DFAT L-DFAT DFAT L-DFAT DFAT L-DFAT

1 6.84 6.42 7.45 7.21 79.7 79.3

2 3.53 3.05 13.2 12.6 79.4 79.3

3 1.06 1.02 4.32 4.41 91.2 92.5

4 1.16 1.35 3.52 5.25 91.4 89.1

38 第 1図 天井培養

頬脂肪体を細切後，0.1%のコラゲナーゼ溶液で酵素処理を行い，遠心分離後に 遠沈管上部に成熟脂肪細胞が浮遊した。成熟脂肪細胞分画を 20%FBS 添加の DMEM培地中に播種し，37˚C および5% CO2存在下で7日間天井培養を行った。

7 日後にフラスコを反転し，通法通り細胞培養を行った。

39 第 2図 脂肪細胞の直径サイズの分布

コールターカウンターを用いて 1.0 mlの細胞懸濁液中の浮遊細胞の直径

（20-130 μm）を測定した。40 μm未満（S-adipocytes）の細胞数が他の大きさに

比較して有意に多かった（n = 3）。*p < 0.05

40 第 3図 Nile Red 蛍光染色

A，B：Nile Red および Hoechst33342（blue）を用いて S-adipocytes (A)および

L-adipocytes（B）の免疫蛍光染色を行った結果，両細胞分画共に Nile Red 陽性

を示す単房性の脂肪細胞であることが示された。スケールバー：40 μm

C：フローサイトメーター解析により，S-adipocytes は 100%の細胞が Nile Red

陽性を示す脂肪細胞であった。

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第 4図 成熟脂肪細胞から DFAT 細胞への脱分化過程における細胞形態の変化

A：天井培養 3 日目，フラスコ天井面に接着した単胞性の脂肪細胞から細胞突

起（黒矢印）が出現しているのが確認された。スケールバー：100 μm

B：天井培養 5 日目，線維芽細胞様の形態をした DFAT 細胞（白矢印）が出現

したが，単胞性の脂肪細胞（白矢頭）も観察された。スケールバー：100 μm

C：天井培養 7 日目，DFAT細胞がコロニーを形成しているのが確認された。ス

ケールバー：500 μm

D：脱分化過程における脂肪細胞の形態変化を模式図に示す。

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第 5図 成熟脂肪細胞から出現した DFAT 細胞数の比較

S-およびL-adipocytesをそれぞれ1.0×10⁴個ずつフラスコに播種し，培養開始6，

10，14 および21 日目の DFAT細胞数を測定し比較した。

培養 6，10，14日目において S-DFAT 細胞が L-DFAT細胞に比較して有意に多

かった（n = 4）。*p < 0.05

43 第 6図 RT-PCR解析

S-およびL-DFAT細胞共に幹細胞のマーカーであるc-MYC，KLF4およびOCT3/4

の遺伝子発現，また，脂肪細胞，骨芽細胞，軟骨細胞の転写因子である PPARγ2，

RUNX2，SOX9 の遺伝子発現を認めたが，SOX2 の遺伝子発現は認めなかった

（n = 4)。

代表例 1 例を示す。

44 第 7図 コロニー形成能および細胞増殖能

A：細胞播種 10日後，10%中性緩衝ホルマリン溶液にて固定し，トルイジン青

染色によりコロニー染色を行った（n = 4）。代表例 1 例を示す。

B：コロニー数を位相差顕微鏡下にて計測し，50 細胞以上の細胞凝集を 1 コロ

ニーとした（n = 4）。

C：細胞播種後の 3，5，7，10 および 14日目における細胞数を WST-8 kit を用

いて測定し，比較検討した（n = 4）。

両細胞群のコロニー形成能，細胞増殖能に有意な差は認めなかった。

45 第 8図 骨芽細胞分化能

A： ALP 活性

骨芽細胞誘導開始 3 日目から S-DFAT 細胞は L-DFAT 細胞に比較して有意に高 い活性を示した（n = 5）。*p < 0.05

B：アリザリン赤染色

骨芽細胞誘導開始 7 日目に S-DFAT 細胞は L-DFAT 細胞に比較して顕著な石灰

化 noduleが認められた（n = 5）。代表例 1例を示す。

C：カルシウム定量試験

骨 芽 細 胞 誘 導 開 始 7 お よ び 21 日 目 の カ ル シ ウ ム 沈 着 量 は S-DFAT 細 胞 が L-DFAT 細胞に比較して有意に高値を示した（n = 5）。*p < 0.05

46 第 9図 脂肪細胞分化能

A：オイルレッド O 染色

S-DFAT細胞およびL-DFAT細胞は共に脂肪誘導開始7日目からオイルレッドO

染色に陽性を示す細胞を認め，14 日目および 21 日目と染色程度は同等であっ た。

B：脂肪滴を有する細胞数の比較

オイルレッド O 染色陽性細胞の割合は，S-DFAT 細胞では脂肪細胞誘導開始 7

日目に 5.3%，21 日目には 65.0%であり，L-DFAT 細胞では脂肪細胞誘導開始 7

日目に 5.5%，21 日目には 63.0%と両細胞群間に有意な差は認めなかった。

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第 10図 酵素処理濃度と脂肪細胞の大きさおよび細胞数の分布

5 種類の酵素処理濃度（0.01%，0.02%，0.05%，0.1%，0.5%）により酵素処理 後，得られた成熟脂肪細胞数および細胞の直径をコールターカウンターにて測

定した。0.02%では他の濃度に比較して 60 μm未満の細胞数が有意に多かった。

特に，40 μm未満の細胞数は，他の濃度に比較して約 5 倍以上の細胞数を獲得

した。*p < 0.05（0.02% vs 0.1%）