tRNA 修飾ヌクレオシドと tRNA の構造安定性

るものである. NMR スペクトル分析では, tRNA の一部の塩基配列に焦点を絞っており, オリ ゴヌクレオチドを用いる解析がほとんどである. そのため, tRNA の局所的な構造安定性の情 報しか得られない. また, X 線結晶構造解析では 全長 tRNA を用いているが, その報告例は少 ない. このような背景から, 修飾ヌクレオシドと tRNA 分子全体の安定性の相関については, ほとんど未解明であった. そこで, 本研究では tRNA の融解温度を測定した. この方法は, 古典 的な生化学的手法であるが, tRNA の三次構造全体の安定性を評価するには, 非常に有効な手 段である. さらに, 1 つだけ修飾ヌクレオシドを欠失した hypomodified tRNA^Ser を利用するこ とで, どの修飾ヌクレオシドが tRNA 構造安定化あるいは不安定化に寄与するのか評価する ことができた. その結果, tRNA^Ser に存在する 6 つの修飾ヌクレオシドはどれも, Tm の減少を 招いた. ここで, s⁴U8, Gm18, T54, Ψ55 は tRNA の三次構造における塩基対 (s⁴U8-A14, Gm18-Ψ55, T54-A58) を, Ψ40 は anticodon stem における塩基対 (G30-Ψ40) を形成している (図 3-3-1).

さらに, ウリジンのチオール化, リボースのメチル化, プソイドウリジン化 は tRNA の構造安 定化をもたらすと予想されてきた. 本研究では実際に, これらの修飾ヌクレオシドが tRNA の 構造安定化に関わる重要な因子であることを生化学的実験により示すことができた. 興味深 いことに, tRNA^Ser に存在する修飾ヌクレオシドのなかで, 唯一塩基対を形成しないジヒドロ ウリジンも tRNA の構造安定化に働く修飾ヌクレオシドであることが判明した. しかしなが ら, tRNA の D-loop のウリジンがジヒドロウリジンになると, D-loop は C3’-endo パッカリン グから C2’-endo パッカリングへと構造変化を起こし, その結果, D-loop は不安定な構造にな る (Dalluge et al., 1996). さらに, 低温菌の tRNA に存在するジヒドロウリジンの平均的な数は, 中温菌や好熱菌のそれよりも多いと報告されている (Dalluge et al., 1997). そのため, tRNA の 構造安定化に寄与する, ウリジンのチオール化, リボースのメチル化, プソイドウリジン化と は対照的に, ジヒドロウリジン化は tRNA の構造不安定化をもたらすと考えられてきた. しか しながら, 本研究で得られた結果から, ジヒドロウリジン化は, tRNA の三次構造全体の安定 化につながることが判明した. ジヒドロウリジンが存在する D-loop には, V-/T-loop に存在す る塩基と三次構造における塩基対を形成する塩基が集中している (図 3-3-1). つまり, ジヒド ロウリジンの獲得によって tRNA の D-loop は構造不安定になるが, この不安定化が tRNA の 複雑な三次構造における塩基対形成 (A14-U8, G15-C48, G18-U55, G19-C56) を促す働きをし ていると思われる. その結果, tRNA の三次構造全体をより強固な構造にすると推論した.

8

14

15 19

20a

30 40

48 55

56 54

58 18

A G G A s⁴U UG C C G U A

Gm G

C D G A G

・ ・ ・ ・ GG U G A G G

・

・

・

・

・

・

・ CC A C UC C

C C A

C C C C C

G G G G G

U A A G Ψ C T

・ ・ ・ ・ ・

C U

G G AC AA G U G Ψ G C G

A C G

・

・

・

・

・

G UA

G C

C A A UA U

U C

G A C

・・

・・

・ G

14 8 15 18

19 20a

30 40

48

55 54 56

58

図 3-3-1 E. coli tRNA^Ser(GGA) に見受けられる三次構造における塩基対

(A) E. coli tRNA^Serのクローバーリーフモデル. tRNA の三次構造における塩基対を形成するヌクレオ

シドの組合せを色別に示した. Anticodon stem に存在する修飾ヌクレオシド Ψ40 と G30 の二次構造 における塩基対は橙色で示した. また, 唯一塩基対を形成しない修飾ヌクレオシド D20a は赤色で示 してある.

(B) E. coli tRNA^Ser の三次構造における塩基対の位置. Yeast tRNA^Phe (PDB ID: 1EHZ) に基づいて PyMOL software (www.pymol.org) を用いて作成した. Yeast tRNA^Phe には 20a 位のヌクレオシドが存在 しないため, 20 位のヌクレオシドを 20a 位のヌクレオシドに見立てた. 表記法は (A) と同じである.

また, 水色の点線は水素結合を示している.

B A