pfl 破壊株

54

遺伝子破壊 (2)

• 嫌気条件下で生産される代謝物質の合成反応の破壊の 影響を調べる。

• 計算条件

–

通気条件

•

完全嫌気

–

計算対象

1.

野生型株

55

遺伝子破壊 (3)

# program3_3

clear

load('ecoli_core_model.mat');

changeCobraSolver('glpk');

#

完全嫌気条件

model = changeRxnBounds(model,'EX_o2(e)',0,'b');

# 野生型株

result1 = optimizeCbModel(model);

# pfl破壊

model = changeRxnBounds(model,'PFL',0,'b');

result2 = optimizeCbModel(model);

# pfl

破壊株の酸素取込み速度の影響を解析

fOxygen(model, 0, 25);

title('delta-pfl')

# データのエクスポート

flux2txt('test3_3.txt', [result1.x,result2.x]);

1.

「

test3_3.txt

」ファイルを開き、全てコ

2.

ピー 「

Ecoli_core_model.xls

」ファイルの

「

reactions (result)

」シートの右端の 列に貼り付け

3.

「代謝マップ

EcCore.xlsx

」ファイルの

「代謝マップ」シートの「Flux1」の列に 貼り付け

遺伝子破壊 (3)

56

遺伝子破壊 (4)

• pfl 破壊により代謝状態が変化

エタノール

酢酸 ギ酸

酢酸 エタノール

野生型株

pfl

^破壊株

遺伝子破壊 (5)

• 練習問題

–

嫌気条件下でのコハク酸生産を目指す。

–

完全嫌気条件下において、生産速度が高い物質の生産に関す る遺伝子を順に破壊し、コハク酸生産が増加する遺伝子破壊株 を予測する。

• 計算条件

–

グルコース取込み速度

• 10 mmol/gDCW/h

–

通気条件

•

完全嫌気

• 回答

• program3_4.m

58

反応を代謝モデルに追加 (1)

•

大腸菌が元来生産しない物質について異種生物の生産経路を付与し、

生産性を向上する破壊対象の遺伝子を発見したい

•

使用する関数

– addReaction_Octave

– COBRA toolbox

の関数

addReaction

を、

Octave

用に微修正した もの

反応を代謝モデルに追加 (2)

• model = addReaction_Octave(model, addRxnNames, addRxnList)

•

入力

– model

•

代謝モデル

– addRxnNames

•

追加する反応の名前

– addRxnList

•

追加する反応のリスト

• A + B -> C + D

• C <==> 2 D

など

•

出力

– model

•

新しい反応が追加された代謝モデル

60

反応を代謝モデルに追加 (3)

• n-Butanol

生合成反応を追加

反応名(略称) 反応名 反応式

Btoh1 Acetyl-CoA acetyltransferase 2 accoa[c] -> aacoa[c] + coa[c]

Btoh2 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase aacoa[c] + h[c] + nadh[c] -> 3hbcoa[c] + nad[c]

Btoh3 3-hydroxyacyl-CoA dehydratase 3hbcoa[c] -> b2coa[c] + h2o[c]

Btoh4 btcoa dehydrogenase b2coa[c] + nadh[c] + h[c] -> btcoa[c] + nad[c]

Btoh5 Butanal dehydrogenase btcoa[c] + nadh[c] + h[c] -> btal[c] + coa[c] + nad[c]

Btoh6 Butanol dehydrogenase btal[c] + nadh[c] + h[c] -> btoh[c] + nad[c]

Btoh_t Butanol transport reaction btoh[c] + h[c] <==> btoh[e] + h[e]

EX_btoh(e) Butanol exchange reaction btoh[e] ->

accoa aacoa 3hbcoa b2coa btcoa

btal btoh

btoh[e]

accoa coa NADH NAD

H H₂O NADH NAD

H

NAD CoA NADH NADH H

NAD H H H

反応を代謝モデルに追加 (4)

# program_addReaction_1

clear

load('ecoli_core_model.mat');

changeCobraSolver('glpk');

% モデルに追加する代謝反応名リスト

addRxnNames = {'Btoh1‘,'Btoh2‘,'Btoh3‘,'Btoh4‘,'Btoh5‘,'Btoh6‘,'Btoh_t''EX_btoh(e))'};

% モデルに追加する代謝反応式

addRxnList = { '2 accoa[c] -> aacoa[c] + coa[c]‘, 'aacoa[c] + h[c] + nadh[c] -> 3hbcoa[c] + nad[c]‘, '3hbcoa[c] -> b2coa[c] + h2o[c]', 'b2coa[c] + nadh[c] + h[c] -> btcoa[c] + nad[c]‘, 'btcoa[c] +

nadh[c] + h[c] -> btal[c] + coa[c] + nad[c]‘, 'btal[c] + nadh[c] + h[c] -> btoh[c] + nad[c]‘, 'btoh[c] + h[c] <==> btoh[e] + h[e]‘, 'btoh[e] ->'};

% 新しい代謝反応を代謝モデルに付加

model = addReaction_Octave(model, addRxnNames, addRxnList);

model.description = 'Ecoli_core_butanol_model';

% 付け加えた代謝反応にフラックスが流れるかを確認 model = changeObjective(model,model.rxns,0);

model = changeObjective(model,'EX_btoh(e)',1);

result = optimizeCbModel(model);

disp(result.f)

62

反応を代謝モデルに追加 (5)

• n-Butanol

生合成反応をまとめてしまう

反応名(略称) 反応名 反応式

Btoh Acetyl-CoA acetyltransferase 2 accoa[c] + 4 NADH[c] + 4 H[c] ->

btoh[c] + 4 NAD[c] + 2 coa[c] + h2o[c]

Btoh_t Butanol transport reaction btoh[c] + h[c] <==> btoh[e] + h[e]

EX_btoh(e) Butanol exchange reaction btoh[e] ->

accoa btoh btoh[e]

accoa

4NAD 2coa

H₂O 4NADH

4H H H

反応を代謝モデルに追加 (6)

# program_addReaction_2

clear

load('ecoli_core_model.mat');

changeCobraSolver('glpk');

% モデルに追加する代謝反応名リスト

addRxnNames = {'Btoh‘,'Btoh_t''EX_btoh(e))'};

% モデルに追加する代謝反応式 addRxnList = {

'2 accoa[c] + 4 nadh[c] + 4 h[c] -> btoh[c] + 4 nad[c] + 2 coa[c] + h2o[c]‘

'btoh[c] + h[c] <==> btoh[e] + h[e]‘

'btoh[e] ->‘

};

% 新しい代謝反応を代謝モデルに付加

model = addReaction_Octave(model, addRxnNames, addRxnList);

model.description = 'Ecoli_core_butanol_model';

% 付け加えた代謝反応にフラックスが流れるかを確認 model = changeObjective(model,model.rxns,0);

model = changeObjective(model,'EX_btoh(e)',1);

result = optimizeCbModel(model);

disp(result.f)

64

反応を代謝モデルに追加 (7)

• 1,3-Propanediol

生合成反応

反応名(略称) 反応名 反応式

13PD_1 glyc3P dehydrogenase dhap[c] + h[c] + nadph[c] -> glyc3p[c] + nadp[c]

13PD_2 glyc3p phosphatase glyc3p[c] + h2o[c] -> glyc[c] + pi[c]

13PD_3 Glycerol dehydratase glyc[c] -> 3hpa[c] + h2o[c]

13PD_4 13PD dehydrogenase 3hpa[c] + nadh[c] + h[c] -> 13pd[c] + nad[c]

13PD_t 13PD transport reaction 13pd[c] -> 13pd[e]

EX_13pd(e) 13PD exchange reaction 13pd[e] ->

• Isobutanol

生合成反応

反応名(略称) 反応名 反応式

iBtoh_1 alac synthase 2 pyr[c] + h[c] -> alac[c] + co2[c]

iBtoh_2 23dhmb reductoisomerase alac[c] + nadph[c] + h[c] -> 23dhmb[c] + nadp[c]

iBtoh_3 23dhmb dehydratase 23dhmb[c] -> 3mob[c] + h2o[c]

iBtoh_4 3mob decarboxylase 3mob[c] + h[c] -> ibtal[c] + co2[c]

iBtoh_5 iBtoh dehydrogennase ibtal[c] + nadh[c] + h[c] -> ibtoh[c] + nad[c]

iBtoh_t iBtoh transport reaction ibtoh[c] + h[c] -> ibtoh[e] + h[e]

EX_ibtoh(e) iBtoh exchange reaction ibtoh[e] ->

反応を代謝モデルに追加 (8)

• 作成した代謝モデルを保存したい時

save

ファイル名

save :

データを保存する関数

ファイル名

:

保存するときのファイル名

save

ファイル名 変数名

save :

データを保存する関数

ファイル名

:

保存するときのファイル名 変数名

:

指定した変数のみを保存

66

反応を代謝モデルに追加 (9)

• 結果の例： n-Butanol 生産に有効な 3 重破壊株の探索

# of

KO

生産速度

[mmol/gDW/h]

破壊反応

(1)

破壊反応

(2)

破壊反応

(3)

1 0.92 EX_etoh(e)/

ALCD2x/ETOHt2r

0.92 ACALD

2 (

他

ドキュメント内 PowerPoint プレゼンテーション (ページ 54-66)