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3-5-3 前処理としてのAccurelの粒子径の影響
酵素の吸着量に対する担体の粒子径サイズの影響を検討した．Fig.3-6に示したよ
うに，Accurel 粒子を微細化することによって粒子単位質量あたりの外面積の総和
は増大した．一方，Fig.3-7 に示すように，Accurel の粒子径が微細になるにしたが って吸着量は増大したが，表面積の増分ほど吸着量は増大していない．このことは，
外表面積の増大による吸着量の増大は存在するものの，Accurel 担体の内部に広が っている細孔の表面積における吸着量が支配的であることを示唆している．ただし，
粒子径を小さくすることは，酵素の吸着量の増大ばかりでなく，担体内への拡散抵 抗の減少も期待できるので，固定化酵素の反応速度を向上させる因子として重要で ある．なお，粒子径の変化にともなう反応活性の変化については，担体表面積の変 化とともに本論文4-7で記述している(Fig.4-21～4-22参照)．
Fig.3-6 The outside surface area of Accurel particles
3-5-4 起源の異なるLipaseの吸着
Accurel 表面への Lipase（Rhizopus arrhizus）の吸着の経時変化を示したものが
Fig.3-8である．約24時間の振盪撹拌によってほぼ吸着平衡に達していることがわ
かる．
0 10 20 30 40 50 60 70 80
1 2 3
The outside surface area [m2/kg]
Accurel
(Original) Accurel particles
(A:840-1180μm) Accurel particles (B:500-840μm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0
1 2 3
Amount of lipase [g-enzyme/g-Accurel]
Accurel
(Original) Accurelparticles
(A:840-1180μm) Accurelparticles (B:500-840μm)
Fig.3-7 The adsorbed amount of lipase (Candida rugosa) by using different size of Accurel particles
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4種の起源の異なるLipase（R. arrhizus, C. rugosa, C. cylindracea, wheat germ）を用
いて，24時間後のAccurelへの吸着量の比較を行った結果が，Fig.3-9である．この
ように，同じ担体を用いてもLipaseの起源によって，吸着量がかなり異なる．本研 究では，この理由について，後の3-6で述べるように，酵素自身の疎水性と相関を とって考察した．
Fig.3-8 Amount of adsorbed lipase (Rhizopus arrhizus) per unit mass of Accurel.
位置特異性の異なるR. arrhizus lipaseとCandida rugosa lipaseを取り上げ，吸着平 衡濃度を比較した（Fig.3-10）．
Fig.3-10 の結果に基づき，Fig.3-11 は，Langmuir 吸着等温度式に基づいて解析し
た結果である．直線関係が得られたことから単分子層吸着が推定される．最大吸着 量Qmax[g-enzyme/g-carrier]は，R. arrhizusで8.33×10-3，C. rugosaで4.76×10-3あっ た．R. arrhizus lipaseの方がC. rugosa lipaseよりAccurelに対する吸着親和性が高い と言える．
0 1 2 3 4 5 6
0 500 1000 1500 2000
Amount of adsorbed lipase [mg-enzyme/g-Accurel]
Time [min]
0 1 2 3 4 5 6 7
Candida
rugosa Candida
cylindrecea Rhizopus
arrhizus Wheat Germ Amount of adsorption lipase [mg-lipase/g-Accurel]
Fig.3-9 Amount of adsorbed lipase at 24h was depended on lipase species (Original Accurel)
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Fig.3-10 The change of the amount of adsorbed lipase
3-6 Lipaseの起源と物性
起源の異なるLipaseによって，吸着量に差異が生じる要因として，酵素の疎水性 に着目した．Kyte & Doolittle (1982)並びにEngelman (1986)らは，膜貫通モデル からタンパク質のアミノ酸配列の疎水性を測定し，アミノ酸配列に現れるアミノ酸 の疎水性を定めた(Table 3-1)．(Kyte, J. and Doolittle, R. (1982) J. Mol. Biol. 157:
105-132)．この指標によれば，正値が大きくなるほど疎水的，負値になるほど親水 的な性質を示している．
Table 3-1. アミノ酸の疎水性指標（A列：J.Kyte & Doolittle； B列：D.A. Engelman, T.A.Steitz, A.Goldmanの指標 ）
Protein Date Bank より本研究で取り上げた 4 種の Lipaseのアミノ酸塩基配列を
Fig.3-12に示す．
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 0.5 1 1.5
Amount of adsorbed lipase [mg-enzyme/g-Accurel]
Concentration of lipase [mg/ml]
Rhizopus arrhizus Candida rugosa
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
-10000 10000 30000 50000
q-1[g-Accurel/g-enzyme]
C-1[ml-buffer/g-enzyme]
Rhizopus arrhizus Candida rugosa
アミノ酸 Phe Met Ile Leu Val Cys Trp Ala Thr Gly Ser Pro Tyr His Gln Asn Glu Lys Asp Arg
A 2.8 1.9 4.5 3.8 4.2 2.5 -0.9 1.8 -0.7 -0.4 -0.8 -1.6 -1.3 -3.2 -3.5 -3.5 -3.5 -3.9 -3.5 -4.5 B 3.7 3.4 3.1 2.8 2.6 2.0 1.9 1.6 1.2 1.0 0.6 -0.2 -0.7 -3.0 -4.1 -4.8 -8.2 -8.8 -9.2 -12.3
Fig.3-11 Characterizations of lipase (Rhizopus arrhizus・Candida rugosa) adsorption
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Fig.3-12 Primary amino acid sequence of lipase by (a) Candida rugosa, (b) Candida cylindracea, (c) Rhizopus arrhizus, (d) wheat germ
酵素の一次構造のアミノ酸配列に沿って，疎水性指標(Table 3-1)をグラフ化した ものがHydropathy plotと呼ばれ，Fig.3-13にその結果を示す．Fig.3-13中の赤いラ インを超えるアミノ酸は，細胞膜を貫通できる疎水性を有するアミノ酸である．
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GSLDGQKFTSYGPSCMQQNPEGTYEENLPKAALDLVM QSKVFEAVSPSSEDCLTINVVRP
PGTKAGANLPVMLWIFGGGFEVGGTSTFPPAQMITKSI AMGKPIIHVSVNYRVSSWGFLA
GDEIKAEGSANAGLKDQRLGMQWVADNIAAFGGDPT KVTIFGESAGSMSVMCHILWNDG
DNTYKGKPLFRAGIMQSGAMVPSDAVDGIYGNEIFDLL ASNAGCGSASDKLACLRGVSSDT
LEDATNNTPGFLAYSSLRLSYLPRPDGVNITDDMYALVRE GKYANIPVIIGDQNDEGTFF
GTSSLNVTTDAQAREYFKQSFVHASDAEIDTLMTAYPGD ITQGSPFDTGILNALTPQFKR
ISAVLGDLGFTLARRYFLNHYTGGTKYSFLSKQLSGLPVLG TFHSNDIVFQDYLLGSGSL
IYNNAFIAFATDLDPNTAGLLVKWPEYTSSSQSGNNLM MINALGLYTGKDNFRTAGYDAL
FSNPPSFFV
Candida rugosaLipase(1lpn)
(a)
Rhizopus arrhizusLipase(1tic)
SDGGKVVAATTAQIQEFTKYAGIAATAYCRSVVPGN KWDCVQCQKWVPDGKIITTFTSLL SDTNGYVLRSDKQKTIYLVFRGTNSFRSAITDIVFNFS DYKPVKGAKVHAGFLSSYEQVV
NDYFPVVQEQLTAHPTYKVIVTGHSLGGAQALLAG MDLYQREPRLSPKNLSIFTVGGPRV GNPTFAYYVESTGIPFQRTVHKRDIVPHVPPQSFGFL HPGVESWIKSGTSNVQICTSEIE
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TKDCSNSIVPFTSILDHLSYFDINEGSCL
(c)
Candida cylindraceaLipase (1llf)
APTAKLANGDTITGLNAIINEAFLGIPFAEPPVGNLRFKDPVPYSGSLNGQKF TSYGPSCMQQNPEGTFEENLGKTALDLVMQSKVFQAVLPQSEDCLTINVVR PPGTKAGANLPVMLWIFGGGFEIGSPTIFPPAQMVTKSVLMGKPIIHVAVN YRVASWGFLAGDDIKAEGSGNAGLKDQRLGMQWVADNIAGFGGDPSKVT IFGESAGSMSVLCHLIWNDGDNTYKGKPLFRAGIMQSGAMVPSDPVDGTY GNEIYDLFVSSAGCGSASDKLACLRSASSDTLLDATNNTPGFLAYSSLRLSYLP RPDGKNITDDMYKLVRDGKYASVPVIIGDQNDEGTIFGLSSLNVTTNAQAR AYFKQSFIHASDAEIDTLMAAYPQDITQGSPFDTGIFNAITPQFKRISAVLGDL AFIHARRYFLNHFQGGTKYSFLSKQLSGLPIMGTFHANDIVWQDYLLGSGSV IYNNAFIAFATDLDPNTAGLLVNWPKYTSSSQSGNNLMMINALGLYTGKDN FRTAGYDALMTNPSSFFVAPTAKLANGDTITGLNAIINEAFLGIPFAEPPVGNL RFKDPVPYSGSLNGQKFTSYGPSCMQQNPEGTFEENLGKTALDLVMQSKVF QAVLPQSEDCLTINVVRPPGTKAGANLPVMLWIFGGGFEIGSPTIFPPAQM VTKSVLMGKPIIHVAVNYRVASWGFLAGDDIKAEGSGNAGLKDQRLGMQ WVADNIAGFGGDPSKVTIFGESAGSMSVLCHLIWNDGDNTYKGKPLFRAGI MQSGAMVPSDPVDGTYGNEIYDLFVSSAGCGSASDKLACLRSASSDTLLDA TNNTPGFLAYSSLRLSYLPRPDGKNITDDMYKLVRDGKYASVPVIIGDQNDE GTIFGLSSLNVTTNAQARAYFKQSFIHASDAEIDTLMAAYPQDITQGSPFDTG IFNAITPQFKRISAVLGDLAFIHARRYFLNHFQGGTKYSFLSKQLSGLPIMGTF HANDIVWQDYLLGSGSVIYNNAFIAFATDLDPNTAGLLVNWPKYTSSSQSG NNLMMINALGLYTGKDNFRTAGYDALMTNPSSFFV
(b)
Wheat germ Lipase (3ngm)
AVSVSTTDFGNFKFYIQHGAAAYCNSEAPAGAKVTCSGNGCPTVQSNGATIVASFTGSK TGIGGYVATDPTRKEIVVSFRGSINIRNWLTNLDFDQDDCSLTSGCGVHSGFQNAWNEI SAAATAAVAKARKANPSFKVVSVGHSLGGAVATLAGANLRIGGTPLDIYTYGSPRVGNT QLAAFVSNQAGGEFRVTNAKDPVPRLPPLIFGYRHTSPEYWLSGSGGDKIDYTINDVK VCEGAANLQCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDACSAGGISWRRYRSAKRESISERATMTD AELEKKLNSYVEMDKEYIKTHASRSSAVSVSTTDFGNFKFYIQHGAAAYCNSEAPAGAK VTCSGNGCPTVQSNGATIVASFTGSKTGIGGYVATDPTRKEIVVSFRGSINIRNWLTNLD FDQDDCSLTSGCGVHSGFQNAWNEISAAATAAVAKARKANPSFKVVSVGHSLGGAVA TLAGANLRIGGTPLDIYTYGSPRVGNTQLAAFVSNQAGGEFRVTNAKDPVPRLPPLIFG YRHTSPEYWLSGSGGDKIDYTINDVKVCEGAANLQCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDAC SAGGISWRRYRSAKRESISERATMTDAELEKKLNSYVEMDKEYIKTHASRSSAVSVSTTD FGNFKFYIQHGAAAYCNSEAPAGAKVTCSGNGCPTVQSNGATIVASFTGSKTGIGGYVA TDPTRKEIVVSFRGSINIRNWLTNLDFDQDDCSLTSGCGVHSGFQNAWNEISAAATAAV AKARKANPSFKVVSVGHSLGGAVATLAGANLRIGGTPLDIYTYGSPRVGNTQLAAFVSN QAGGEFRVTNAKDPVPRLPPLIFGYRHTSPEYWLSGSGGDKIDYTINDVKVCEGAANL QCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDACSAGGISWRRYRSAKRESISERATMTDAELEKKLNS YVEMDKEYIKTHASRSSAVSVSTTDFGNFKFYIQHGAAAYCNSEAPAGAKVTCSGNGC PTVQSNGATIVASFTGSKTGIGGYVATDPTRKEIVVSFRGSINIRNWLTNLDFDQDDCSL TSGCGVHSGFQNAWNEISAAATAAVAKARKANPSFKVVSVGHSLGGAVATLAGANLRI GGTPLDIYTYGSPRVGNTQLAAFVSNQAGGEFRVTNAKDPVPRLPPLIFGYRHTSPEY WLSGSGGDKIDYTINDVKVCEGAANLQCNGGTLGLDIDAHLHYFQATDACSAGGISW RRYRSAKRESISERATMTDAELEKKLNSYVEMDKEYIKTHASRSS
(d)
- 52 -
Fig.3-13 Hydropathy plot of tested lipases
さらに，酵素の1次構造の疎水性の値を積算した．Hydropathy Scoreは Candida rugosa lipaseで-5.9，Candida cylindrecea lipaseで-49.4，Rhizopus arrhizus lipaseで-65.2， wheat germ lipaseで-319.2であった(Fig.3-14)．4種とも積算値が負の値になり，分子 全体としては親水性のアミノ酸が優越しているが，Candida rugosaとwheat germで
Candida rugosalipase Rhizopus arrhizuslipase
Candida cylindracealipase Wheat Germ lipase
- 53 -
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