nrf2 -/-

nrf2

0 ppm 3,000 ppm 6,000 ppm 0 ppm 3,000 ppm 6,000 ppm nrf2

nrf2

Body weight (g) % survival

Time (weeks)

Time (weeks)

(a)

(b) (c) (d)

(e)

Figure 3-5.

(a) Regenerative hepatocellular hyperplasia (RHH) in nrf2^-/- mice given piperonyl butoxide (PBO) at a concentration of 6,000 ppm.

Note the pedunculated shape and involvement of some nodules. (b), (c), (d), (e) Almost all of the nodules were composed of (b) basophilic, (c) eosinophilic, or (d) vacuolated hepatocytes, but the lobular architecture remained intact despite some central veins and portal triads being immature. (e) Nodules were accompanied by focal necrosis (arrow head). HE staining.

79

μm

(a) (b)

(c) (d)

80 Figure 3-6.

(a), (b) Hepatocellular adenomas from nrf2^-/- mice given piperonyl butoxide (PBO) at a concentration of 6,000 ppm. Note the growth of monoclonal atypical hepatocytes without intact central veins and portal triads. (c),(d) Hepatocellular carcinomas from nrf2^-/- mice given PBO at a concentration of 6,000 ppm inside (c) regenerative hepatocyte hyperplasia (RHH) and outside (d) RHH. HE staining.

0 ppm 3,000 ppm 6,000 ppm

HCA

HCC

Findings nrf2^+/+ nrf2^-/-

0 6 (21)

N=25 N=25 N=29

3 (12)

0.34±0.72 Incidence (%)

Multiplicity

(no. of tumors/mouse) Incidence (%)

Multiplicity

(no. of tumors/mouse)

In all area

In RHH

0.12±0.33 0

0 1 (4) 1 (3)

0.03±0.19 0.04±0.20

0

HCA

HCC

Incidence (%) Multiplicity

(no. of tumors/mouse with RHH)

Incidence (%) Multiplicity

(no. of tumors/mouse with RHH)

0 2 (14) 2 (11)

0.11±0.32 0.14±0.36

0

0 1 (7) 1 (6)

0.06±0.24 0.07±0.27

0

0 ppm 3,000 ppm 6,000 ppm

0 15 (50)

N=25 N=25 N=30

3 (12)

0.90±1.37 0.12±0.33

0

0 1 (4) 2 (7)

0.10±0.40 0.04±0.20

0

0 1 (7) 9 (41)

0.55±0.80 0.07±0.27

0

0 1 (7) 1 (5)

0.05±0.21 0.07±0.27

0

* **, #

#

* **

#

RHH, regenerative hepatocellular hyperplasia; HCA, hepatocellular adenoma; HCC, hepatocellular carcinoma. PBO, piperonyl butoxide.

a, no. of mice with tumors per no. of mice with RHH.

* p < 0.05 vs. the relevant control.

** p < 0.01 vs. the relevant control.

# p < 0.05 vs. nrf2^+/+.

2 (8) 14 (56) ** 18 (62) ** 11 (44) 14 (56) 22 (73) * No. of mice with RHH (%)

a

a

Table 3-3 Incidences of regenerative hepatocellular hyperplasias and hepatocellular tumors in nrf2^+/+ and nrf2^-/- mice given PBO.

81

82

3.4 考 察

PCP を 投 与 し た nrf2^-/-マ ウ ス で は 、胆 管 線 維 症 が 高 頻 度 に 認 め ら れ 、 特 に nrf2^-/-マ ウ ス に PCP を 600 ppm 投 与 し た 群 で は 、nrf2^+/+マ ウ ス の 同 濃 度 投 与 群 と 比 較 し て 、 有 意 に 高 い 頻 度 で 観 察 さ れ た 。 胆 管 線 維 症 は 肝 内 胆 管 の 障 害 に 続 い て 生 じ る と 考 え ら れ て い る[8、25]。PCP を 600 ppm、1,200 ppm で nrf2^-/-マ ウ ス に 短 期 投 与 し た 実 験 で は 、ALP が 高 値 を 示 す こ と が 報 告 さ れ て い る[112]。 こ の こ と か ら 、PCP に よ る 胆 管 障 害 の 発 生 に 酸 化 ス ト レ ス が 関 与 し て い る こ と が 考 え ら れ た 。 ま た 、 今 回 の 実 験 で は 、PCP を 投 与 さ れ た nrf2^-/-マ ウ ス に お い て 胆 管 が ん の 発 生 頻 度 が 有 意 に 上 昇 し た 。 胆 管 線 維 症 の 病 変 内 に 、 発 が ん の 原 因 と な る 遺 伝 子 変 異 は 未 だ 同 定 さ れ て い な い が[61]、 本 病 変 は 胆 管 が ん の 前 が ん 病 変 と 考 え ら れ て お り[63]、 本 研 究 に お い て も 胆 管 が ん は い ず れ も 胆 管 線 維 症 を 伴 っ て い た こ と 、本 研 究 の 第 2 章 の 結 果 か ら PCP は 標 的 臓 器 で あ る 肝 臓 に 対 し て 遺 伝 毒 性 を 示 さ な か っ た こ と か ら 、PCP に よ る 胆 管 線 維 症 か ら 胆 管 が ん へ の 進 展 に も 酸 化 ス ト レ ス が 関 与 し て い る こ と が 考 え ら れ た 。

今 回 、nrf2^-/-マ ウ ス の PCP1,200 ppm 投 与 群 に お い て 、 同 遺 伝 子 型 の 対 照 群 と 比 較 し て 肝 細 胞 腺 腫 が 有 意 に 高 い 頻 度 で 認 め ら れ た 。 し か し な が ら 、 同 濃 度 の PCP を 投 与 さ れ た nrf2^+/+マ ウ ス と の 間 に 、有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、 本 病 変 の 形 成 に お け る 酸 化 ス ト レ ス の 関 与 は 現 時 点 で 不 明 で あ る 。

PBO を 8 週 間 投 与 し た 実 験 で は 、8-OHdG レ ベ ル が nrf2^+/+マ ウ ス と

83

nrf2^-/-マ ウ ス の 6,000 ppm 投 与 群 で 上 昇 し 、さ ら に nrf2^-/-マ ウ ス の 3,000 ppm 投 与 群 に お い て も こ の 値 は 有 意 に 上 昇 し た こ と か ら 、PBO の 投 与 に よ り 生 じ る 酸 化 ス ト レ ス の 発 生 にNrf2が 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 し か し 、 血 清 生 化 学 検 査 の 結 果 、 肝 障 害 の パ ラ メ ー タ ー に nrf2 の 遺 伝 子 型 に よ る 違 い は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た 、PBO を 長 期 投 与 し た 実 験 で は 、 細 胞 傷 害 に 対 す る 変 化 と し て 生 じ る 再 生 性 肝 細 胞 過 形 成 [108]の 発 生 頻 度 に 、nrf2^+/+な ら び に nrf2^-/-マ ウ ス で 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ の こ と か ら 、PBO の 投 与 に よ り 生 じ る 肝 毒 性 の 発 現 に 、 酸 化 ス ト レ ス は 関 与 し な い と 考 え ら れ た 。 し か し な が ら 、nrf2^-/-マ ウ ス は 、 nrf2^{+/ +}マ ウ ス よ り も PBO の 腫 瘍 形 成 に お い て 高 い 感 受 性 を 示 し た 。特 に 、 再 生 性 肝 細 胞 過 形 成 内 に 肝 細 胞 腺 腫 が 生 じ た 個 体 の 発 生 頻 度 と 1 個 体 あ た り の 肝 細 胞 腺 腫 の 数 が 、nrf2^-/-マ ウ ス の PBO6, 000 ppm 投 与 群 で 、 nrf2^+/+マ ウ ス の 同 濃 度 投 与 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 か っ た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、PBO 投 与 に よ り 生 じ る 酸 化 ス ト レ ス は 、 発 が ん 過 程 の 初 期 段 階 で あ る 肝 障 害 の 発 生 に は 関 与 せ ず 、 後 期 の 肝 発 が ん へ の 進 展 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。

近 年 、が ん 遺 伝 子 が Nrf2 を 介 し た 経 路 を 活 性 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る が[14]、 腫 瘍 内 に お け る Nrf2 の 位 置 づ け や 役 割 は い ま だ 論 議 さ れ て い る の が 現 状 で あ る[6、57、84、99]。 今 回 の 実 験 に お い て 、 再 生 性 肝 細 胞 過 形 成 内 に お け る Nrf2 の 発 現 レ ベ ル は 不 明 で あ る が 、Nrf2 の 欠 損 マ ウ ス に お い て 再 生 性 肝 細 胞 過 形 成 内 の 肝 細 胞 腺 腫 の 形 成 が 増 強 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。

84

以 上 、nrf2 欠 損 マ ウ ス に 非 遺 伝 毒 性 発 が ん 物 質 で あ る PCP と PBO を 投 与 し 、 腫 瘍 形 成 過 程 に お け る 酸 化 ス ト レ ス の 作 用 点 に つ い て 検 証 し た 結 果 、 酸 化 ス ト レ ス は 肝 臓 の 腫 瘍 形 成 過 程 に 一 様 に 作 用 す る の で は な く 、 非 遺 伝 毒 性 発 が ん 物 質 の 種 類 に よ り 酸 化 ス ト レ ス の 作 用 点 が 異 な る こ と を 明 ら か に し た 。

ヒ ト で は Nrf2 に 遺 伝 子 多 型 が あ る こ と が 報 告 さ れ て お り[23、61]、 酸 化 ス ト レ ス に 対 す る 感 受 性 に 個 人 差 が あ る こ と が 考 え ら れ る 。 従 っ て 、本 研 究 結 果 は 様 々 な 化 学 物 質 に 暴 露 さ れ て い る 現 代 社 会 に お い て 、 特 に 非 遺 伝 毒 性 発 が ん 物 質 に よ る 発 が ん を 低 減 す る た め の 対 策 を 立 て 、 ま た 、 そ れ ら の リ ス ク 評 価 を 行 う 上 で 大 い に 貢 献 し う る も の と 考 え ら れ た 。

85

3.5 小 括

Nrf2 は 、酸 化 ス ト レ ス に よ り 活 性 化 さ れ る抗 酸 化 酵 素 群 の 転 写 因 子 で あ り 、生 体 内 で 生 じ る 酸 化 を 防 御 す る 重 要 な 因 子 と 考 え ら れ て い る 。 本 章 で は 、nrf2 欠 損 マ ウ ス に 、 肝 臓 の 8-OHdG レ ベ ル を 上 昇 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ た PCP お よ び PBO を 投 与 し 、腫 瘍 形 成 過 程 に お け る 酸 化 ス ト レ ス の 作 用 点 に つ い て 検 討 し た 。

PCP の 長 期 投 与 に よ り 胆 管 線 維 症 が nrf2^+/+マ ウ ス お よ び nrf2^-/-マ ウ ス に 高 頻 度 に 認 め ら れ 、600 ppm 投 与 群 の nrf2^-/-マ ウ ス に お い て nrf2^+/+

マ ウ ス の 同 濃 度 群 と 比 較 し て 有 意 な 頻 度 で 観 察 さ れ た 。 一 方 、 胆 管 が ん の 発 生 頻 度 は 、nrf2^-/-マ ウ ス の 1,200 ppm 投 与 群 で 同 遺 伝 子 型 マ ウ ス の 対 照 群 と 比 較 し て 有 意 に 高 か っ た 。

本 研 究 に お い て 、PCP の 短 期 投 与 で 8-OHdG レ ベ ル が 上 昇 す る こ と が 報 告 さ れ て い る こ と 、PCP の 低 濃 度 を 投 与 し た nrf2^-/-マ ウ ス で 胆 管 線 維 症 が 観 察 さ れ た こ と か ら 、PCP の 胆 管 障 害 の 発 生 機 序 に 酸 化 ス ト レ ス が 関 与 し て い る こ と が 考 え ら れ た 。 さ ら に 、PCP の 1,200 ppm 投 与 群 で 、 胆 管 が ん を 生 じ た 個 体 の 発 生 頻 度 は 、nrf2^-/-マ ウ ス で nrf2^+/+

マ ウ ス に 比 べ 有 意 に 高 か っ た こ と か ら 、 前 が ん 病 変 で あ る 胆 管 線 維 症 か ら 胆 管 が ん へ の 進 展 に も 酸 化 ス ト レ ス が 関 与 し て い る も の と 考 え ら れ た 。

PBO を 8 週 間 投 与 し た マ ウ ス で は 、nrf2^+/+マ ウ ス お よ び nrf2^-/-マ ウ ス の い ず れ に お い て も 血 清 中 の 肝 障 害 マ ー カ ー に 顕 著 な 変 化 は 認 め ら れ な か っ た 。8-OHdG レ ベ ル は 、nrf2^+/+マ ウ ス お よ び nrf2^-/-マ ウ ス の 6,000

86

ppm 群 で 有 意 に 増 加 し 、nrf2^-/-マ ウ ス で は 3,000 ppm の 投 与 で も 有 意 な 増 加 を 示 し た 。PBO の 52 週 間 投 与 後 の 肝 臓 に 、 慢 性 的 な 肝 障 害 に 続 い て 形 成 さ れ と い わ れ る 再 生 性 肝 細 胞 過 形 成 が nrf2^+/+マ ウ ス お よ び nrf2^-/-マ ウ ス に 認 め ら れ た が 、そ の 発 生 頻 度 に 差 は 見 ら れ な か っ た 。こ の こ と か ら 、PBO の 肝 障 害 に 至 る ま で の 初 期 過 程 に 酸 化 ス ト レ ス は 関 与 し て い な い と 考 え ら れ た 。一 方 、PBO の 長 期 投 与 で は 、PBO を 6,000 ppm で 投 与 し た nrf2^-/-マ ウ ス に お い て 肝 細 胞 腺 腫 が 高 頻 度 に 認 め ら れ 、 特 に 再 生 性 肝 細 胞 過 形 成 内 に 肝 細 胞 腺 腫 を 生 じ た 個 体 の 発 生 頻 度 な ら び に 1 個 体 あ た り の 肝 細 胞 腺 腫 の 数 は 、nrf2^+/+マ ウ ス の 同 濃 度 投 与 群 と 比 べ て 約 5 倍 と 高 く 、 統 計 学 的 に 有 意 な 変 化 で あ っ た 。 こ の こ と か ら 、PBO の 投 与 に よ り 発 生 す る 酸 化 ス ト レ ス は 、 前 が ん 病 変 か ら 腫 瘍 形 成 に 至 る 過 程 に 作 用 し て い る と 考 え ら れ た 。

以 上 、nrf2 が 欠 損 し た マ ウ ス に 非 遺 伝 毒 性 発 が ん 物 質 で あ る PCP と PBO を 投 与 し 、 腫 瘍 発 生 過 程 に お け る 酸 化 ス ト レ ス の 作 用 点 に つ い て 検 証 し た 結 果 、 酸 化 ス ト レ ス は 腫 瘍 形 成 過 程 に 一 様 に 作 用 す る の で は な く 、物 質 に よ り 酸 化 ス ト レ ス の 作 用 点 が 異 な る こ と を 明 ら か に し た 。

87 総括

現在、日本における死因の第 1位はがんで、我々の周囲に存在する膨大 な数の化学物質の約80%が発がんとの関連性が疑われている。従って、種々 の化学物質の発がんリスクを適切に評価し、管理することが、我々が健全 な生活を営む上で重要であるといえる。

現在、げっ歯類で発がん性が確認された化学物質のうち、遺伝毒性試験 で陰性を示した物質は、非遺伝毒性発がん物質に分類されている。非遺伝 毒性発がん物質は、解毒・代謝過程等で生じる酸化還元反応、活性酸素消 去系酵素の枯渇等により生体に酸化ストレスを発生させ、細胞に増殖刺激 を与えることが知られている。また、酸化ストレスは、DNA にも傷害を与 え、遺伝子突然変異を生じることから、非遺伝毒性発がん物質の酸化スト レスによる遺伝子傷害が、発がんに関与している可能性も示唆されている。

本研究では、非遺伝毒性発がん物質の生体に与える酸化ストレスが、発 がんを惹起するメカニズムを解明することを目的に、酸化ストレス発生系 が異なる3 種の非遺伝毒性発がん物質であるPBO、PhB、PCP を遺伝子改 変動物にそれぞれ投与し、標的臓器である肝臓における酸化的DNA損傷、

遺伝子変異（in vivo変異原性）の発生ならびに発がん過程における酸化ス トレスの作用点について解析した。

88

第1章 チトクロムP450誘導能を有する非遺伝毒性発がん物質のgpt delta ラットを用いた酸化的 DNA損傷ならびに in vivo 変異原性に関する検討

薬物代謝酵素であるチトクロムP450（CYP）のうち、CYP 1Aと2Bは、

薬物を代謝する過程で効率的に活性酸素を発生することから、これらの酵 素誘導能をもつ非遺伝毒性発がん物質は、酸化ストレスを発生させ、DNA に損傷を与えて発がんを誘発することが示唆されている。第 1章では、レ ポーター遺伝子を導入した gpt delta ラットを用い、CYP誘導能を有する PBO あるいはPhB が肝臓に酸化的 DNA損傷をもたらすか、また in vivo において変異原性を有するかについて検討した。

6週齢雄のF344系gpt deltaラット（1群5匹）に、発がん用量である20,000

ppmの PBOあるいは500 ppmのPhBをそれぞれ4週間ないし13週間混餌

投与した。投与期間終了後、ラットの肝臓中の、CYP 1A1、1A2、2B1の mRNA 発現レベルを RT-PCR法により測定するとともに、酸化的DNA損 傷マーカーである8-OHdG をHPLC-ECD法により測定した。また、点突然 変異を検出する gptならびに欠失変異を検出する red/gam 遺伝子の変異体 頻度、免疫染色により細胞増殖活性マーカーである PCNAの陽性肝細胞率 を、さらに肝前がん病変のマーカーであるGST-Pの陽性細胞巣の定量解析 を行った。

解析の結果、PBO 投与群でCYP 1A1、1A2、2B1 の、PhB 投与群でCYP 2B1 のmRNA発現レベルの上昇が確認された。一方、8-OHdGレベルの有意な 上昇は、PBO 投与群のみに認められた。PBO、PhB 投与群のいずれにおい

てもgptならびにred/gamの変異体頻度に有意な変化は認められなかった。