井出吉信，阿部伸一教育用ツールとしての口腔インプラント手術シミュレーターの開発第４３回公益社団法人日本口腔インプラント学会・学術大会，２０１３年９月，福岡市９．福田真之，野口拓，大峰悠矢，木下英明，松永智，井出吉信，阿部伸一三次元立体構築画像を用いた切歯管構造に関する解剖学的研究第５５回歯科基礎医学会学術大会・総会，２０１３年９月，岡山市１０．笠原正彰，松永智，井出吉信，阿部伸一ヒト上顎骨臼歯部皮質骨及び海綿骨における生体アパタイト結晶配向性解析第５５回歯科基礎医学会学術大会・総会，２０１３年９月，岡山市１１．大峰悠矢，福田真之，野口拓，木下英明，松永智，井出吉信，阿部伸一ヒト上顎骨における大口蓋管の観察第５５回歯科基礎医学会学術大会・総会，２０１３年９月，岡山市

１２．Ide Y, Matsunaga S, Harris J, O ’Connell D, Seikaly H, Wolfaardt J.

Anatomical examination of the fibula : Digital imaging study for osseointegrated implant in-stallation.

９th

Covenant Health Research Day ２０１４ ab-stract,（Suppl），９，２０１４．

９th

Covenant Health Research Day ２０１４ , Ed-monton, Canada. １３．大峰悠矢，福田真之，野口拓，木下英明，松永智，井出吉信，阿部伸一大口蓋管の形態及び周囲構造の局所解剖学的観察第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会抄録集，１５３，２０１４．第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会，下野市１４．笠原正彰，松永智，木下英明，阿部伸一ヒト上顎骨臼歯部皮質骨および海綿骨における生体アパタイト結晶配向性解析第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会抄録集，１１０，２０１４．第１１９回日本解剖学会総会・全国学術集会，下野市１５．松永智，野口拓，小高研人，笠原正彰，福田正之，木下英明，阿部伸一老年性骨粗鬆症と閉経後骨粗鬆症の複合発症モデルにおける歯槽骨の構造特性日本骨形態計測学会誌：２４⑵，１０７，２０１４．

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５２１歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）第３４回日本骨形態計測学会総会・全国学術集会，札幌市１６．笠原正彰，松永智，木下英明，阿部伸一，吉成正雄，石本卓也，中野貴由ヒト上顎骨臼歯部皮質骨及び海綿骨における生体アパタイトの結晶配向性解析日本骨形態計測学会誌：２４⑵，９２，２０１４．第３４回日本骨形態計測学会総会・全国学術集会，札幌市１７．松永智，阿部伸一（シンポジウム）新しい生体力学的アプローチによって可視化されるインプラント周囲の力学的環境日本口腔インプラント学会誌：２７，２０１４．第４４回日本口腔インプラント学会・学術大会，千代田区１８．松永智，小高研人，田坂彰規，勝見吉晴，菅原圭亮，山本信治，澁井武夫，片倉朗，阿部伸一，吉成正雄『ファブラボ TDC』のための３D プリンタ精度検証東京歯科大学学会プログラム：１５，２０１４．第２９８回東京歯科大学学会総会，千代田区１９．田坂彰規，松永智，古池崇志，和田健，石崎憲，上田貴之，吉成正雄加熱重合及び３D プリンタで製作した義歯床の精度検証東京歯科大学学会プログラム：１５，２０１４．第２９８回東京歯科大学学会総会，千代田区２０．澁井武夫，松永智，吉成正雄，根木沙枝子，木村絵美子，市島丈裕，片倉朗３D モデルを作製して手術に臨んだ外骨症の一例東京歯科大学学会プログラム：１６，２０１４．第２９８回東京歯科大学学会総会，千代田区２１．濱田裕嗣，勝見吉晴，菅原圭亮，村松恭太郎，渡邉章，山本信治，笠原清弘，高野正行，齋藤力，柴原孝彦，松永智，吉成正雄口腔外科手術におけるインクジェット方式３D プリンターの応用東京歯科大学学会プログラム：１６，２０１４．第２９８回東京歯科大学学会総会，千代田区２２．森田純晴，梅澤貴志，大峰悠矢，松永智，阿部伸一後頭下筋群と硬膜間の連続性に関する形態学的及び組織学的研究東京歯科大学学会プログラム：１９，２０１４．第２９８回東京歯科大学学会総会，千代田区２３．松永智（シンポジウム）医療系ファブラボが変える？医療のかたち ADT 日本支部会学術講演会プログラム，２０１４．第１回日本顎顔面再建先進デジタルテクノロジー学会学術講演会，千代田区

２４．Katsumi Y, Sugahara K, Yamamoto N, Nagai S, Tada K, Takano M, Shibahara T, Matsu-naga S, Yoshinari M.

Clinical application of full-scale-model made by ３-dimensional-ink-jet-printer to orthogenetic surgery.

Advanced Digital Technology in Head & Neck Reconstruction ５ th

Triennial Congress abstract, ２０１４．

ADT ５ th

Triennial Conferences, Beijing, China ２５．Matsunaga S, Abe S.

Accuracy of ３D FEA based on dental CBCT images

Advanced Digital Technology in Head & Neck Reconstruction ５ th

Triennial Congress abstract, ２０１４．

ADT ５ th

Triennial Conferences, Beijing, China

天然アパタイトの再生医療への応用 研究代表者見明康雄（東京歯科大学・組織・発生学講座）研究分担者三島弘幸（高知学園短期大学・医療衛生学）１．研究の概要天然アパタイトは構造が安定しており単結晶としては合成出来ない様な大きな結晶として産出し，石灰化度は１００％である。このような特長を生かして，種々の生物のエナメル質等石灰化度の極めて高い物質の無機質密度や，抜歯後の骨再生あるいは加齢に

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５２２東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップよる骨構造の変化における石灰化程度の定量的判定において標準試料として活用できると考え，その応用方法を検討した。２．取組状況天然アパタイトにはいろいろな色彩を持ったものがあるので，性状分析と構造分析を行った。天然アパタイトの断面を鏡面研磨し，EPMA と X 線回折装置を用いて成分の定性分析と面分析および定量分析を行った。また，別のサンプルについては共同研究者が，ラマン分光分析の測定を行った。さらに，高密度石灰化物の無機物定量評価のため，天然アパタイトを標準試料として X 線撮影（CMR）を行った。写真の撮影に際し，エナメル片と天然アパタイト，合成アパタイトを同一ブロックとして樹脂包埋し，種々の厚み（１３０～２００ μm）の研磨片を作製して画像解析装置で石灰化度の比較検討を行った。３．本事業の成果 EPMA では，天然アパタイトの断面に多くの空洞ないし他結晶のインクルージョンが観察された。 EDS および WDS による分析では，全てのサンプルから F が検出され，Fluorapatite であることが示された。また他の含有元素として Si，O，Cl，S， Ca，P，Na，Mn，Mg，Al，K，Fe，Th，Ba が検出され，色の違いにより含有元素および元素比が異なっていた。また，インクルージョン結晶として ThSiO４，CaSO４，SiO２，Ca２MgSi２O７，BaSO４，CaCO３

等が考えられた。この空洞やインクルージョンは色の濃いアパタイトで多くみられ，透明なものでは少なく均一であった。ラマン分光分析法でも Fluora-patite であることが示された。リン酸基 PO４３－のピーク値は，天然アパタイト結晶１５種では，９６４－９６７cm-１であり，F の含有によるピークシフトと考えられた。骨組織の PO４３－のピーク値は４種類認められ，その４種のピークは天然アパタイト結晶でも確認でき，骨代替材料の人工材料をインプラント後に，その周囲に形成される骨組織の結晶成熟度の比較対照試料としての可能性が示唆された。高密度石灰化物の無機物定量評価のために天然アパタイトを標準試料として CMR 撮影を行った。その結果，天然アパタイトの結晶密度を１００％とした場合，エナメル質では８０～９０％，人工アパタイトでは１１０％位の値であった。エナメル質の無機質重量％は９７％前後であるが，容量％は８９％で有ることが報告されている。今回の実験ではエナメル質の中層付近を測定したが，概ね容量％に近い値を得ることが出来た。従って，エナメル質の無機容量％についいて，動物種による違いや部位による違いを詳細に検討する上で重要な指標となる可能性が示唆された。【関連業績】学会発表１．見明康雄，三島弘幸，下田真治天然アパタイトの生体応用の可能性－特に色彩と構成成分との関係について－第５５回歯科基礎医学会，２０１３年９月２２日，岡山市

Journal of oral Bioscience Supplement, p．２３０．２．三島弘幸，見明康雄，大久保厚司天然アパタイトの生体応用の可能性第１２回日本再生歯科医学会学術大会総会，平成２６年８月２６日，徳島市日本再生歯科医学会誌抄録集，１８，２０１４． ジルコニアの臨床応用 研究代表者佐藤亨（東京歯科大学・クラウンブリッジ補綴学講座）研究分担者矢谷博文（大阪大学・歯学部歯科補綴学第一教室），早川徹（鶴見大学・歯学部歯科理工学講座），吉成正雄（東京歯科大学・口腔科学研究センター）１．研究の概要ジルコニアセラミックスはメタルアレルギーの懸念がなく，高強度で審美性を有する生体親和性の高い材料であることから，本材を利用したオールセラミック修復が臨床応用されている。しかし，臨床応用における，長期耐久性，天然歯等の咬耗・摩耗様相，組織親和性については明らかになっておらず，本材料を臨床応用についてのエビデンスは得られていない。本研究は，ジルコニア（正方晶ジルコニア多結晶体，TZP）の口腔環境下における疲労特性の評価，

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５２３歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）口腔環境を想定した摩耗状況と経年的変化，インプラントが接する生体組織に適合した表面改質法の検討を行い，ジルコニアによるオールセラミック修復，ジルコニアインプラントを開発することを目的とした。この概念は，完全メタルフリー修復というパラダイムシフトにつながり，日本から発信できるジルコニアの臨床応用システムになり得ると考えられる。２．取組状況主に透光性 TZP の臨床応用を想定した研究を展開する。１）透光性 TZP 単独および陶材積層材の評価：透光性ジルコニアは，従来のジルコニアが持つ不透光性を改善して優れた色調表現が可能であることから臨床応用が広まっている。しかし，色調を変化させた透光性ジルコニアの単層材，並びに，陶材を積層した積層材の透光性および強度を検討した研究は報告されておらず，色調を持つ透光性ジルコニアの臨床的評価は定まっていない。そこで，色調の異なる透光性ジルコニア単層材および陶材積層材の有効性を明らかにすることを目的として検討した。２）臨床形態における強度評価：①咬合面の溝部分をどれだけ薄くできるか，②臨床では，対合歯があるためジルコニアの厚さは支台歯形成量（支台歯高径）で調整する必要があることから，咬合面中央に溝を掘ることによってジルコニア冠強度が増すか，について検討する。３．本事業の成果１）色調の異なる透光性ジルコニアは，陶材を積層しなくても従来の不透光性ジルコニアの透光性を改善するとともに，陶材に近い色調を再現できることが明らかとなった。また，透光性ジルコニアの強度は不透光性ジルコニアと同等であり，積層陶材の厚さが増加すると強度の減少が認められた。以上より，色調を調整した透光性ジルコニアの単独使用は臨床的有用性が高いことが示唆された。２）現在，実験条件の最適化を検討する予備実験を行っている。【関連業績】学会発表１．原舞高透光性ジルコニアのエナメル質に対する摩耗性第１２３回日本補綴歯科学会学術大会・イブニングセッション３ Update Zirconia Restorations （平成２６年５月）２．松崎文頼ほか陶材を積層した透光性ジルコニアの透光性と曲げ強さ第４４回日本口腔インプラント学会，２０１４年９月１３日，東京

② 組織工学による新たな治療戦略の開発

上皮－間葉ハイブリッド型機能的細胞シートの 創製と有効性の評価 研究代表者阿部伸一（東京歯科大学・解剖学講座）研究分担者山本将仁（東京歯科大学・解剖学講座），比嘉一成（東京歯科大学・市川総合病院眼科），島﨑潤（東京歯科大学・市川総合病院眼科），Wei Jen Chang（台北医学大学・大学口腔医学院）１．研究の概要近年細胞シート工学が進歩し，頬粘膜癌など広範な粘膜摘出後に自己細胞による口腔粘膜シートを応用することが試みられているが，直下の筋層を再構築するところまでは困難なことから，治癒後の機能障害という問題点が指摘されている。そこで我々は口腔粘膜細胞シートと骨格筋細胞シートをハイブリッドさせた積層シートの開発を試みている。基礎的検証事項として，上皮－間葉系変換，さらには移植後の生体組織を結合させる構造蛋白の解析を行っている。２．取組状況これまでに我々は，マウス頰粘膜上皮から細胞を採取し作製した口腔粘膜上皮シート，頬粘膜下組織

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５２４東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップから細胞を採取し作製した結合組織細胞シート，胎生期マウスより採取した筋芽細胞を利用し作製した骨格筋細胞シートを積層後，２４時間までの経過を観察し良好な結果を得ている。これはそれぞれの細胞シートを作製する時間を試行錯誤し，口腔粘膜上皮シートを３週間，結合組織細胞シートを４８時間，骨格筋細胞シートを３６時間とし，その後積層したものが最も良好な結果を得る可能性があることを見出したものである。３．本事業の成果これまでに我々は，３層の細胞シートを積層後，それぞれの細胞シートが良好に接着すると上皮シート直下に細胞基質間の接着タンパクである Integrin が一層発現することを明らかにした。すなわち生体の口腔粘膜と類似したハイブリッド型細胞シートの創製に成功した。次年度は，さらに様々な構成タンパクを詳細に検索したいと考えている。【関連業績】雑誌論文

１．Suzuki M, Yamane S, Higa K, Umezawa T, Serikawa M, Shimazaki J, Abe S : Expression of cross-linked protein on tissue-engineered epithelial cell sheets from rabbit oral mucosa. Journal of Hard Tissue Biology, ２３：２７５－２８０，２０１４．学会発表１．梅澤貴志，山根茂樹，比嘉一成，島﨑潤，井出吉信，阿部伸一上皮・筋ハイブリット型細胞シート合成過程に発現する細胞骨格関連タンパク第２９５回東京歯科大学学会例会，平成２５年６月１日，千葉市２．梅澤貴志，山根茂樹，井出吉信，阿部伸一骨格筋筋芽細胞シートへの間葉系細胞の影響第５５回歯科基礎医学会学術大会，平成２５年９月２１日，岡山市３．山根茂樹，梅澤貴志，井出吉信，阿部伸一上皮・筋ハイブリット型細胞シート合成過程に発現する細胞骨格関連タンパク第５５回歯科基礎医学会学術大会，平成２５年９月２１日，岡山市４．芹川雅光，梅澤貴志，山根茂樹，井出吉信，阿部伸一，比嘉一成，島﨑潤骨格筋細胞シートの解析第２９６回東京歯科大学学会総会，平成２５年１０月１９日，千代田区５．梅澤貴志，山根茂樹，阿部伸一骨格筋筋芽細胞シートへの間葉系細胞の影響第１１９回日本解剖学会総会全国学術集会，平成２６年３月２８日，下野市６．梅澤貴志，山根茂樹，芹川雅光，阿部伸一間葉系細胞の共培養が骨格筋筋芽細胞の MHC に与える影響第５６回歯科基礎医学会学術大会，平成２６年９月２６日，福岡市 iPS 細胞を用いた硬組織疾患治療法開発のため の基礎的研究 研究代表者東俊文（東京歯科大学・生化学講座）研究分担者小野寺晶子（東京歯科大学・生化学講座），齋藤暁子（東京歯科大学・生化学講座），篠宏美（東京歯科大学・生化学講座），高戸毅（東京大学）１．研究の概要再生医療においては①幹細胞，②シグナル因子， ③足場素材が必要とされる３大要素である。本研究申請は口腔組織内硬組織再生医療の基礎的研究を発展させ臨床応用を目指すこと，および特に iPS 細胞を用いた組織再生あるいは疾患モデルの作成と病態解明，さらには治療法開発を目標としている。２．取組状況幹細胞として iPS 細胞を骨芽細胞へ効率よく分化誘導する方法を開発し，足場材として自己重合ペプチドを用いる方法を開発し報告した。さらに疾患の病態解明，治療法の開発を目的として疾患特異的 iPS 細胞（鎖骨頭蓋異形成症，基底細胞母斑症候群，唇裂口蓋裂）を作製した。３．本事業の成果鎖骨頭蓋異形成症，基底細胞母斑症候群，唇裂口蓋裂患者 iPS 細胞の作製に成功した。 iPS 細胞から効率よく骨芽細胞，骨細胞の分化誘

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５２５歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）導系を確立した。骨細胞，象牙芽細胞の詳細な検討のため，Dmp１-２A ペプチド-Cre マウスを作製し CAG-CAT-EGFP マウスと交配し，骨細胞，象牙芽細胞にのみ EGFP 陽性となる動物作製の準備を終えた。【関連業績】雑誌論文

１．Sato Y, Okamoto-Shibayama K, Azuma T : The malQ gene is essential for starch metabo-lism in Streptococcus mutans. J Oral Micro-biol, ６：５，２０１３．

２．Yamashita H, Ochiai H, Saito A, Shintani S, Azuma T : Phosphoinositide ３-Kinase（PI３K） Activation is Differentially Regulated during Osteogenesis induced by TGF-β１ and BMP-２/BMP-７. J Hard Tissue Biology, ２３⑴：９－１４，２０１４．

３．Okada T, Saito A, Amagai T, Onodera S, Hirai Y, Furusawa M, Azuma T : Side Popula-tion Cells derived from Dental Pulp and Den-tal Germ have Distinct Surface Markers com-pared to Bone Marrow Side Population Cells. J Hard Tissue Biology, ２３⑴：１１９－１２４，２０１４．４．Saito A, Ochiai H, Okada S, Miyata N,

Azuma T : Suppression of Lefty expression in induced pluripotent cancer cells. FASEB J, ２７⑹：２１６５－２１７４，２０１３．

５．Ochiai-Shino H, Kato H, Sawada T, Onodera S, Saito A, Takato T, Shibahara T, Mu-ramatsu T, Azuma T : A novel strategy for enrichment and isolation of osteoprogenitor cells from induced pluripotent stem cells based on surface marker combination. PLoS One, ２０１４ Jun ９；９⑹：e９９５３４．doi：１０ .１３７１ /journal.pone.００９９５３４ .

６．Suzuki E, Ochiai-Shino H, Aoki H, Onodera S, Saito A, Saito A, Azuma T : Akt Activa-tion is Required for TGF-β１-Induced Os-teoblast Differentiation of MC３T３-E１ Pre-Osteoblasts. PLoS One, ２０１４ Dec ３；９⑿： e１１２５６６．doi：１０ .１３７１ /journal.pone.０１１２５６６ . ７．Kato H, Ochiai-Shino H, Onodera S, Saito A,

Takahiko Shibahara, Azuma T : Promoting effect of １, ２５（OH）２ vitamin D３ in osteo-genic differentiation from induced pluripotent stem cells to osteocyte like cells. Open Biol-ogy, ２０１５（in press） .

学会発表１．齋藤暁子，篠宏美，小野寺晶子，東俊文ヒト iPS 細胞の EB 形成時における ALP 発現の動態に関する検討第８６回日本生化学会大会，２０１３年９月，横浜市２．落合－篠宏美，加藤宏，齋藤暁子，小野寺晶子，佐藤裕，東俊文ヒト iPS 細胞から骨細胞への効果的な誘導第８６回日本生化学会大会，２０１３年９月，横浜市３．佐藤裕，柴山和子，東俊文 マルトオリゴ糖の分解に関与する S. mutans malQ遺伝子の特徴付け第５５回歯科基礎医学会，２０１３年９月，岡山市４．小野寺晶子，月野和隆，篠宏美，齋藤暁子，東俊文 BMP/SMAD 経路を介したデキサメタゾンの WNT 阻害因子への関与第３６回日本分子生物学会年会，２０１３年１２月，神戸市５．加藤宏，篠宏美，小野寺晶子，齋藤暁子，林宰央，長谷川大悟，柴原孝彦，東俊文 iPS 細胞から誘導した骨芽細胞を用いた創薬評価第６８回日本口腔科学会学術集会，２０１４年５月，東京都

６．Suzuki E, Ochiai-Shino H, Aoki H, Hayashi T, Takahashi J, Azuma T, Saito A.

TGF-β１ regulates osteoblast differentiation via PI３K/Akt signaling pathway.

The ５７ th Spring Meeting of the Japanese So-ciety of Periodontology, May ２０１４ , Gifu ７．鈴木瑛一，落合（篠）宏美，青木栄人，小野寺

晶子，齋藤暁子，齋藤淳，東俊文

TGF-β１によるマウス前骨芽細胞の分化調節における PI３K/Akt シグナル伝達経路の役割第２９７回東京歯科大学学会，２０１４年６月，東京

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５２６東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ都８．月野和隆，小野寺晶子，吉澤佑世，篠宏美，齋藤暁子，間奈津子，東俊文，村松敬，古澤成博 BMP-Wnt 間のクロストークに対する Dex-amethasone の影響日本歯科保存学会２０１４年度春季学術大会（第１４０回），２０１４年６月，大津市９．東俊文，齋藤暁子，小野寺晶子，加藤宏，篠宏美 iPS 細胞から骨前駆細胞分化誘導および単離の新規方法開発と骨細胞様細胞への分化誘導第３２回日本骨代謝学会学術集会，２０１４年７月，大阪市１０．加藤宏，篠宏美，小野寺晶子，齋藤暁子，林宰央，長谷川大悟，柴原孝彦，東俊文 iPS 細胞から誘導した骨芽細胞を用いた創薬評価－活性型ビタミン D３の効果判定－第３２回日本骨代謝学会学術集会，２０１４年７月，大阪市１１．林宰央，恩田健志，長谷川大悟，加藤宏，篠宏美，横山暁子，小野寺晶子，須賀賢一郎，大畠仁，柴原孝彦，東俊文骨再生における自己組織化ナノペプチドハイドロゲルの応用第２７回日本顎関節学会総会・学術大会，２０１４年７月，福岡市１２．佐藤裕，東俊文 Streptococcus mutansにおけるマルトース代謝の解析第５６回歯科基礎医学会，２０１４年９月，福岡市１３．Suzuki E, Ochiai-Shino H, Aoki H, Onodera

S, Saito A, Azuma T, Saito A.

Akt activation reverses inhibitory effects of TGF-β１ on preosteoblast MC３T３-E１ cell differentiation.

American Academy of Periodontology １００ th Annual Meeting, Sept. ２０１４ , San Francisco １４．林宰央，恩田健志，長谷川大悟，加藤宏，篠宏美，横山暁子，小野寺晶子，高野伸夫，柴原孝彦，東俊文ヒト iPS 細胞を用いた骨再生療法に関する基礎的研究第５９回公益社団法人日本口腔外科学会総会・学術大会，２０１４年１０月，千葉市

１５．Suzuki E, Ochiai-Shino H, Aoki H, Onodera S, Saito A, Azuma T, Saito A.

Akt is a Key Modulator in TGF-β１-Induced Osteoblast Differentiation.

The ６２ nd Annual, Meeting of Japanese Asso-ciation for Dental Research, Dec. ２０１４ , Osaka １６．小野寺晶子，長谷川大悟，齋藤暁子，大高真奈美，渡邊章，西村健，柴原孝彦，片倉朗，中西真人，東俊文基底細胞母斑症候群（Gorlin 症候群）患者由来細胞を用いた疾患特異的ヒト人工多能性幹細胞（iPS 細胞）の樹立第１４回日本再生医療学会総会，２０１５年３月，横浜市１７．齋藤暁子，小野寺晶子，大木章生，長谷川大悟，大高真奈美，中西真人，西村健，渡邊章，柴原孝彦，末石研二，東俊文鎖骨頭蓋骨異形成症患者由来細胞を用いた疾患特異的 iPS 細胞の樹立第１４回日本再生医療学会総会，２０１５年３月，横浜市１８．長谷川大悟，小野寺晶子，齋藤暁子，大高真奈美，渡邊章，西村健，東俊文，片倉朗，中西真人，柴原孝彦基底細胞癌発生機序解明を目指した Gorlin 症候群患者由来ヒト人工幹細胞（iPS 細胞）の樹立第２４回日本有病者医療学会総会・学術大会，２０１５年３月，旭川市

③ 分子生物学的病態解明による診断およ

び予防法の確立

バイオフィルム－宿主生態系に焦点を当てた歯 周炎発症プロセスの解明 研究代表者石原和幸（東京歯科大学・微生物学講座）研究分担者齋藤淳（東京歯科大学・歯周病学講

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５２７歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）座），村松敬（東京歯科大学・歯科保存学講座），新谷誠康（東京歯科大学・小児歯科学講座），武井泉（東京歯科大学・市川総合病院内科学），梅澤一夫（愛知医科大学・分子標的医薬探索寄附講座），西田次郎（東京歯科大学・市川総合病院内科学），岸川浩（東京歯科大学・市川総合病院内科学）１．研究の概要デンタルプラークは７００種を超える細菌による複雑な細菌叢によって構成されており，それによって起こる歯周炎，根尖性歯周組織炎等の口腔感染症の病因についてはまだ未解明の部分が多い。従来の培養や PCR 等による解析ではその全貌をつかむのは非常に困難であったが，近年の分子生物学の進歩は，病巣細菌叢の網羅的解析を可能にしつつある。ヒトの消化器や口腔などに生息する細菌叢の全貌の解析が進むに従って，ある疾患を有する患者の罹患部位では，健常者に比べて細菌叢の多様性や特異性がしばしば見られることも明らかとなってきた。ヒトの各組織でそれぞれ構成されている細菌叢は健康な状態（ホメオスタシス）の維持と密接に関わっており，こうした細菌叢が撹乱されることは何らかの疾患発生に大きく影響すると考えられている。本研究では，歯周炎・齲蝕の病因について，バイオフィルム形成による細菌の病原性変化の観点，複数菌種の感染によって引き起こされる炎症反応のプロセスでのバイオフィルムと宿主との間のクロストークの２点から明らかにすることを目的とした。これによって慢性・侵襲性歯周炎，根尖性歯周組織炎の病態形成に関わるメカニズムを明らかにするとともに，それが宿主に与える影響の解明を目指す。さらに口腔細菌叢のコントロールによって口腔疾患の予防および全身の健康維持を可能にする。２．取組状況 バイオフィルム形成については， Porphyromonas

gingivalisのECFシグマ因子， Capnocytophaga ochracea の autoinducer-２（AI-２）および IX 型分泌機構（T９SS）のバイオフィルム形成に果たす役割について解析を行った。また口腔の日和見感染の主要な病 原体である Candida albicans の病原因子である菌糸 形成能についても解析を行った。予防の可能性につ いては， P. gingivalis に対するワクチンの開発を試 みた。口腔細菌が宿主に与える影響としては，動脈硬化症への関わりについて解析を行った。小児期の齲蝕に関しては，動物実験において齲蝕原性を持つ菌種の定着をわずかでも遅らせることが，その後長期間の齲蝕発生の程度に大きな影響を及ぼすことが示され，非病原性細菌を用いたプロバイオティクスの手法の効果も報告されている。そこで，齲蝕や歯周疾患を中心とした口腔疾患への感受性が低い細菌叢モデルを提示すること目標とし，① リアルタイム PCR 法を用いた齲蝕原性菌および歯周病原性菌の検出，②１６S rRNA をターゲットにした口腔内細菌叢解析を行った。成人の歯周炎患者に対しては①歯周病原細菌の検出と歯周炎の病態との関連の検討，②米ペプチドによるデンタルプラーク形成抑制の評価，③タバコ煙が宿主細胞と歯周病原細菌との相互作用に及ぼす影響の解明，④急性症状を呈する歯周炎の効果的な薬物療法に関する検討を行った。３．本事業の成果 P. gingivalisのバイオフィルム形成へのシグマ因子の関与について解析したところ，６個の ECF シグマ因子のうち，PGN ０２７４と PGN １７４０の欠損によりバイオフィルム形成が上昇したことより，これら２つの ECF シグマ因子はバイオフィルムの調節 に関わっていると考えられた。 C. ochracea のバイ オフィルム形成では，AI-２，T９SS， sprB（本菌の 滑走に関わるタンパク）の欠損株でバイオフィルム形成が低下していたことから，これらのタンパクがバイオフィルム形成に関わることを明らかにした。 ワクチンの開発では， P. gingivalis gingipain の赤血 球凝集／付着ドメインである Hgp４４を，Lactococcus lactisの表面に発現することに成功した。また， C. albicansの Csa２が鉄獲得と菌糸形成に関わることを明らかにした。小児口腔内への歯周病原細菌の定着を解析する と，頻度は低いものの Tannerella forsythia，P. gin

givalis，Treponema denticola，Aggregatibacter actino

mycetemcomitansが検出された。齲蝕経験のある患

児の歯面からは，齲蝕経験のない患児に比べて，小児期から有意に多種の歯周病原細菌が検出され，小

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５２８東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ児期の口腔内状況によっては，歯周病原細菌についても早期の定着を招くことになり，将来の歯周疾患などのリスクも含めた指導と長期の口腔管理が必要であると考えられた。口腔内細菌叢の網羅的解析では，小児は成人（保護者）よりも口腔内に多くの細菌種が検出される傾向にあり，個体間のバリエーションが多い傾向があった。齲蝕原性菌では母子伝播によって感染することが多いとされているが，母子間の口腔内細菌叢は類似していないケースが多く認められた。口腔内細菌叢と口腔内の状況との相関については，現在も検討を行っている。慢性歯周炎患者および侵襲性歯周炎患者の歯肉縁 下プラークサンプルからの P. gingivalis，T. forsythia の検出率は６０％を超えていた。歯周炎の急発を認める患者の歯肉縁下細菌叢の歯周病原性菌の制御を目的としてシタフロキサシン（グレースビット）を投与すると，臨床症状の改善および歯肉縁下プラーク細菌叢の改善が認められた。また，投与前後で，歯周ポケットから臨床分離株を採取し，各種抗菌薬に対する感受性の変化についても検討した。米由来ペプチド CL（１４－２５）はA. actinomycetemcomitans Y４内毒 素がもつ炎症性サイトカイン誘導能を抑制し，洗口液としての効果をみた臨床試験では，臼歯部において有意にプラークの付着量を低下させた。タバコ煙 濃縮液（CSC）と P. gingivalis のヒト歯肉上皮細胞へ の感染の影響の解析では，CSC は濃度によりヒト歯肉上皮細胞の遊走能に対して低濃度では促進，高濃度では抑制の二相性の影響を及ぼしていた。この 作用は， P. gingivalis 感染によりさらに修飾される ことが確認された。【関連業績】雑誌論文

１．Onozawa S, Kikuchi Y, Okamoto-Shibayama K, Kokubu E, Nakayama M, Inoue T, Nakano K, Shibata Y, Ohara N, Nakayama K, Ishihara K, Kawakami T, Hasegawa H : Role of extra-cytoplasmic function sigma factors inbiofilm formation of Porphyromonas gingivalis. BMC Oral Health, １５：４，２０１５．

２．Kokubu E, Kokubun K, Matsuzaka K, Kashi-wagi K, Shiba K, Inoue T, Ishihara K, Yoshi-nari M : The effect of artificial recombinant

bone morphogenetic protein ２ with titanium-binding peptide on a Ti graft in vivo. J Oral Tissue Engin, １２：１－７，２０１４．

３．Imamura K, Kokubu E, Kita D, Ota K, Ishi-hara K, Saito A : Cigarette smoke condensate modulates migration of human gingival epi-thelial cells and their interactions with Porphy

romonas gingivalis. J Periodontal Res early view．doi：１０ .１１１１ /jre.１２２２２

４．Okahashi N, Sumitomo T, Nakata M, Sakurai A, Kuwata H, Kawabata S : Hydrogen peroxide contributes to the epithelial cell death induced by the oral mitis group of streptococci. PLoS One, ２０１４９：e８８１３６５．Sano Y, Okamoto-Shibayama K, Tanaka K,

Ito R, Shintani S, Yakushiji M, Ishihara K : Dentilisin involvement in coaggregation be-tween Treponema denticola and Tannerella for

sythia. Anaerobe, ３０：４５－５０，２０１４．６．笠井俊輔，富田幸代，深谷千絵，井原雄一郎，齋藤淳，中川種昭：慢性歯周炎の急性部位に対するシタフロキサシン経口投与の臨床的および細菌学的効果について．日歯周誌，５６：３９－４８，２０１４．

７．Tomita S, Kasai S, Ihara Y, Imamura K, Kita D, Ota K, Kinumatsu T, Nakagawa T, Saito A : Effects of systemic administration of si-tafloxacin on subgingival microflora and an-timicrobial susceptibility profile in acute peri-odontal lesions. Microb Pathog, ７１－７２：１－７，２０１４．

８．Okamoto-Shibayama K, Kikuchi Y, Kokubu E, Sato Y, Ishihara K : Csa２, a member of the Rbt５ protein family, is involved in the utiliza-tion of iron from human hemoglobin during

Candida albicans hyphal growth. FEMS Yeast Res, １４：６７４－７，２０１４．

９．Ishioka M, Ishizuka Y, Shintani S, Yanagi-sawa T, Inoue T, Sasaki J, Watanabe H : Ex-pression profiles of NOS isoforms in gingiva of nNOS knockout mice. Tissue Cell, ４６：１２２－６，２０１４．

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５２９歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）

１０．Hirota K, Inagaki S, Hamada R, Ishihara K, Miyake Y : Evaluation of a rapid oral bacteria quantification system using dielectrophoresis and the impedance measurement. Biocontrol Sci, １９：４５－９，２０１４．

１１．Hagiwara M, Kokubu E, Sugiura S, Komatsu T, Tada H, Isoda R, Tanigawa N, Kato Y, Ishida N, Kobayashi K, Nakashima M, Ishihara K, Matsushita K : Vinculin and Rab５ complex is required for uptake of Staphylococcus aureus and interleukin-６ expression. PLoS One, ２０１４９：e８７３７３．

１２．Ao M, Miyauchi M, Inubushi T, Kitagawa M, Furusho H, Ando T, Ayuningtyas NF, Na-gasaki A, Ishihara K, Tahara H, Kozai K, Takata T : Infection with Porphyromonas gin

givalis exacerbates endothelial injury in obese mice. PLoS One, ２０１４９：e１１０５１９．

１３．Koga T, Matsukubo T, Okuda K, Ishihara K : Effect of clinical factors on bacterial con-tamination of bone chips collected during im-plant surgery. Imim-plant Dent, ２２：５２５－９，２０１３．

１４．Tomita S, Komiya-Ito A, Imamura K, Kita D, Ota K, Takayama S, Makino-Oi A, Kinu-matsu T, Ota M, Saito A : Prevalence of

Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphy

romonas gingivalis and Tannerella forsythia in Japanese patients with generalized chronic and aggressive periodontitis. Microb Pathog, ６１－６２：１１－５，２０１３．

１５．Tsujino K, Yonezu T, Shintani, S : Effects of different combinations of fused primary teeth on eruption of the permanent successors. Pe-diatr Dent, ３５：E６４－７，２０１３．

１６．Yamamoto I, Ishihara K, Muramatsu K, Wada Y, Kiwaki M, Kushiro A, Okuda K : Ex-pression of Porphyromonas gingivalis gingipain antigen Hgp４４ domain on surface of Lactococ

cus lactis. Bull Tokyo Dent Coll, ５４：２３３－４１，２０１３．

１７．Yonekura T, Homma H, Sakurai A, Moriguchi

M, Miake Y, Toyosawa S, Shintani S : Identifi-cation, characterization, and expression of dentin matrix protein １ gene in Xenopus lae-vis. J Exp Zool B Mol Dev Evol, ３２０：５２５－３７，２０１３．

１８．Yonezu T, Arano-Kojima T, Kumazawa K, Shintani S : Association between feeding methods and sucking habits : a cross-sectional study of infants in their first １８ months of life. Bull Tokyo Dent Coll, ５４：２１５－２１，２０１３．１９．Yonezu T, Kojima T, Kumazawa K, Shintani

S : Longitudinal investigation of relationship between developmental changes in sagittal oc-clusion and caries in lower first permanent molars. Bull Tokyo Dent Coll, ５４：２０９－１３，２０１３．総説・解説石原和幸：歯周炎と心冠状動脈疾患．日本臨床腸内微生物学会誌，１５：１９－２１，２０１３．図書１．石原和幸（分担執筆）：歯周炎．口腔微生物学－感染と免疫－第４版，pp．３４８－３６１，学建書院，東京，２０１３．２．齋藤淳（分担執筆）：歯周疾患のリスク評価．口腔衛生学，pp．２１３－２１９，一世出版，東京，２０１４．学会発表１．柴山和子，菊池有一郎，国分栄仁，佐藤裕，石原和幸 Candida albicansの二形成変換に関与する細胞表層タンパク質コード遺伝子第５５回歯科基礎医学会学術大会・総会岡山９月２０－２２日 J Oral Biosci，５５：２２４，２０１３．２．今村健太郎，国分栄仁，喜田大智，太田功貴，白石友子，石原和幸，齋藤淳 タバコ煙が Porphyromonas gingivalis と歯肉上 皮細胞との相互作用に及ぼす影響第５６回春季日本歯周病学会学術大会，東京都江戸川区，平成２５年５月３１日日歯周誌５５（春季特別号）：９４，２０１３．３．山下治人，熊澤海道，浅井知宏，桜井敦朗，

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５３０東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ

今井裕樹，新谷誠康

根尖性歯周炎を伴う歯内歯の３例平成２５年５月２３－２４日

小児歯科学雑誌，５１：２５２，２０１３．

４．Imamura K, Kita D, Kokubu E, Ishihara K, Saito A.

Effect of cigarette smoke condensate on in vitro wound healing of human gingival epithe-lial cells.

５０ th

Anniversary Symposium, University at Buffalo Oral Biology Graduate Program, Buf-falo, NY, USA, Adv Dent Res ２６：６６，２０１４．５０ th

Anniversary Symposium, University at Buffalo Oral Biology Graduate Program, Buf-falo, NY, USA，平成２５年６月１２－１４日

５．菊池有一郎，柴山和子，国分栄仁，大原直也，中山浩次，石原和幸 バイオフィルム形成における Porphyromonas gingivalisECF シグマ因子の役割第５５回歯科基礎医学会学術大会・総会岡山９月２０－２２日２０１３．５５：２２９．６．髙山沙織，大久保信貴，加藤哲男，齋藤淳米ペプチド CL の歯周病原細菌内毒素活性の抑制効果日本歯科保存学会２０１３年度春季学術大会（第１３８回）プログラムおよび講演抄録集，p．６８．日本歯科保存学会２０１３年度春季学術大会（第１３８回），福岡市，平成２５年６月２８日７．喜田大智，菊池有一郎，国分栄仁，柴山和子，齋藤淳，石原和幸 Capnocytophaga ochraceaのバイオフィルム形成への Por 分泌機構の関与

J. Oral Biosci. Supple：２２９，２０１３．

第５５回歯科基礎医学会学術大会・総会，岡山市，平成２５年９月２２日８．岩本昌士，村松恭太郎，国分栄仁，稲垣覚，石原和幸，髙野伸夫，柴原孝彦，竹下徹，山下喜久歯性感染症患者の膿汁における細菌の T-RFLP 解析（第二報）日本口腔科学会雑誌，６２：１１９，２０１３．第６６回 NPO 法人日本口腔科学会学術集会，広島，平成２５年５月１７－１８日

９．Horiuchi A, Nukaga T, Asai T, Ishihara K. Synergistic effect between Parvinomas micra and other periodontopathic bacteria.

９１ st General Session & Exhibition of the IADR, March ２０－２３ , Seattle, USA

J Dent Res，９２：１３６５，２０１３．１０．Miyai Y, Sato T, Ishihara K.

Characterization of dentipain, a Treponema denticola protease ９１ st General Session & Ex-hibition of the IADR, March ２０－２３ , Seattle, USA

J Dent Res，９２：１４１８，２０１３．

１１．Saito K, Okamoto-Sibayama K, Katakura A, Ishihara K.

Auto-inducer-２ regulates Capnocytophaga ochracea biofilm formation ９１ st General Ses-sion & Exhibition of the IADR, March ２０－２３ , Seattle, USA

J Dent Res，９２：３８２２，２０１３．

１２．Tanaka K, Kikuchi Y, Shintani S, Kuramitsu HK, Ishihara K.

Characterization of an ABC-type bacteriocin exporterlike protein in Treponema denticola. ５０ th Anniversary Symposium of the Univer-sity at Buffalo Oral Biology Graduate Pro-gram, June １２－１４ in Baffalo, New York Adv Dent Res，２６：５８，２０１３．

１３．笠井俊輔，深谷千絵，井原雄一郎，富田幸代，齋藤淳，中川種昭慢性歯周炎の急性症状に対するシタフロキサシン経口投与の効果について第５６回秋季日本歯周病学会学術大会，前橋市，平成２５年９月２２日日歯周誌５５（秋季特別号）：１１９，２０１３．１４．富田幸代，笠井俊輔，藤田貴久，大久保信貴，井原雄一郎，藤本芳弘，齋藤淳，中川種昭シタフロキサシン経口投与による歯周炎急発部位の細菌叢の変化と薬剤感受性の検討第５６回秋季日本歯周病学会学術大会，前橋市，平成２５年９月２２日日歯周誌５５（秋季特別号）：１２０，２０１３．

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５３１歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）１５．加藤哲男，国分栄仁，谷口正之，齋藤淳，斎藤英一，石原和幸米由来 CL ペプチドの内毒素活性に対する抑制効果，２０１３．０９２０１３．

Journal of Oral Biosciences Supplement，２０１３：１２９．１６．今村健太郎，国分栄仁，喜田大智，太田功貴，石原和幸，齋藤淳 タバコ煙抽出液の暴露と Porphyromonas gin givalis感染がヒト歯肉上皮細胞の機能に及ぼす影響第２９６回東京歯科大学学会総会，東京都千代田区，平成２５年１０月１９日歯科学報１１３：２０１３．１７．髙山沙織，今村健太郎，喜田大智，加藤哲男，齋藤淳 米ペプチドCLは Aggregatibacter actinomycetem comitansLPS によるヒト大動脈内皮再オブからの IL-６産生を抑制する第２９６回東京歯科大学学会総会，東京都千代田区，平成２５年１０月１９日歯科学報１１３：２０１３．１８．額賀智之，田中公子，菊池有一郎，新谷誠康，村松敬，古澤成博，石原和幸

Treponema denticolaにおける Bacteriocin ABC transpoter 様遺伝子の解析

第２９６回東京歯科大学学会総会，平成２５年１０月１９－２０日，東京

歯科学報，１１３：４２３，２０１３．

１９．Kita D, Imamura K, Ohta K, Fujise K, Hay-ashi T, TakahHay-ashi J, Saito A, Ishihara K. Involvement of the Por secretion system in biofilm formation of Capnocytophaga ochracea． 平成２６年５月２２－２４，岐阜

日歯周誌，５６：２３，２０１４．

２０．Tanaka K, Kikuchi Y, Shintani S, Kuramitsu HK, Ishihara K.

Characterization of bacteriocin associated pro-tein in Treponema denticola.

Gordon Conference, Spirochetes, Biology of January １９－２４ , Ventura, USA, ２０１４．

２１．永井宜子，桜井敦朗，本間宏実，田中公子，新谷誠康小児の有色歯面プラークに含まれる細菌種と齲蝕経験歯数の相関第２９７回東京歯科大学学会例会，東京都千代田区，平成２６年６月７日歯科学報，１１４：２９２，２０１４．２２．富田幸代，藤田貴久，山田茂子，塩崎昭美，中川種昭，齋藤淳シタフロキサシン経口投与による歯周炎急性部位の細菌叢と薬剤感受性の変化の検討第２９７回東京歯科大学学会例会，東京都千代田区，平成２６年６月７日歯科学報１１４：２９５，２０１４．

２３．Kita D, Imamura K, Ohta K, Fujise K, Hay-ashi T, TakahHay-ashi J, Saito A, Ishihara K. Involvement of the Por secretion system in biofilm formation of Capnocytophaga ochracea． 第５７回春季日本歯周病学会学術大会，岐阜市，平成２６年５月２３日

日歯周誌，５６：１１２，２０１４．

２４．Tanaka K, Kikuchi Y, Shintani S, Kuramitsu HK, Ishihara K.

Characterization of bacteriocin associated pro-tein in Treponema denticola.

Gordon Conference, Spirochetes, Biology of January １９－２４ , Ventura, USA, ２０１４．

２５．髙山沙織，今村健太郎，喜田大地，加藤哲男，齋藤淳米ペプチド CL の歯周病原細菌に対する抑制効果第５７回春季日本歯周病学会学術大会，岐阜市，平成２６年５月２４日日歯周誌５６（春季特別号）：１０３，２０１４．２６．大石匠，深谷千絵，笠井俊輔，国分栄仁，齋藤淳，石原和幸，中川種昭シタフロキサシンの人口バイオフィルムに対する抗菌力の検討米ペプチド CL の歯周病原細菌に対する抑制効果第５７回春季日本歯周病学会学術大会，岐阜市，平成２６年５月２３日日歯周誌５６（春季特別号）：１１６，２０１４．２７．齊藤教子，三條祐介，酒井克彦，石原和幸，

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５３２東京歯科大学口腔科学研究センターワークショップ

片倉朗

Capnocytophaga ochraceaの Auto-inducer-２のバイオフィルム形成における役割平成２５年５月２２－２４日，栃木日本口腔科学会雑誌，６３：１８２－１８３，２０１４．２８．永井宜子，桜井敦朗，本間宏実，田中公子，新谷誠康小児の有する成熟歯面バイオフィルム構成細菌種の解析２０１４年４月小児歯科学雑誌，５２：２８７，２０１４．２９．喜田大智，菊池有一郎，国分栄仁，柴山和子，齋藤淳，中山浩次，石原和幸 Capnocytophaga ochraceaの滑走運動とバイオフィルム形成への IX 型分泌機構の関与第５６回歯科基礎医学会学術大会，福岡市，平成２６年９月２６日

J. Oral Biosci, Suppl, p．１６４，２０１４．

３０．関野仁，柴山和子，藤瀬和隆，中川種昭，齋藤淳，石原和幸 Treponema denticolaの抗菌薬感受性第２９８回東京歯科大学学会総会，東京都千代田区，平成２６年１０月１８日歯科学報，１１４：５０３，２０１４．３１．本間宏実，桜井敦朗，高橋直子，江木勝彦，永井宜子，新谷誠康小児口腔の乳酸桿菌属細菌を中心とした口腔内細菌の構成と齲蝕発生への影響小児歯科学雑誌，５２：１３２－１３３，２０１４．３２．喜田大智，菊池有一郞，今村健太郎，国分栄仁，柴山和子，黒田美智代，山之内一也，齋藤淳，石原和幸 Capnocytophaga ochraceaの IX 型分泌機構のバイオフィルム形成への関与第２９８回東京歯科大学学会総会，東京都千代田区，平成２６年１０月１８日歯科学報，１１４：５０２，２０１４．３３．太田功貴，菊池有一郞，今村健太郎，吉川幸輝，喜田大智，白石友子，藤瀬和隆，国分栄仁，齋藤淳，石原和幸

Porphyromonas gingivalisECF シグマ因子が歯肉上皮細胞への侵入に及ぼす影響第５７回秋季日本歯周病学会学術大会，神戸市，平成２６年１０月１９日日歯周誌５６（秋季特別号）：１１０，２０１４．３４．富田幸代，笠井俊輔，長野恭輔，清田築，中川種昭，齋藤淳慢性歯周炎の急性症状に対するシタフロキサシン経口投与後の細菌叢の変化とキノロン低感受性菌の消長第５７回秋季日本歯周病学会学術大会，神戸市，平成２６年１０月１９日日歯周誌５６（秋季特別号）：１２７，２０１４．３５．今村健太郎，勢島典，齋藤淳タバコ煙濃縮物刺激下における歯肉上皮細胞の Porphyromonas gingivalis感染に対する反応の検討日本歯科保存学会２０１４年度秋季学術大会（第１４１回），山形市，平成２６年１０月３０日日本歯科保存学会２０１４年度秋季学術大会（第１４１回）プログラムおよび講演抄録集，p．８ 唾液エクソソームによる口腔がんおよび全身疾 患診断法の確立 研究代表者矢島安朝（東京歯科大学・口腔インプラント学講座）研究分担者芝清隆（（公益）がん研究会・がん研究所），柴原孝彦（東京歯科大学・口腔外科学講座），吉成正雄（東京歯科大学・口腔科学研究センター），片倉朗（東京歯科大学・オーラルメディシン・口腔外科学講座），橋本貞充（東京歯科大学・生物学），村松敬（東京歯科大学・歯科保存学講座），佐々木穂高（東京歯科大学・口腔インプラント学講座）１．研究の概要エクソソームはほとんど全ての細胞から放出されるナノサイズ（直径３０－１００nm）の小胞で，唾液，血液，尿など全身のあらゆる体液に存在する。エクソソームはそれを放出した細胞に由来するタンパク質

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５３３歯科学報 Vol．１１５，No．６（２０１５）や mRNA，miRNA などを含み，これを他の細胞へと伝達することが分かっている。がんの転移や神経変性などの疾患に関わっていることが次々と明らかにされつつあり，また，容易に体液から回収できることから，リキッド・バイオプシーの切り札としても期待が集まっている。唾液腺細胞から放出されるエクソソームの性質が，唾液腺以外の細胞から放出されるエクソソームの影響をうけるといった報告もある。したがって唾液中のエクソソームの解析は，口腔内疾患のみならず，他の疾患の診断にもつながる可能性の高い診断法である。本研究は，唾液中エクソソームに焦点をあて，特に口腔がんおよび全身疾患の有効な診断法を確立することを目的とする。２．取組状況＊唾液エクソソーム精製サンプルの回収率および保存方法の検討これまでの方法では，エクソソームの精製サンプルの回収率および保存方法の検討が，十分なされていなかった。そのため，より安定した検体の獲得を目指して超遠心の遠心条件を詳細に検討し，より高効率で回収できる条件をほぼ完成した。＊スループットの改善より効率よく臨床検体を調査できるように，密度勾配形成方法や，超遠心における重力を検討しながら，スループットの向上を目指している。現在，条件検討を実施中である。＊各参画機関における倫理委員会承認の獲得対象疾患の選定（口腔がん，糖尿病，自己免疫疾患，口腔乾燥症など），健常者唾液検体の入手方法，さらには，検査対象分子や目標検体数の設定，サンプリング方法の統一などをワーキンググループ内で決定し，各機関での倫理審査を計画進行中である。＊機関間での唾液検体採取・解析体制の整備患者検体を採取する人や場所（水道橋病院，千葉病院，市川総合病院）に関する体制を整え，迅速に解析場所であるがん研究所に移動できるようなプロトコールの検討が進行中である。３．本事業の成果＊ハイスループットな唾液エクソソーム精製方法の確立唾液の前処理方法と密度勾配メディアを最適化する事により，密度勾配遠心法を用いて，１５ml 唾液からエクソソーム濃縮分画が得られた事は前回に報告した通りである。ここからさらに，唾液量のスケールダウンと精製時間の短縮を目的として，唾液量と超遠心機，使用ローター（スイング，アングルローター）を中心に検討した。ウェスタンブロット解析の結果，精製の全行程を卓上型超遠心機とアングルローターを用いる事で，１５ml 唾液の精製結果と同様に一般的なエクソソーム密度とされる密度約１．１０g/ml の分画でエクソソーム濃縮分画が得られた。この確立した方法により約１９時間の精製時間短縮に成功した。＊唾液エクソソームの性質解析（ハイスループット精製法における）ハイスループット精製法にて分画した健常人８検体サンプルを用いて，ウェスタンブロットおよび RT-PCR 法により解析を行った。ウェスタンブロットの結果，シグナルの強度は検体間で差異があるが，全ての検体において一般的なエクソソーム密度とされる密度１．１０g/ml の分画に最も強いシグナルが得られた。RT-PCR 法にて，９３種類の miRNA の遺伝子発現を解析した結果，いくつかの miRNA がエクソソームマーカー発現分画で，強く発現した。これにより，本研究で確立した解析条件で，患者検体から大規模に miRNA 解析やタンパク質マーカー解析が可能であることを確認できた。＊倫理委員会申請手続き東京歯科大学水道橋病院，市川総合病院，千葉病院では，糖尿病患者と口腔がん患者の唾液を，がんけん有明病院では唾液腺疾患患者の唾液を採取できるよう，各施設における倫理委員会申請手続きを計画中である。【関連業績】学会発表１．岩井千弥，松村幸子，芝清隆密度勾配メディアの選択が唾液エクソソームの精製度に与える影響について第５回日本 RNAi 研究会，平成２５年８月２９日，広島２．岩井千弥，吉田光孝，芝清隆，吉成正雄，矢島安朝唾液エクソソーム精製条件の確立第４３回公益社団法人日本口腔インプラント学会