Ratio of cell body/Axon
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Ratio of cell body/Axon
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control miR-Tbce1
Ratio of Cell body/Axon
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NS
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control miR-Tbce
*
control miR-Tbce1 Acetylated!-tubulin
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Ratio in Cell body
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
control miR-Tbce1 Acetylated !-tubulin
(Cell body)
0 5 10 15 20
control miR-Tbce1 Acetylated !-tubulin
(Axon)
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Ratio in Cell body
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Ratio in Axon0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
7 DIV 14 DIV
!-tubulin (Cell body)
control miR-Tbce1
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Ratio in Cell body
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NS
NS
Ratio in Axon
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control miR-Tbce1
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Ratio
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free tubulin fraction microtubule fraction free tubulin fraction microtubule fraction
7 DIV 14 DIV
Acetylated !-tubulin
/0 /0
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free tubulins MTs free tubulins MTs free tubulins MTs free tubulins MTs
0/123 45/123 0/123 45/123
Ratio
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ī26 Control2miR-Tbce1ɐȼɨʎʋʪ5J#m7ƚȷ˔ǧċ;k{]˰ɐȼ̡Ŕ̡
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#0free tubulin2microtubule fractionNĨč#(KHNɁ0Western blottingNˆ4-*Ĕ Ʌé5ęAKJ#mċ;Qhmü#m8DM1A26-11B1ƭ¾5GI(K)K ǰè#*(B)(A)7qkNɁ 714 DIV50Ĕfraction5ęAKJ#mċ;Qhm
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m !-actin8DM1A6-11B1Anti-!-Actin antibody (AC-15)7ƭ¾NɁ0(K)Kǰ è#* (D)(C)7qkNɁ 714 DIV50Ĕʋʪâ1ɐȼ#0J"mQhm
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± SEM, n=8͘ǛƠŰǰŔ8paired t-testNɁ0ˆ4-*͗p* > 0.05, vs control͘
第4章 チューブリンの恒常性破綻とタウの異常性の関連性についての検討
4-1概要：
前章で、miR-Tbce1 の発現により、海馬初代培養神経細胞内において継続的な Mouse TBCE の ノックダウンおよびaチューブリンの異常蓄積が確認された。仮説に従えば、チューブリンの恒常性 破綻により、内在性タウのリン酸化、微小管からの遊離、細胞体への異常局在といった異常性が獲 得される可能性がある。本研究では、miR-Tbce1の発現に伴うタウの異常性について検討した。
4-2実験方法：
・使用試薬
蛍光免疫染色法によるタウの局在解析 Paraformaldehyde（ナカライ）
Glutaraldehyde（ナカライ）
Skim Milk（ナカライ）
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate（ナカライ）
Bovine serum albumin (BSA) （ナカライ）
一次抗体（表3に示す）
Goat Anti-Chicken IgY H&L (Alexa Fluor○R 488)（Abcam）
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Flour 514（Life technologies）
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Flour 568（Life technologies）
Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Flour 647（Life technologies）
Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether（ナカライ）
cOmpleteTM, EDTA-free Protease inhibitor Cocktail（Roche）
Taxol（LC laboratories）
GTP（ナカライ）
Na3VO4（FUJIFILM和光純薬）
NaF（Sigma-Aldrich）
Okadaic acid（LC laboratories）
b-Glycelophosphate（Merck）
Phenylmethylsulfonyl fluoride（ナカライ）
Diisopropyl fluorophosphate（Sigma-Aldrich）
Pepstatin（PEPTIDE）
Antipain（PEPTIDE）
Aprotinin（ナカライ）
Leupeptin（PEPTIDE）
Tosyl lysine chloromethyl ketone（ナカライ）
Acrylamide（ナカライ）
Glycerol（ナカライ）
2-Mercaptoethanol（ナカライ）
N,N'-Methylenebisacrylamide（ナカライ）
Tris(hydroxymethyl)aminomethane（ナカライ）
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Hydrochloride（ナカライ）
Sodium Lauryl Sulfate（ナカライ）
Ammonium Peroxodisulfate（ナカライ）
N,N,N',N'-Tetramethyl ethylenediamine（ナカライ）
Fluoro Trans PVDF Transfer Membrane（PALL Lifescience）
Skim Milk（ナカライ）
一次抗体（表3に示す）
Peroxidase-conjugated AffinPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)（Jackson Immunoresearch Laboratory）
Peroxidase-conjugated AffinPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) （Jackson Immunoresearch
Laboratory）
Chemi-lumi One L（ナカライ）
qRT-PCR法によるaチューブリンおよびタウの遺伝子発現量の定量
ISOGEN-LS（日本ジーン）
クロロホルム（ナカライ）
メタノール（ナカライ）
After Tri-Reagent RNA Clean-up kit（Favorgen）
DNaseⅠ（Sigma-Aldrich）
One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR kit（Takara）
蛍光免疫染色法によるタウの局在解析、Western blotting によるタウの性状解析及びタンパク質発 現量の定量
第3章に示した手順で行なった。また、使用した抗体については表4に示した。
qRT-PCR法によるチューブリンおよびタウの遺伝子発現量の定量
第2 章に示した手順で、controlおよび miR-Tbce1 発現細胞から total RNA を抽出した。Total RNAは、30 µlのRNase-free waterで溶解した。得られたtotal RNAからAfter Tri-Reagent RNA Clean-up kitを用いて精製RNAを回収した。Total RNAサンプルのvolumeをRNase-free water により100 µlとした後、350 µlのFRAP bufferを加え激しく混和した。そこに250 µlの100% エ タノールを加え混和した後、付属のカラムに全量移し14,000 rpm、4℃の条件で1分間遠心した。
カラムに250 µlのWash buffer 1を加え、再度14,000 rpm、4℃の条件で1分間遠心した。100 µl のDNaseⅠ（0.5 U/µl）をカラム内に加え、室温で1時間静置した。DNase反応終了後、カラムに
ng/µl 精製 RNA, 1x One Step TB Green RT-PCR Buffer4, 0.1 U/µl Takara Ex Taq HS Mix, Primescript PLUS RTase Mix, 0.4 µM forward / reverse primer）を調製した後、42℃で5分間、
95℃で10秒反応を1サイクル、95℃で5秒、60℃で34秒反応を40サイクル行い、各種タンパク 質の遺伝子発現量を定量した。使用したプライマーの配列は、表5に示した。
4-3実験結果及び考察：
チューブリンの恒常性破綻によるタウの局在への影響の検討
まずaチューブリンの異常が内在性タウの局在に与える影響について検討した。内在性タウの局在 については、リン酸化状態に関係なくタウの検出が可能なRTM38抗体（所属研究室にて作製した）
を用いて行った。その結果、14 DIVのMouse Tbceノックダウン細胞では、不活性型のaチューブ リンと同様にトータルタウが細胞体に異常局在している（1.4 ± 0.16倍, p = 0.015）⼀⽅で、軸索で 変化は⾒られなかった（図27, 29A）。これらの結果をもとにトータルタウの細胞体/軸索⽐を算出し た結果、それはcontrol細胞よりも増加していた（3.34 ± 0.81倍, p = 0.0078）（図27, 29C）。さら にリン酸化タウの解析で広く使用されている抗体であるAT8 を用いて同様の解析を行なった。その 結果、トータルタウと同様にSer202/Thr205リン酸化タウにおいても細胞体での蓄積が確認された
（1.63 ± 0.18倍, p = 0.0025）（図28, 29B）。また、Ser202/Thr205リン酸化タウの細胞体/軸索比 も、control細胞よりも増加することが確認された（3.28 ± 0.84倍, p = 0.0098）（図28, 29D）。
チューブリンの恒常性破綻によるタウのタンパク質発現量および遺伝子発現量への影響の検討 局在解析で認められたトータルタウ及びリン酸化タウの局所的な増加について、さらに生化学的 解析により検討した。その結果、14 DIVのMouse Tbceノックダウン細胞において、free tubulin fractionおよびMicrotubule fractionに含まれるトータルタウ量がcontrol細胞と比較して1.5倍か ら1.6倍程度増加することが確認された（1.55 ± 0.06倍 及び1.66 ± 0.1倍, p = 0.0054 及びp = 0.011）（図30A, B）。また、Ser202/Thr205 リン酸化タウにおいても、両fractionで1.8倍程度の 増加傾向及び2倍程度の増加が確認された（1.83 ± 0.31倍及び1.97 ± 0.13倍, p = 0.057 及びp = 0.009）（図30A, B）。一方、14 DIVでのMouse Tbceノックダウン細胞でのトータルタウの発現量 においては、control細胞と比較して140%程度まで増加することが確認された（42.2 ± 17.7%, p = 0.017）（図 30C, D）。また、各種リン酸化タウについても検討した結果、Ser202/Thr205 および Ser396/404リン酸化タウについてはそれぞれ120%または140%程度の増加が認められた（126.3 ± 12.3%, 141.4 ± 7.8%, いずれもp = 0.028）（図30C, D）。Thr181リン酸化タウ量については、control
細胞とMouse Tbceノックダウン細胞間で有意な差はみられなかった（図30C, D）。一方、7 DIVで
は Mouse Tbce ノックダウン細胞でトータルタウ及び各種リン酸化タウの発現量の変化は認められ
なかった（図30C, D）。
今回得られた結果から、トータルタウ及びpSer202/Thr205タウの異常局在が認められた14 DIV で、タウのタンパク質量及び可溶性タウの増大が確認された。当研究室ではこれまでに①タウの細 胞体での異常局在はタウの異所的な発現に起因すること、②細胞体に異常局在しているタウは微小 管に結合していない可溶性のタウであることなどを明らかにしている 43)。これらの結果をふまえる と、本研究で見られた 14 DIV でのタウの細胞体での異常局在は、①タウの異所的な発現により可 溶性のタウの増加したことで起きた事象であること、②細胞体に異常局在したタウは当研究室です でに報告した結果と同様に可溶性のタウの可能性があることなどが考えられた。また、このタウの タンパク質量増大の要因は、遺伝子発現量の増大である可能性があった。そのため、qRT-PCR法を
用いて Mouse Tbce ノックダウン条件下でのaチューブリンおよびタウの遺伝子発現量の影響につ
いても検討した。その結果、7、14 DIVのMouse Tbceノックダウン細胞でのaチューブリン・タウ の遺伝子発現量は、control細胞と比較しても特に変動が見られなかった。このことから、タウタン パク質の増大については、タウmRNAの転写ではなく翻訳の亢進やタンパク質分解経路の破綻など が関与している可能性が示唆された。
primer name forward primer reverse primer
Mouse Tbce#5 5'-GGAAGTAAACAAGTGCAAACTATTGG-3' 5'-ATGGCTCACGGCACAGTTC-3'
!-tubulin#1 5'-GGTTCCCAAAGATGTCAATGCT-3' 5'-CAAACTGGATGGTACGCTTGGT-3'
tau#1 5'-AGACTCCTCCAGGGTCAGGT-3' 5'-GGACCACTGCCACCTTCTT-3'
ribosomal protein L 13A#1 5'-AGCCTACCAGAAAGTTTGCTTAC-3' 5'-GCTTCTTCTTCCGATAGTGCATC-3'
EmGFP#2 5'-CAGGAGCGCACCATCTTCTT-3' 5'-CGATGCCCTTCAGCTCGAT-3'
Antibody name Dilution Manufacturer
DM1A (!-tubulin) 1/5000 (WB, IF) Sigma-Aldrich
Rodent tau N (Total tau) 1/5000 (WB) In house
RTM38 (Total tau) 1/5000 (IF) In house
AT270 (pThr181 tau)! 1/1000 (WB, IF) ThermoFisher
AT8 (pSer202/Thr205 tau) 1/1000 (WB), 1/2000 (IF) ThermoFisher
PHF1 (pSer396/404 tau)! 1/2500 (WB) a kind gift of Dr. P Davies
Anti-MAP2N 1/20000 (IF) In house
Anti-GFP (EmGFP) 1/10000 (IF) Abcam
Western Blot (WB), Immunofluorescence (IF)
ˉ4 ÜɊǪʸċ;Western blotting1ÁɁ#*ƭ¾
ˉ5 qRT-PCR1Ɂ*Ĕprimer̙ë
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1'234 !-+0,0&(# +"$5&6$50
1'234 !-+0,0&(# +"$5&6$50
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ī27 14 DIV17controlċ;miR-Tbce1ɐȼʋʪ5J#mrkkT7ŧį
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ī28 14 DIV17controlċ;miR-Tbce1ɐȼʋʪ5JSer202/Thr205̜ükT2rkkT7ŧį Control ċ; miR-Tbce1 ɐȼmTSfNơǪ"'*ȗ͏ì³ķ͍ɨʎʋʪN 14 DIV 1ĬŔ#Anti-GFP
͗EmGFP͘AT8͗Ser202/Thr205̜ükT͘RTM38͗rkkT͘ƭ¾1 ÜɊǪʸ#*ʏǩNɥ%ɜ
̈́8ʋʪ¾ɜĄ8˷ʊNɥ%
ī29 Control2miR-Tbce1ɐȼɨʎʋʪ5JrkkTċ;Ser202/Thr205̜ükT7ŧ
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
control miR-Tbce1 pSer202/Thr205 tau
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
!"#$ % " & '()
*+!,-total tau
* **
Ratio of Cell body/Axon Ratio of Cell body/Axon
control miR-Tbce1
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0
control miR-Tbce1 pSer202/Thr205 tau (Cell)
!
Ratio in Cell body Ratio in Axon
**
NS0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
control miR-Tbce1 total tau (Axon)
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8
control miR-Tbce1 total tau (Cell)
Ratio in Cell body Ratio in Axon
"
*
NS0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
control miR-Tbce1 pSer202/Thr205 tau (Axon)
# $
ī30 Control2miR-Tbce1ɐȼɨʎʋʪ5JrkkTċ;Ĕɱ̜ükT7ɐȼ̡7Ŕ̡
(A)14 DIV7controlE#8miR-Tbce1ɐȼɨʎʋʪHMicrotubule stabilizing bufferNÁɁ#0 free tubulin2microtubule fractionNĨč#(KHNɁ0Western BlottingNˆ4-*Ĕfraction 5ęAKJrkkTċ;Ser202/Thr205̜ükT8Rodent tau NG;AT8ƭ¾NɁ0 (K)Kǰè#*(B)(A)7qkNɁ 14 DIV50Ĕfraction5ęAKJrkkTG;
Ser202/Thr205̜ükT̡NŔ̡#*͗means ± SEM, n=3͘ǛƠŰǰŔ8paired t-testNɁ0 ˆ4-*͗p*>0.05, vs control͘(C)14 DIV 1ĔʋʪHƐHK* total lysate NɁ0Western blottingNˆ4-*rkkT8Rodent tau NThr181̜ükT8AT270Ser202/Thr205
̜ükT8AT8Ser396/404̜ükT8PHF1ƭ¾NɁ0ǰè#*(D)(C)7qkNɁ 0rkkTċ;Ĕɱ̜ükT̡NŔ̡#*Ĕk{]̡8!-actin NɁ0ǷȤü#*
͗means ± SEM, n=3~10͘ǛƠŰǰŔ8paired t-testNɁ0ˆ4-*͗p* > 0.05, vs control͘
ī30 C t l2 iR Tb 1ɐȼɨʎʋʪ5Jr kkTċ;Ĕɱ̜ükT7ɐȼ̡7Ŕ̡
!"#$%&'()*$*+,$-!"#$%&#$'
!"#$./0
()*+,-,.!/+,-0&
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!"#$1234
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7&89: 54&89:
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?&)*@&A ;<%=
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% of control (/ !-actin) 0 50 100 150
DI V7 DI V14
Total tau
0 50 100 150
7 DIV 14 DIV pSer202/Thr205 tau
% of control (/ !-actin)
*
200 4060 10080 120140
!"#$ !"#%&
pThr181 tau
0 50 100 150 200
DIV7 DIV14
pSer396/404 tau
7 DIV 14 DIV
*
*
-B
-B -B
-B -B
Ratio
CC C
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
free tubulin
fraction microtubule fraction Total tau
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
free tubulin fraction microtubule fraction
pSer202/Thr205 tau
CC
1D7E796
Ratio
!"#$%&#$'
!"#$%&'()*$*+,$-89 :0
97 ()*+,-,.!/+,-0
#$'
!"#$./0
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?+$=#<"@
A+**&#'>'%<@&
A+$=#<"@
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?&)*@&A 54&89:
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?&)*@&A FG+
miR-Tbce1 control
B C
D 8
miR-Tbce1 control
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
DIV7 DIV14