G .
妥，
今0Zn • (ｵM)
STAT3
I ——
30 60
peptide
I ば~; I=
—=——=I
図 4. 亜鉛は STAT3 の立体構造を変化させた
(D) RAW246.7細胞に表記の時間でZnI Pyr処理を行った。 細胞溶解液を調製した後、 ネイティプPAGE を行い、 タンパク質を分離し、抗STAT3 抗体または抗a-tubulin抗体 でウエスタンブロッティングを行った。 242k.Da のサイズマーカーを基準にした泳動距離 を (cm) をバンドの下に表記した。
(E) STAT3 の CDスペク トルを示した。 亜鉛添加量は以下の通りである。 黒OµM、赤：
lµM、黄 5 µM、緑： lOµM、 青： 50µM 、 紫： 150 瓜L
(F) 組換えSTAT3 に亜鉛処理を行い、 gp130ペプチドヘの結合アッセイを実施した。
(G) 組換え STAT3 を用いて、 GST-JA和2 に対する結合アッセイを行った。
10
8
6 4
o』O:>S
V I : :
>
2
゜゜
12
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s
V I : >
0 8
ー 6 4 2
—
•
WT‑O‑IL‑6KO
f f
5 10 15 20 25 30 35
Time a f t e r immunization (days)
W T IL‑17AKO
゜ ゜ Time a
10f t e r immunization (days)
20 30 40参考データ 図 S1. CIA は ILー6 および IL-17A に依存する
IL‑6KO マウスと IL·17AKO マウスおよび野生型マウスに CIA を誘導し、症状のスコア リングを行った。
CDがTcell CDS• Tcell B220• cell CD11c• cell
;~lll
DOW Zni l
DOWl l
ZnNK1.1• cells
i l
DOWl t l
Zn一
l
唸l
DDWt l
ZnP=O 21
l~lll
DOW Znru
DOW ZnCD11b• Gr1 吟 cells
!~ltl
DDW Zn5 0 5 0
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5 4 3 2 1 o 一るLX)•―-OU,＇L』0.qU`03ー。疇
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i~lll
DOW Zni 1
DOWl i
ZnCD11 b• Gr1 low cells
l l
DOWt i
Znt l
DDWt l
ZnSSC
DDW
Zn
FSC
参考データ 図 S2. 亜鉛投与マウスの免疫系に異常はみられない
3000 p.p.m の亜鉛を飲料水咄こ添加して、 2 ヶ月間投与したマウスから、牌臓を摘出し、
フローサイトメータ一を用いて、免疫系の細胞を検出した。
35 ‑ **
30
‑ 弓 20
25`
N C 15 10 5
゜ DDW Zn
参考データ 図 S3. 亜鉛投与マウスの血清中亜鉛濃度は上昇した
3000p.p.m の亜鉛を飲料水中に活加して、 1 ヶ月間投与したマウスから血清を採取し、原 子吸光光度計を用いて、亜鉛濃度を測定した。
ZnS04:
4M) :>
SS
゜ 10 25 50
FSC
参考データ 図 S4. 亜鉛添加培地において、 T 細胞の生存率は変化しなかった
ナイープ CD4+'f 細胞を単離して、表記の濃度の硫酸亜鉛を培地に添加し、 Th17細胞へ分 化する条件 ( IL-6 およびTGF~刺激）で、培養した。 4 日後に、細胞を匡収し、細胞内 染色を行い、フローサイトメーターで解析した。
1.1 1.0
E u
o s
s ｷ
a ｷ
O
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5
** -e-r『eg
‑‑0‑
Th17+Zn
**
**
0.0
゜
ーFoxp3-GFP℃ 2 ells3 (x 10り4 5参考データ 図 85. 亜鉛添加の培養条件で分化する Foxp が細胞は、 T 細胞の増殖 を抑制しなかった
Foxp3—GFP マウスから、ナイーブ CD4+T 細胞を単離して、 Treg 細胞への分化誘導系 (TGFl3刺激）および Th 17 細胞分化誘導系に亜鉛を添加した系 (IL-6、 TGFl3 、 Zn 存在 下）で培養した。 4 日後、 GFp+細胞をソーティングし、ナイープ CD4+T 細胞 (5X 10り、
BMDC (lXlOりおよ虚九 CD3 抗体 (5µg/ml) と表記の数の Foxp3·GFp+細胞を共培 養した。 4 日後、 M'IT アッセイを行い、細胞の増殖を検出した。
pJAK1 I
JAK1 I
I L ‑ 6
Untreated Zn
参考データ 図 S6. 亜鉛処理を行っても IL-6 による JAKl のリン酸化は変化し なかった
CD4+T 細胞を MACS カラムにより単離し、亜鉛を前処理した後に IL-6 刺激を行った。 刺 激後 5 分で、細胞溶解液を調製し、ウエスタンプロッティングで JA.Kl および pJA.Kl
を検出した。
3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 OJJ
゜ 1
3゜ 1
3ータ より、 よる し
ーよ よ イ し
ゞハ
A B
21 0 220 230 240 250 Wavelength (nm)
2 4
•'-OEP•dU3
6 8 O
ー
.?
Pl . . 01 l ^[巴 。
210 220 230 240 250 Wavelength (nm)
参考データ 図 S8. 亜鉛処理による CD スペクトルの変化
亜鉛処理による STAT3 の CD スペク トIレの変化は、亜鉛キレーターの存在ドでも変化し ない (A TPEN、 B. EDTA)。 黒色：硫酸亜鉛 OµM、青色：硫酸亜鉛 50µM (A)、 lO~lM (B) 、 赤色：硫酸亜鉛 50µM+ TPEN 50ｵM (A) 、 硫酸亜鉛 10µM+ EDTA 100ｵM (B)。
Th1 Th17
30 r 45
.!! 25 Je 40
ー 35
゜
CJ 20
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15';fl. ';!. 10
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None Zn゜
None Zn参考データ 図 S9. 亜鉛は Thl 細胞への分化は抑制しない
ナイープ CD4+T 細胞を単離し、 IL-12 存在下、 BMDC と共培養を行い、 Thl 細胞への分 化を誘導した（左図）。ナイープ CD44' 細胞を単離し、 IL-6 と TGF屈存在下、 BMDC と 共培養を行い、 Th17 細胞への分化を誘導した（右図）。 PMAI イオノマイシンで刺激
し、 golgi plug 存在下 6 時間培養した後、細胞内染色を行い、 Thl 細胞と Th17 細胞を検 出した。
+
!FIiiy
(min) 0 15 0 15
+ + IFNa
(min) 0 15 0 15 ll•3 (min) pSTAT5
STATS
0 15 0 15
+ IL‑4
(min) 0 15 0 15
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