(IN) Exine - スギ花粉内在性β-glucan によるI型アレルギーへの影響に関する研究

(EX)

Sexine (SE) Nexine

(NE)

IN

NE

TC

GC

SE

JCP

EX

(A) (B)

(E)

Fig. 2-3 The fluorescence microscopy of JCP surface staining with mDectin-1 Fc.

(A) mDectin-1 Fc stained unruptured and ruptured JCP (B) EX of ruptured JCP. (C) IN, GC and TC, (D) Zymolyase-treated EX of ruptured JCP. (E) The EX of ruptured JCP treated with biotinylated HA-IgG Fc.

50μm

ruptured

unruptured

EX 10μm

50μm

and TC

50μm

- 40 -

Fig. 2-4 Inhibition of mDectin-1 Fc binding to Pp by polysaccharides.

(A) Inhibition of mDectin-1 Fc binding to Pp with LAM (soluble (1->3)--glucan) and Dex (soluble (1->4, 1->6)--glucan). The white arrows showed signal positive particle and the red arrows showed signal negative particles. (B) The rate of signal positive particles. (C) The mechanism of inhibition.

(D) The residual mDectin-1 Fc concentration by polysaccharides treatment.

0 20 40 60 80 100 120

LAM Dex

0 100 500 μg/mL

LA M D ex

500 g/mL 100 g/mL

0 g/mL

Dectin-1

soluble BG

Signal positive rate (%)

JCP BG

***

n.s.n.s.

0 2 4 6 8

LAM Xyl MC Dex Man

0 2 10 50 μg/mL

Residual Dectin-1 probe in supernatant (ng/mL) (A)

(B)

(D)

(C)

(A) (B)

(C)

Fig. 2-5 The fluorescence microscopy of JCP section staining with mDectin-1 Fc.

(A) Section in EX of ruptured JCP was stained with mDectin-1 Fc (B) Section of GC and TC stained with Dectin-1 (C) Section in EX of ruptured JCP was stained with human IgG1 Fc control protein.

EX 10μm

GC TC

10μm

- 42 - 2-1-3 BGRPを用いた-glucan 局在の検討

supBGRPを用いて花粉自体を染色したところFig. 2-6で示す通り2-1-2で示したmDectin-1

Fc の結果と同様に破裂させた外壁にシグナルが検出されたが破裂内容物表面は染色性が低かった。そこでsupBGRPでスギ花粉中のBGの定量的な局在を明らかにするために分画花粉からのBG抽出物及び破裂上清 (Ps) のBGの含量をsupBGRPのsandwich EIAにて測定した。花粉はFig. 2-7 (A)で示す通りビーズクラッシャーを用いて水及びDMSOで抽出した後DMSO中でオートクレーブ処理を行うことで抽出した。Fig. 2-7 (B)で示す通りスギ花粉の破裂を抑制する弱酸性で処理して得られたPsのBG含量に対して破裂を誘導する弱塩基性溶液での処理では有意にPsのBG含量が増加した。そのため水溶性のBGは破裂により流出していることが示唆された。分画粒子中のBGを比較するとFig. 2-7 (C)で示す通りBG の大部分は破裂内容物中に含有されていた。しかし2-1-2で示したとおり単純な破裂ではこのBGは露出していなかった。一方外殻からもBGは抽出され, その含量は破裂によって放出されるBGと同程度の含量であった。

花粉内の BG 局在を詳細に解析するため電子顕微鏡観察を行った。花粉切片を BmBGRP, 抗 BGRP ウサギ抗体及び金コロイド標識抗ウサギ抗体を用いて染色した後, 電顕にて検討を行った。Fig. 2-8 (A)で示す通り外殻中の染色による金コロイド粒子は花粉壁外壁のネキシン層に局在し, 外壁のセキシン層や内壁のインティン層にはほとんどコロイド粒子は検出されなかった。またこのネキシン層の金コロイド標識はFig. 2-8 (B) (C)で示す通りネキシン層の走行に沿って検出された。一方花粉内容物に対してはFig. 2-8 (D) が示す通り金コロイド標識はGCとTCの間隙に局在していた。

(A) (B)

Fig. 2-6 The fluorescence microscopy of JCP fraction stained with supBGRP.

(A) Pp stained with supBGRP (B) Pc stained with supBGRP 10 m

50 m

(A)

(B) (C)

Fig. 2-7 BG extraction from JCP.

(A) The procedure of BG extraction from JCP fraction. (B)The comparison of BG content by liquidity when during Ps preparation. (C) BG content of each JCP fraction.

BG content (mg/g JCP)

0 1 2

Ps Pc Pp

Wf Df DAf Total

- 44 - (A) (B)

Fig. 2-8 The immunoelectron microscopy of JCP section labeled with BmBGRP and colloidal gold.

(A) The sporoderm of un-ruptured JCP. The arrows were shown the gold particles. (B) EX of JCP.

第二節：in vitro におけるスギ花粉-glucanの免疫刺激作用の検討

2-2-1 immature DCによる検討

スギ花粉の自然免疫賦活化作用について検討するため, マウス骨髄から未熟樹状細胞

(iBMDC)を誘導し, 花粉画分と共培養した後, 培養上清中のサイトカインを測定した。野生

型マウス(WT)とDectin-1KOマウス(KO)を用いて, 両者の反応性について比較した。解析に用いた主要な細胞表面マーカーは Fig. 2-9 で示した通り CD11c(+) CD11b(+) CD86(-) MHC class Ⅱ(-) Dectin-1(+/-)であった。Fig. 2-10(A) (B)で示した通り, WTのiBMDCではスギ花粉

(JCP)及びPpとの共培養により濃度依存的にTNF- 産生が認められた。一方, KOではJCP

及びPpとの培養による濃度依存的な TNF- 産生は見られなかった。この結果は粒子状の BG 試薬である dZym による刺激と同様な傾向であった。一方 Pc 及びPs による刺激では

WT, KO両者でTNF- 産生は見られなかった。またFig. 2-10 (C), (D)で示す通りTNF-同様

に炎症性のサイトカインであるIL-6の産生量は少なく, JCP, Pp及びdZymによる刺激濃度依存的なサイトカイン産生量の増加は見られたもののマウス種間での有意な差は見られなかった。またLPSとの共培養ではWT, KO両者でTNF-は有意な差が無く, IL-6はKOで産生量が多い結果となった。

Fig. 2-9 The surface marker of immature BMDC at day 5 determined with flowcytometry.

Major cell population of FCS-SSC and CD11c positive cell population was gated. The expression of CD86, MHC classⅡ,Dectin-1 and CD11b on the gated cell was investigated.

MHC Dectin-1 CD11b

SSCFSC CD86

KO WT

CD11c

- 46 - (A) (B)

Fig. 2-10 The cytokine production of immature BMDC stimulated with JCP fraction.

(A) TNF- production of immature BMDC derived from WT mice. (B) TNF- production of immature BMDC derived from Dectin-1 KO mice. (C) IL-6 production of immature BMDC derived from WT mice (D) IL-6 production of immature BMDC derived from Dectin-1 KO mice.

0 2 4 6 8 10

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

TNF-α(ng/mL)

n.s. n.s.

*** **

0 2 4 6 8 10

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

0 1 10 100μg/mL KO

0 1 2 3 4 5

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

IL-6 (ng/mL) WT

n.s.

0 1 2 3 4 5

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

2-2-2 mature DCによる検討

2-2-1で示したようにiBMDCは花粉の刺激によりDectin-1依存的にTNF-の産生が誘導され

た。immature DCはTNF- と培養するとmature DCに誘導される。そこでimmature DCをさらに

TNF-と共培養し成熟樹状細胞(mBMDC)を調製して花粉による刺激を行った。TNF- によって

mBMDC の主要な細胞群の表面マーカーは Fig. 2-11 が示す通り CD11c(+), CD11b(+), CD86(+), MHC class Ⅱ(+)及び Dectin-1(+/-)であった。また Dectin-1の発現はCD86高発現細胞群ではほぼ消失していた。この細胞群を刺激したところ Fig. 2-12 (A), (B)が示す通り TNF-の産生量はiBMDC に比べて低かった。一方で, IL-6 は Fig. 2-12 (C), (D)が示す通り JCP 及び花粉分画それぞれの刺激によって誘導され, Pp, Pc, Ps の順に高い産生が認められた。このうちJCP及びPpでの刺激によるIL-6産生誘導はKOでWTに対して有意に低下した。LPSとの共培養ではWT,KO両者でTNF-及びIL-6の産生量に有意な差は無かった。

Fig. 2-11 The surface marker of mature BMDC at day 10 determined with flowcytometry.

Major cell population of FCS-SSC and CD11c positive cell population was gated. And the expression of CD86, MHC classⅡ,Dectin-1 and CD11b on the gated cell was investigated.

MHC Dectin-1 CD11b

SSCFSC CD86

KO WT

CD11c

- 48 - (A) (B)

(C)

Fig. 2-12 The cytokine production of mature BMDC stimulated with JCP fraction.

(A) TNF- production of mature BMDC derived from WT mice. (B) TNF- production of mature BMDC derived from Dectin-1 KO mice. (C) IL-6 production of mature BMDC derived from WT mice (D) IL-6 production of mature BMDC derived from Dectin-1 KO mice.

0 2 4 6 8 10

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

0 2 4 6 8 10

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

0 1 10

100μg/mL KO

0 1 2 3 4 5

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

IL-6 (ng/mL) WT

***

n.s.

** 0

1 2 3 4 5

Med JCP Pc Pp Ps dZym LAM

TNF- (ng/mL)

第三節：in vivo におけるスギ花粉-glucan の免疫刺激作用の検討

2-3-1花粉症モデルマウスにおける花粉-glucan の関与の検討

花粉症発症におけるスギ花粉BGの関与について明らかにするために既報の花粉抽出物投与による花粉症モデルを参考にエタノール消毒した花粉粒子をマウスに投与し, 花粉症様のアレルギーモデルを作成した。WTとKOマウスをそれぞれ, ネガティブコントロール群として生理食塩水を経鼻投与した群(NT), ポジティブコントロール群として Dectin-1 非依存的なメカニズムで免疫反応を誘導する Alum アジュバントと花粉を事前に腹腔内投与し感作状態にした後に花粉の経鼻投与を行った群(Alum), そしてWTとKOを比較するための花粉を経鼻投与した群(JCP) との3群に分けた。投与スケジュールに関してはFig. 2-13で示した。最終投与時点での臨床症状として投与直後から3分間のくしゃみ回数をカウントしたところFig. 2-14 (A)で示す通りWT ではJCPはNTに対して有意に増加し, Alumと同等なくしゃみ頻度となった。一方, KOではJCP のくしゃみ頻度はNTに対して有意な増加を示さず, Alumに対しては有意に低頻度であった。しかしマウス間で JCP 群を比較すると有意差が付くには至らなかった。くしゃみ以外のパラメータでの検討のため血中の抗体についてマウス間で比較した。Fig. 2-15 (A)で示す通り総IgG及び

総IgEはNT間, Alum間ではそれぞれマウスの違いによる差は無かったがJCP間ではKOで有

意に低下していた。またJCP特異的なIgG及びIgEはFig. 2-15 (B)で示す通り総IgG及び総IgE と同様JCP群のみでマウス間の血中抗体量に有意な抑制が見られた。そこでJCP特異的IgGについて1週間ごとに測定した。Fig. 2-15 (C) (D) で示す通りNT およびAlumではマウス間で特異的IgGの血中レベルの変化は同様であった。JCPについて比較するとFig. 2-15 (E)で示す通り WTでは7回目の投与直前のday 21より特異的IgGレベルの上昇が見られるが, KOでは最終投

与後のday 43まで特異的IgGレベルの上昇は見られなかった。花粉特異的なリンパ球の反応に

ついて検討するため脾臓細胞を花粉で二次刺激したところ Fig. 2-14 (B)で示すとおり JCP では

KOで有意にIL-13の産生が抑制されていた。

Fig. 2-13 The schedule of administration in in vivo JCP inducing allergic mouse model.

↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ i.p.

presensitization

i.n.

administration

↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓

Blood sampling

Sacrifice

0 -7 7 14 21 28 35 42 43

Day

- 50 - (A)

(B)

Fig. 2-14 Symptoms and cytokine parameter in serum of JCP inducing allergic mouse model.

(A) Sneezing frequency of 3 minutes after administration at day 42. (B) IL-13 production of splenocyte by secondary stimulation with JCP.

sneezing (times/3 mins)

** ***

** ^n.s. ^n.s.

n.s.

NT JCP

Alum NT JCP

Alum 0

10 20 30 40 50

WT KO

IL -13( pg /m L)

0 100 200 300 400

NT JCP Alum NT JCP Alum

WT KO

Med 1

10 ug/mL

n.s.

(A) (B)

(E)

Fig. 2-15 Immunoglobulin titer in serum of JCP inducing allergic mouse model.

(A) Total IgE and IgG titer in serum at day 43. (B) JCP specific IgE and IgG titer in serum at day 43.

(C) Measurement of JCP specific IgG titer across time in NT mice. (D) Measurement of JCP specific IgG titer across time in Alum mice. (E) Measurement of JCP specific IgG titer across time in JCP mice.

0 5 10 15 20

0 50 100 150 200 250

NT JCP Alum NT JCP Alum

WT KO

IgE IgG

Total IgG (mg/mL)

Total IgE(ng/mL)

*** n.s.

n.s.

(days)

JCP s-IgG (Potency(%))

0 20 40 60 80 100

0 7 14 21 28 35 43 WT KO

0 20 40 60 80 100

0 7 14 21 28 35 43 (days)

n.s.

n.s. n.s. n.s.

n.s. n.s.

0 20 40 60 80 100

0 7 14 21 28 35 43

WT KO

(days)

JCP sIgG(Potency(%)) _**

0 20 40 60 80 100

0 5000 10000 15000 20000 25000

NT JCP Alum NT JCP Alum

WT KO

sIgE sIgG

JCP sIgE(Fluorescent intensity) JCP sIgG(Potency(%))

n.s. **

n.s.

n.s.n.s.

- 52 - 第二章：考察

本章ではスギ花粉の持つBGの局在及び免疫学的な活性をBGRP 及びDectin-1 の反応性から検討した。第一節で示した通り花粉に含まれる水溶性BGは破裂と共に放出され, 不溶性の BG はその大部分が破裂内容物に含まれる花粉管細胞と生殖細胞の細胞壁に局在していた。しかし花粉内容物中のBGは破裂したのみでは露出せず第二節で示したように樹状細胞に対する刺激活性も低いものであった。一方, 樹状細胞に対する刺激活性が高いBGは破裂した外殻に含まれていた。外殻は花粉壁外壁のセキシン及びネキシンからなり, BG はネキシンに局在しているが破裂していない状態では mDectin-1 Fc による染色性が無かったことから非破裂状態ではセキシンによって覆い隠され反応性は低いと考えられる。しかし破裂することでネキシンに局在したBGが露出し, 刺激活性を発揮すると考えられる。破裂した外殻は菌体とは違いmDectin-1 Fc及びsupBGRPによる染色ではスポット状に染色されていたこと及び花粉壁内壁のインティンに対する染色性は低く BG はネキシンの層間に多く分布していることから, 破裂による内壁の離脱そのものがBGの露出の理由ではなく, 破裂により露出したネキシン層が花粉破裂時に破断, 剥離することでその隙間からBGが露出したと考えられる。

スギ花粉は弱塩基性の液性で破裂しやすくなることや中性緩衝液中でも 37℃では破裂が促進されることが報告されている。花粉症におけるスギ花粉の侵入ルートのひとつである鼻腔中で花粉が破裂するためには鼻汁もしくは粘膜への接触が重要であると考えられ, 健常人では鼻汁の産生は少なく正常な鼻汁のpHについての報告は無いが鼻汁のpHは慢性副鼻腔炎患者でpH 7.50±0.66 アレルギー性鼻炎患者でpH 8.65±0.52でありアレルギー状態ではアルカリ性に傾くことが報告されている ^{87, 94)}。そのため花粉によるアレルギーが悪化するほど鼻腔に侵入したスギ花粉は破裂しやすくなると考えられる。またそれ以外にも眼からの花粉の侵入も重要な感作ルートである。健常人の涙液の pHは 7.35付近で季節性の変動をし, 春は7.5 付近に変化する。また, トラコーマなど感染性疾患ではpH は酸性寄りに, 春季カタルなどのアレルギー疾患では塩基性寄りに変化することが報告されている ⁹⁵⁾。そのため鼻腔同様に感作が進むとよりスギ花粉の破裂が起こりやすくなると考えられる。

第二節では樹状細胞に対する花粉粒子の持つDectin-1依存的な反応性について検討した。

Dectin-1を介したBGによる作用はマクロファージでの貪食作用の誘導や活性酸素種の産生,

マクロファージや樹状細胞による炎症性サイトカインの産生などが報告されている。そのため粘膜上皮において BG は炎症誘導や活性酸素種による上皮バリアの破壊及び炎症性サイトカインによる免疫系の賦活化などを誘導していることが想定される。

樹状細胞は粘膜上皮に樹状突起を伸ばしており, 病態によって上皮組織内への遊走をすることが知られている。そのため上皮バリアが健全な状態では上皮表面に伸ばした突起からBGを認識し, 上皮バリアに破壊がなされれば直接的な接触によるBG認識をすることが可能であると考えられる。一方で, データとして示していないがin vitroで骨髄より誘導し

ドキュメント内スギ花粉内在性β-glucan によるI型アレルギーへの影響に関する研究 (ページ 43-61)