VGLUT1v のグルタミン酸輸送活性

  Sf9細胞に発現させ、精製したVGLUT1vタンパク質が果たして機能を保持し ているかどうかを検証するため、F-ATPase を組み込んだ再構成リポソームを用

いてVGLUT1vによるグルタミン酸輸送活性測定を行なった。

  ATPの添加により、再構成リポソームはグルタミン酸を取り込んだ（図6）。

一方で、ATPを添加しない場合はこの輸送は大きく減じた。さらに、VGLUT1v が存在しないリポソームにATPを添加しても、グルタミン酸の取り込みは観察 されなかった。従って、VGLUT1vタンパク質と F-ATPase を共に再構成したリ ポソームは、ATP依存的にグルタミン酸輸送を行うと結論した。

  次に、グルタミン酸輸送に対するグルタミン酸濃度依存性を検証した（図7）。

VGLUT1vによるグルタミン酸取り込み活性は、ミカエリス・メンテン型を示し、

グルタミン酸濃度に依存して増大した。Lineweaver-Burk プロットすると、グル タミン酸に対するKmは1.4 mM、Vmaxは83 nmol/min/mg proteinであった（表2）。

ATP を添加しない場合においても、グルタミン酸取り込み活性はグルタミン酸 濃度に従ってミカエリス・メンテン型で増大していた。この結果は、F-ATPaseの 能動輸送による駆動力の供給がない状態でも、グルタミン酸の取り込み活性が あることを示しており、VGLUT1vの促進拡散（輸送体を介し、極性分子の輸送 を促進する）による活性が反映されたものであると考えられる。なお、同様の活 性は解析が進んでいるVGLUT2においても観察されている（Juge et al., 2006）。

  さらに図 8 において、VGLUT1v によるグルタミン酸取り込み活性に対する Evans blueの効果を示した。Evans blueはVGLUTsの強力な阻害剤として知られ ている（Thompson et al., 2005）。低濃度（1 µM）の添加でVGLUT1vによるグル タミン酸輸送をほぼ完全に抑制した。

  以上の結果から、VGLUT1v には他の VGLUTs と同様のグルタミン酸取り込 み活性があると結論した。

図 6  VGLUT1v によるグルタミン酸輸送のタイムコース 

左図: F-ATPase 及び VGLUT1v を組み込んだ再構成リポソームにおけるグルタミン酸輸送 を模式的に示した。右図: VGLUT1v と F-ATPase を含む再構成リポソームのグルタミン酸 輸送のタイムコース。ATP  （2 mM）存在下（●）、あるいは非存在下（○）におけるグ ルタミン酸取り込み活性を測定した（1 分、5 分、10 分）。VGLUT1v をリポソームに再 構成していないサンプルを用いて同様に輸送活性を行なった（▲）。値は平均値 標準誤 差。n=3。 

図 7  VGLUT1v によるグルタミン酸輸送の濃度依存性 

ATP の添加（●; +ATP）、不添加（○; -ATP）時のグルタミン酸輸送活性を測定した 

（1 分）。それぞれ 0.1、0.2、0.5、1、2、5 mM のグルタミン酸濃度で測定した。

Lineweaver-Burk プロットを図内に示した。 

表 2    VGLUT１v の速度論的解析 

図 8  Evans blue によるグルタミン酸輸送の阻害効果 

VGLUTs の阻害剤である Evans blue（1 µM）を反応液に添加し、1 分インキュベートし た後グルタミン酸輸送活性を測定した（5 分）。n=3。値は平均値 標準誤差。Studentʼs t  test により有意差を検定した。**P < 0.01。 

図７から得られた VGLUT1v の速度論的パラメーター（K_m、V_max）を示した。VGLUT1、

VGLUT2、VGLUT3 に対するパラメーターについても記載した（Juge et al., 2006; 

2010）。