mM butylhydroperoxide 0.8 mM GSH，

0.4 mM 3‑0H'SA， (1 mg protein)，

0.4 mM 反応混液は、

すなわち、

100

倍スケールで反応を行なった。ション混液の

butylhydro‑

反応は buffer(pH 7.4)から構成された。

0.1 M Tris‑HCl および

0.4

mM HzOz

および

150 units horseradish peroxidase

0.8

mM GSH

，

3‑0H'SA，

AcOEt 4

m l

を加えて反応 20分間行なわれた。

3 7

⁰

C.

peroxide の添加で開始され、

HzOz

で全量300

ml

とした。反応、を

0.1

M

Tris‑HCl

buffer(pH

7.4) からな句、

を停止させ、 5分間振量抽出し未反応の3‑0H.SAを除去した。残存した水層をミリポアフィルターで議過し、議液の一定量(10jLl) を実験の部 (16)と同様の測定条件でHPLCを行なった。

( 1

8)

Phenacet in N‑水酸化活性の測定

インキュベーション混液は、肝臓、腎臓ミクロゾーム (6mg protein) ，0.1 M Na，K‑phosphate buffer(pH 7.4)， 6 jLmol NADPH， 300 jLmol KF， 9 jLmol KFを含み、全量3.0 m1から構成された。インキュベーションは、 37 ocで20分間好気的条件下で行ない、 AcOEt 5 m1によって停止させると同時に基質と生成物をAcOEt で抽出した。 AcOEt層は窒素気流下で濃縮し、残漬をMeOH100 jLlに溶かし、

HPLCに注入した。カラムは^J^I慎相ラジアルパックCNカラムで溶媒は1mM FeC13‑

1%酢酸‑ 20%ジメチルスルホキサイドを含むMeOHを用いた。流速は 1 ml/min で、検出は波長 546nmで行なった。 N‑hydroxyphenacetinの生成量は標準曲線から、ピークの高さを測定することによって計算した。

( 1

9)

Phenacetin の代謝活性

a) Phenacetin脱エチル化活性 ‑ インキュベーション混液は肝あるいは腎ミクロゾーム (6mg protein)、0.1 M Na，K‑phosphate buffer(pH7.4) ， 6 jLmol NADPH， 3 jLmo1 ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA)， 30 jLmol MgC12， 6 jLm01 phenacetinを含む全量 3.0 m1から構成された。インキュベーションは 3rc， 20分間好気的条件下で行ない、 AcOEt 5 mlで反応停止と同時に抽出を行なった。 AcOEt層は窒素気流下で濃縮し、残溢をMeOH0.1 mlに溶かし、その10

jLlを HPLC分析に用いた。カラムは Radial Pak C1 8 を用い、溶媒は 0.1 M Na，K‑phosphate buffer(pH 7.4) ‑MeOH (6:4， v/v) を流速 1ml/minで溶出した。

b) Phenacetin脱アセチル化活性一インキュベーション混液は、肝あるいは腎ミクロゾーム (6mg protein)， 0.1 M Na，K‑phosphate buffer(pH7.4) ， 6 jLmo1 NADPH， 3川01印TA，30川 01MgC1₂， 6 jLm01 phenacetinを含む全量3.0 mlから構成された。インキュベーションは、 3rc，20分間好気的条件下で行ない、

1.0 N NaOH 0.1 m1 と AcOEt5.0 mlの添加で反応を停止させた。 HPLC分析は phenacetin脱エチル化活性の測定に用いた場合と同じ溶媒で、ただし流速 2.0 m1/minで検出器の感度は 0.005で行なった。

c)

p‑Phenetidine脱エチル化活性一インキュベーション混液は、肝あるいは

腎ミクロゾーム (3mg protein)， 0.1 M Na，K‑phosphate buffer(pH7.4) ， 3 jLmol NADPH， 3 jLmol EDTA， 3 jLmol p‑phenetidine‑HC1塩を含む全量3.0mlから構成された。インキュベーションは、 37⁰C 20分間好気的条件下で行ない、 20克tri‑ chloroacetic acidの1mlの添加で反応を停止させ、除タンパクを行なった。

HPLCの分析のため、 Carpenterらの方法8 3によって p‑aminophen01を p‑

hydroxylbutyranilideに転換した。すなわち、上清 1 m1 と2 mlの 0.1 M Na，K‑

phosphate buffer(pH7.4) の溶液に50jLlの n‑butyric anhydrideを加えた。

その溶液を直ちに撹梓し、室温で 1時開放置した。反応液を前もって活性化し、

洗浄した C1 8 Sep Pak (Waters Associates Inc.) を通過させ、スピッツを 3‑ 4 mlの水で 2回ゆすぎ、その水はSep Pakを通過させた。 p‑hydroxybutyr‑ anilideを 4 m1の MeOHで溶出させ、溶媒を蒸発乾固後、残漬を 0.1 N NaOH

と 0.1 mlの 1 M 酢酸に溶解した。 HPLCは MeOH‑H20(1:1， v/v)を 1ml/min の流速でRadia1 Pak C1 8カラムを用いて行なった。

d)

Acetaminophen脱アセチル化活性ーインキュベーション混液は、肝あるいは腎 9000 xg上清の1ml、0.1 M Na，K‑ phosphate buffer(pH7.4) ， 30 jLm01 MgC12， 9 jLmol acetaminophenを含む全量3.0mlから構成された。

インキュベーションは37 oC， 60分間好気的条件下で行ない、 20克 trichloro‑ acetic acid 1 mlを加えて反応を停止させた。 acetaminophenから生成した p‑aminophenolを測定するために、 butyryl化とHPLC分析は p‑phenetidineから p‑aminophenolへの脱アセチル化反応で用いられた方法と同じ方法で行なった。

( 2 0

) 腎毒性指標の検討

腎障害惹起の有無を調べるために、 Wistar系雄性ラット ( 体重 150‑200 g) に薬物を 1‑3 mmo1/kg、腹腔内あるいは経口投与後、代謝ケージに入れ、 24時間尿を集めた。尿中タンパク量は一部 Folin‑Lowry法4 6で、一部燐タングステン酸で沈殿させた後、その沈殿物をアルカリで溶解しビューレット法8 4で測定した。

尿中 creatinineはJaffe反応、8 5で、尿中酵素である N‑acety1g1ucosaminidase (NAG) は蛍光法8 6で、 alkaline phosphatase活性はKind‑King

i

去8 7で測定した。

一方、別にラットをエーテル麻酔下限穿刺法により採血し、血清尿素窒素 (BUN) をurease‑indophenol

i

去8 8で測定した。さらに、腎障害の有無を光学顕微鏡を用いた組織学的方法とNAG活性による酵素化学的方法は常法8 9，9 0 に従って検討した。

( 2

1) Horseradish peroxidase/H202による p‑aminophenolとGSHとの結合反応

標準のインキュベーション混液は、全量 3ml中に 0.4 mM p‑aminophenol， 0.8 mM GSH. 0.4 mM H202. 0.3 units horseradish peroxidaseおよび 0.1 M Tris‑HC1 buffer(pH 7.4) から構成された。反応は 25

o c

、1分間でH202の添加

によって開始し、 ‑50⁰Cで急速に冷却して停止させた。以下、抽出操作および HPLCの測定条件は実験の部 (16) と同様の方法で行なった。結合体の生成量は別個に求めた標準曲線より算出した。

( 2 2) Microsomes/cumenehydroperoxide， butylhydroperoxideによる p‑aminophenolとGSHおよびCYSと結合反応

原準のインキュベーション混液は、全量 1ml中に 1mgラット肝および腎ミクロゾーム (1mg protein)， 0.4 mM p‑aminophenol， 0.8 mM GSH， 0.1 mM cumenehydroperoxideおよび 0.1M Tris‑HCl buffer(pH 7.4)から構成された。

反応はcumenehydroperoxideの添加で開始され、 37⁰

C

，20分間行なわれた。

AcOEt 4 mlを加えて反応を停止させ、 5分間振渥抽出し未反応の p‑aminopheno1 を除去した。残存した水層をミリポアフィルターで漉過し、漉液の一定量 ( 10 1L1)をHPLCで分析した。なおp‑aminophenolとCYSとの結合体生成反応の場合、

cumenehydroperxideの代りにbutylhydroperoxideを用いた以外は、 GSHと同様に行なった。

( 2 3)

p‑AminophenolとGSHおよび CYSとの結合体の酵素合成、精製および同定

p‑aminopheno1‑GSHおよびp‑aminoheno1‑CYS結合体を単離するために実験の部 ( 21 ) に記載したインキュベーション混液の 100倍スケールで反応を行なった。すなわち、反応混液は0.4mM PAP， 0.8 mM GSH(あるいは0.8 mM CYS ，) 0.4 mM H202および 300units horseradish peroxidaseからなり、 O.lMTris‑HCl buffer(pH 7.4)で全量300mlとし、反応をH202の添加で開始し、 30^oC，10分間行なった。以下、抽出操作およびHPLCによる測定は実験の部 (15)と同様の方法で行なった。反応をAcOEt 300 m1の添加で停止し、水層は分離後、 ‑50oCで凍結乾燥した。姥湾を少量の水に溶かし、分取用カラム ILBondasphere C1 8 (5 L1‑100 A，

19 X 350 mm Waters)でp‑aminophenol‑GSHおよびp‑aminohenol‑CYS結合体を分取

し、精製を行なった。構造解析は実験の部 (15)と同様 TLC.UV， FAB‑massスペクトルおよび lH‑NMRスペクトルによって行なった。

(機器)

酵素標品の調製はトミー冷却遠心機 model PB‑18 IIおよびベックマン L8M 分離用超遠心機を使用した。またHPLCはWaters液体クロマトグラフ (6000A型ポンプ， 440型検出器， U6K 注入器 ) および島津 SPD‑6AVを使用した。アミノ酸分析はオルトフタルアルデヒド法に目立655型 ( 蛍光モニター付 ) 液体クロマトグラフを、ニンヒドリン法にJEOL TLC 200Aアミノ酸分析計を使用した。酵素タンパク量，尿中タンパク量，クレアチニン量， BUN量，アルカリフォスファターゼ活性，スルフォトランスフエラーゼ活性などは目立 228分光光度計で測定した。分光蛍光光度計は目立 MPF‑3型を使用した。組織学的検討は Nikon光学顕微鏡およびヤマトミクロトームを用いた。

( 7ド一方、4一HABSA‑アセチル化活性の測定の場合、インキュベーション混液は、肝あるいは腎 105.000Xg上清(4 mg protein). O. 5 mM acetyl CoA， 0.4 mM 4‑HABSA， 0.1 M Na， K‑phosphate buffer (pH 6.8)を含む全電1.0 m1から構成された。 37⁰

C

，20分間反応後 AcOEt5 mlで反応を停止させた。以下の操作は

( 7)

に記載したN⁴‑Acetylsulfanilamide N ‑ノ

k

酸化活性の測定と同一条件で4‑AHABSA の定量を行なった。

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ドキュメント内繪柳, 玲子 (ページ 37-43)