COO - -COOH
CH 3 CN/20 mM リン酸 +5 mM トリエチルアミン (30/70)
L- column2 ODS
残存シラノールのほとんどないODSでは、
中性緩衝液でも良いピーク形状が得られる
Tf=1.161
Tf=1.489
解離性化合物
分離の改善
N を高くする
・カラムを長くする、粒子径を小さくする
・注入溶媒として貧溶媒を使用する
・温度を高くする
分析条件の変更
・pH、温度、有機溶媒の種類 αの増大
・移動相の組成を変える k の増大
カラム種類の変更
・高度にエンドキャッピングしたカラム N の増大
・充填剤修飾基 αの増大 k
k R
sN
× +
× −
= 1
1
4
α α
Rs
：分離度，N
：理論段数α：分離係数，
k
：保持係数分離の改善
粒子径を小さくする
5 μm 4.6×150 mm N7=11781
Rs(8,9) ＝0.881
3 μm 4.6×150 mm N7=20230
Rs(8,9)＝1.409
0 5 10 15
1
2 3 6
8 9 7
0 5 10 15
1
2 3 4 5 6
8 9 7
1)サルファジアジン 2）サルフィソミジン 3）サルファチアゾール 4）サルファメトキサゾール 5）サルファメラジン
6）サルファモノメトキシン 7）サルファドキシン
8）サルファメトキシピリダジン 9）サルファジミジン
粒子径を小さくすることで分離がよくなる
分離の改善
4 5
有機溶媒の種類の変更
（a）メタノール/
10mM 酢酸アンモニウム (15/85) RS（1,2）=6.576 α（1,2）=1.80
（b）アセトニトリル/
10mM 酢酸アンモニウム (10/90) RS（1,2）=1.898 α（1,2）=1.21 カラム：
L-column ODS
5μm，4.6×150 mm； 試料：サルファ剤1 2
1 2
0 5 10
（a）
（b）
移動相の溶媒を変えることで分離が改善される場合がある
分離の改善
移動相の組成を変えて溶出を遅くする
25％
20％
15％
10％
2＋3
23
23
2 3
0 10 20
RS（2,3）=0.898 k（3）=0.885 RS（2,3）=1.064 k（3）=1.473
RS（2,3）=1.468 k（3）=1.606 RS（2,3）=1.463 k（3）=5.104 カラム：
L-column ODS
5μm, 4.6×150 mm移動相：メタノール/10 mM 酢酸アンモニウム メタノール比率
保持係数が2.5 （150 mmのカラムで約5分）以 下のときは遅く溶出して分離させる
分離の改善
0 10 20 60℃
50
℃40
℃30
℃20
℃1 2 3
2 1 3
温度を高くする
F NH
O
O O
カラム：
L-column2 ODS
3μm，4.6×150 mm 移動相：CH3CN/25 mM リン酸緩衝液 pH7（35/65）流量：1 mL/min
試料：1.パロキセチン 2.シタロプラム 3.フルオキセチン 各2μL
物質によって保持の温度依存性が異なる
（一般的には、温度が高くなると保持は早くなる）
分離の改善
N O F
N
2. シタロプラム 1. パロキセチン
0 5 10 15
カラム： A: 他社カラム 5μm, 4.6×150 mm
B:
L-column2 ODS
5μm, 4.6×150 mm移動相：CH3CN/25 mM リン酸緩衝液 pH7.0 （33/67）
高度にエンドキャッピングしたカラムの使用
F NH
O
O O
エンドキャッピングが十分なカラムへ 変更することで分離が改善される
1. パロキセチン
2. シタロプラム
A
B
N O F
N
分離の改善
1 2
試料溶媒のメタノールの割合を変化
有機溶媒比率が高いとピーク形状が悪くなる
5 10 15
サンプル溶媒組成に対するクロマトグラムの変化
90%
80%
70%
60%
50%
0
メタノール比率
20
カラム：
L-column ODS
5μm, 2.1x150 mm 試料 ：17b-エストラジオール
(濃度: 1 μg/mL) 移動相 ：メタノール/水（55/45）
流量 ：0.2 mL/min 注入量 ：100 μL
試料溶液の溶媒比率とピーク形状の関係
試料の注入テクニック
100％アセトニトリル
80％アセトニトリル 40％アセトニトリル
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
110%
0 10 20 30 40 50
注入量(μL)
理論段数の変動率
試料溶媒の組成と注入量 による理論段数の変化
移動相と同じ組成だと理論段数が変化しない
分析条件
カラム：
L-column ODS
5μm, 4.6×150 mm
移動相：アセトニトリル/水 (60/40) 試料：1 mg/mL ナフタレン
60％アセトニトリル
100％アセトニトリル
80％アセトニトリル
試料の注入テクニック
試料溶液中の有機溶媒が多い場合 ピーク形状が悪くなる理由
有機溶媒100%試料溶媒 水の比率の多い試料溶媒
バンド幅が最初から広い
!
カラム入口部で一旦濃縮される・試料溶媒の基本は移動相と同じ組成
・注入量は、精度や感度に問題の無い範囲で 少なく設定する
試料の注入テクニック
カラム内径と注入量
50％
90％
100％
0 2 4 6 8 10
注入量(μL)
理論段数の変動率
内径4.6 mm
カラム：
L-column ODS
5μm, 150 mmL.移動相：アセトニトリル/水 (60/40）
試料：ナフタレン（1 mg/mL, アセトニトリル溶液）
内径3.0 mm
内径2.1 mm 内径1.5 mm
内径が小さいほど注入量によって理論段数へ影響
試料の注入テクニック
11467 （96 %） 11680 （91 %）
セミミクロ用セルに変更
11266 （94 %） 9981 （78 %）
配管を0.13 mmへ変更
10690 （89 %） 9848 （77 %）
カラムを3.0×150 mmへ変更
11888（100 %） 12733（100 %）
4.6×150 mm
新型式HPLC 旧型式HPLC
変更項目 理論段数