WT Polε

Fiberアッセイを開始した。

DNA Fiberアッセイの結果、Mre11, CtIP, DNA2ヌクレアーゼのいずれの欠 損細胞においても、カンプトテシン存在下において野生型細胞と同程度の複製 の遅れが見られ、カンプトテシン存在下で複製の遅れが見られなかったのはPol ε^exo- 細胞のみであることがわかった (Fig. 19-21)。このことから、Fork

reversalを形成する際の相同組換えは、Polεエキソヌクレアーゼ活性による末

端DNA除去に依存して開始されることがわかった。

Fig. 19 Polε^exo- 細胞のみが、カンプトテシン存在下に DNA Fiberが短くならない

Mre11Δでは100 ng/ μL Doxを添加してから72 h経過後、CtIP ΔおよびDNA2ΔではDoxを添加してから24 h経過後にCldU添 加を開始した。

CPT - 1 μM CPT

WT

Fig. 20 Polε^exo- 細胞のみが、カンプトテシンによる 複製フォーク停止が不良になる (平均値グラフ)

縦軸 (CldU/ IdU)はCldUを取り込んで複製したDNAの長さを、

IdUを取り込んで複製したDNAの長さで割った値を示す。Mre11 Δでは100 ng/ μL Doxを添加してから72 h経過後、CtIPΔおよ びDNA2ΔではDoxを添加してから24 h経過後にCldU添加を開 始した。CPT -は1回おこなった。1 μM CPT処理による実験は 2回おこない、平均値を算出しグラフに示し、標準偏差を算出し誤 差範囲とした。

Fork reversal Polε

WT Polε^exo- Mre11Δ CtIPΔ DNA2Δ 0

1 2 3

ldI/ IdU

DNA Fiber (DT40)

CPT- CPT+

CPT - 1 μM CPT

(A) WT 細胞 (B) Polε^exo- 細胞

(C) Mre11Δ (D) CtIPΔ

WT CPT- WT CPT+

Polεexo CPT- Polεexo CPT+

Mre11 CPT- Mre11 CPT+

CtIP CPT- CtIP CPT+

Dna2 CPT- Dna2 CPT+

WT CPT - WT 1 μM CPT Polε^exo- CPT - Polε^exo- 1 μM CPT Mre11Δ CPT - Mre11Δ 1 μM CPT CtIPΔ CPT - CtIPΔ 1 μM CPT DNA2Δ CPT - DNA2Δ 1 μM CPT 0

0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0 1 2 3 4 5

Frequency

CldU/ IdU CldU/ IdU (WT)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0 1 2 3 4 5

Frequency

CldU/ IdU CldU/ IdU (Polε^exo-)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0 1 2 3 4 5

Frequency

CldU/ IdU CldU/ IdU (Mre11Δ)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0 1 2 3 4 5

Frequency

CldU/ IdU CldU/ IdU (CtIPΔ)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

0 1 2 3 4 5

Frequency

CldU/ IdU CldU/ IdU (DNA2Δ)

Fig. 21 Polε^exo- 細胞のみが、カンプトテシンによる 複製フォーク停止が不良になる (ヒストグラム)

観察した100本以上のFiberについて、各FiberのCldUを取り 込んだDNAと、IdUを取り込んだDNAの比のヒストグラムを作 成した。横軸は、その比を示し、階級とした。0~1は0.25刻み、

1~3は0.1刻み、3~5は1刻みとした。縦軸は、各階級における度 数を算出し、割合を示した。Mre11Δでは100 ng/ μL Doxを添 加してから72 h経過後、CtIPΔおよびDNA2ΔではDoxを添加 してから24 h経過後にCldU添加を開始した。CPT -は1回おこ

なった。1 μM CPT処理による実験は2回おこない、平均値を算

出しグラフに示した。

第 4 章 まとめ

本研究により、Polεエキソヌクレアーゼ活性は、カンプトテシン損傷応答に

おいて、Fork reversalを形成する際に関与することが示唆された。このことか

ら、Polεエキソヌクレアーゼ活性は、カンプトテシン投与により生じた損傷に

対し、Fork reversal形成による応答経路を用いて耐性化を示すことが推察され

る。この推察を確証するためには、形成されたFork reversalを可視化すること が必要である。その手段として、電子顕微鏡を用いた Fork reversal 観察実験 (Hashimoto et al., 2010)を行うことが、本研究の今後の課題である。

また本研究により、カンプトテシン損傷応答においてPolεエキソヌクレアー ゼ活性が PARP タンパク質と同一経路で作用することが明らかとなった。

PARPは広く研究が進められており (Morales et al., 2014)、PARPが乳がん、

子宮体がん、肺がん、胃がんを含め多くのがんと関わっているという報告があ る (Ossovskaya et al., 2010)。そして、多くのがん細胞でPolεエキソヌクレア ーゼ活性に変異が生じているという報告がある (Hoang et al., 2015)。Polεエ キソヌクレアーゼ活性がもつカンプトテシン耐性化機構が明らかになれば、

PARPも絡めた抗がん剤カンプトテシンを用いた治療の発展が期待される。

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