図6．5焦点エラー検出法を採用したAFM装置の外観
，
､ 洲
私
解
7 分 子 間 相 互 作 用 の 研 究
本課題研究ではハードウェアの製作も重要な課題の一つであるが、AFMによる分子間相 互作用の研究を1分子レベルで行う方法の開発も重要課題の一つであった。これまでAFM による分子間相互作用の研究は世界的にみても数えるほどしかなされていない。且つ、真 に1分子レベルで研究した例は皆無である。数分子以上が相互作用に関わっており、1分 子の特性を明瞭に求めることはほとんどなされていない。我々は、カンチレバー探針先端 に蛋白質を1分子だけ捕捉するための方法を先ず開発しなければならなかった。AFM以外 の周辺技術（生化学、高分子化学）が必要であった。
我々は蛋白質としてアクトミオシンモーター蛋白質系に絞ってこの周辺技術を開拓した。
ミオシンのサブフラグメントであるHMMを探針先端に捕捉することにした。そのための 戦略を以下の様に設定した。
1．捕捉にはアピジン・ビオチン間の強い親和性を利用する。
2.HMMを蛍光標識し、個々のHMM分子の局在を可視化する。
3．可視化されたHMM1分子に探針を近づけて捕捉する。
7 . 1 H M M の ラ ベ リ ン グ
HMMを蛍光標識する上で最も重要な点は、蛍光標識によってHMMの機能を損なって はならないという点である。これまでHMMの化学修飾は多くなされてきたが、それらは いずれも機能を多かれ少なかれ損なうものであった。そこで化学修飾法は採らず、酵素反 応修飾法を試みた。トランスグルタミナーゼ(TGase)は蛋白質のグルタミン残基のアミ
ド 基 を ア タ ッ ク し 、 活 性 化 す る 。 活 性 化 さ れ た ア ミ ド 基 は 外 部 に 加 え た ア ミ ノ 基 と 置 換 反 応する。そこで外部アミノ基としてビオチンカダベリンを用いることにした。実際に行っ てみると、ビオチンがHMMに最大4分子導入されることが分かった。ラベルされたHMM
のMg‑ATPase活性、Actin‑ActivatedATPase活性を測定してみると、ラベルによる活性に
変化は全く見られなかった（図7.1参照)。また、このラベルされたHMMでアクチンフィ ラメントの滑り運動を観察したところ、滑り速度はインタクトなHMMの場合と変わりが なかった。こうして、機能を損なわないラベリングが成功した。HMMのどこに修飾が起 こったかを、ダンシルカダベリンでラベルされたHMMをトリプシンで限定分解して調べ たところ、カダベリンはすべてHMMのS2部に局在していた。図7.1TGaseを利用した修飾のHMMの活性への影響
4○
︵○①の一三三工①○Ｅ二Ｑ①○Ｅ︶
3○
2○
1○
Ｅン
○
Tablel:Slidingvelocityofactin且lamentsonHMMandHMM‑bead c o m p l e x e s . .
Nitrocellulose‑
coatedcoverslip ("n/sec)
UltraAvidin‑bead‑
coatedcoverslip ("m/sec) 4.8jzl.0(n=34)
Controlu 、 C
BiotinylatedHMM64.7士09(n=34)45士0.8(n=35)
DataintheTablearemeanvelocitiesSD.forthenumberofobservation
indicatedinparentheses.(a)HMMincubatedfor3hwithouttransglu‑
taminase.(b)HMMincubatedfbr3hinthepreseceoftransglutaminase andbiotincadaverine.(c)Noactinalamentswerefoundonthesurface dueverylikelytotheabsenceofattachedHMM.
7.2蛍光ラベリング
我々のAFM1号機はオリンパス光学工業のIMT2倒立型蛍光顕微鏡の上に載っている。
この顕微鏡はIX70に比べて暗い。それ故、個々のHMM分子の可視化には、HMM1分子に かなり多数の蛍光性分子を導入しなければならない。そこで、アビジンコートされた蛍光 性ビーズをピオチン化HMMに導入することにした。市販のビオチン化蛍光性ビーズを試 みたが、いずれも非特異的に蛋白質に結合してしまい使えるものが無かった。そこで、自
らビーズを調製する道を選んだ。ポリアクリルアミドは蛋白質に全く結合しないので非常 に都合が良い。しかし、ポリアクリルアミドで小さいビーズを調製する方法は確立されて いなかった。多くの試行錯誤の後、逆相マイクロエマルジョン中でアクリルアミドを重合 させる方法で直径30nm程度のビーズを作る方法を確立させた。このビーズを無水エチレ ンジアミン中で熱することにより、アミノ基を多数導入することができた。このアミノ基
にアミノ基反応性の蛍光色素Cy3とビオチンを反応させた。これに、アビジンとして非特
異的吸着の無いストレプトアビジンを結合させた。このストレプトアビジンコートされた 蛍光性ビーズ大過剰とビオチン化されたHMMをまぜ、アクチンアフイニテイーカラムで HMM‑ビーズ複合体を精製した。この複合体を電子顕微鏡とAFMで観察したところ、ビー ズはすべてHMMのS2先端部(S2‑LMMジャンクション）だけに結合していた（図7.2)。
ま た 、 導 入 さ れ た ビ オ チ ン が 4 分 子 に も 拘 わ ら ず 、 結 合 し た ビ ー ズ は H M M に 1 個 だ け で あった。このことはビオチン導入部位が非常に近くにあることを意味する。S2部のアミノ 酸配列を調べてみるとグルタミン残基は色々な部分に存在するが、TGaseでアタックされ
るフレッキシブルな領域にあるグルタミン残基はS2先端部分に4個あるのみであった。S2 先端にビーズを導入できたことは非常に幸いであった。
7.3HMM1分子の捕捉
まず、カンチレバー探針先端をビオチン化する。このために次の方法を採った。
oピオチン化シランの希薄メタノール溶液をカバーガラスに垂らし軽く乾燥させる。こ れにカンチレバー探針を接触させたのち、針を乾かす。
カバーガラス表面にポリリジンをコートし、それにアクチンの束（ローダミンファロイ ジンで蛍光染色）を固定した。低濃度のHMMビーズ溶液をその上にたらしてから十分に 洗う。蛍光顕微鏡でアクチンの上に結合している個々のHMM‑ビーズの局在を確認する。
カンチレバー探針をその1個のHMM‑ビーズに近づける。探針も蛍光顕微鏡で見ることが できるので比較的容易に行えた。ビーズの像の真上に探針先端を持ってくるように試料ス
図7．2調製したHMM‑ビーズのEM像とAFM像
．︲︲︒！・・︲散・・没淨録蝿部︲料察叩．
一 ■
・申哉凸伊︲今舎ｒ５二︑ｐｇ
Ｑ■勺四ｅＯ０９◆︒●碑︑駅Ｄや●ｄ９︐．９●・・患琴醗強繁異懲蕊蕊齢蕊謹
ｐ Ｌ ｑ Ｑ ４ ｏ ０ 巳 吠
■ 〆
● Ｆ Ｏ ｐ ０
ｇｑｅ ０零口岬呼︐︾酌湖碑．叩Ｌ心︒配蝿かい．虹守︽〆拒︒︾釘檸．︐０肌院ｒ姑︲酢．ｏし．・・
Ｕ■句■ｐｐ
６．︐．．．︐・︲・ぺき．一Ｊ難い蕊轆域荊瀞泌■ｃｑｂＤ■０も骨ＤＰ９Ｇ砂ＤＴｆｑｃａ
ｑｑ■ＵＤ
ＯｏＧ
０４■
ｆ
ｂＢＤ
個包
Ｐ日や凸●●■■■Ｉ
■ｐｐ９Ｂ●◆■■●
蕊郡．煽恐謎鈎燕恋︾称喝嘩潅︲矧叱︑蠣咄減・・ｏｆ︽函群瘤心由４︑︒●・恥■
■０
８ 口
■ ８
． ｆ 言 ９
■■■●・印■■■●■■Ｂｇ
Ｄ
ｇ Ｕ０
ｄ ＢＤＦか卜ｑ■しロ︑
■
■■■
ＰＦ■■●一■
ー ■ ロ ー ■ ● ■
鵜
㈱
I蹄 鮒
テージを調盤し、その後コンスタントフオースモードで1/4m四方をゆっくりと走査する。
光学顕微鏡で位世を合わせたといっても、接触できるほどまで近づけたかどうかは定かで ないので、この走査の途中で接触するのを待つしかない。通附1回の走査で抽捉すること が で き た 。 捕 捉 の 確 認 は 、 走 査 後 カ ン チ レ バ ー 探 針 を 試 料 基 板 か ら 上 方 に 引 き 上 げ て 、 蛍 光 性 ビ ー ズ が 試 料 基 板 か ら 無 く な り 探 針 先 端 に 移 動 す る こ と を 観 察 す る こ と で 容 易 に 行 え た 。 た だ し 、 以 上 の 諸 過 程 を 迅 速 に 行 わ な い と 蛍 光 性 ビ ー ズ が 退 色 し て し ま い こ の 碓 認 が できなくなってしまう。
7 . 4 ア ク チ ン ･ H M M 間 の ラ イ ガ ー 相 互 作 用 場 の 計 測
H M M l 分 子 を 揃 捉 し た カ ン チ レ バ ー を ア ク チ ン の 束 に 対 し て 近 づ け た り 遠 ざ け た り し た ときのレバーの応答の様子（フオーース・デイスタンス曲線）を図7．3に示す。また、この曲 線 か ら 推 測 さ れ る 様 子 を 図 7 ． 4 に 示 す 。 詳 細 な 解 析 過 程 は 参 考 文 献 に 詳 し く 載 せ て い る の で、ここでは得られた定赴的結論のみを述べる。ミオシン頭部とアクチンは5.411m離れたと
ころで互いを認識する。この認識距離において互いの間にl.9pNの力が働き、1.82pN/nm の力の勾配が存在する。結合した両者を引き離すのに必要な力は14.8pNで、完全に引き離
されるまでに、l.7〜2.5nmの伸びが両分子間に起こる。このような定量的に詳細な蛋白質 間相互作用の場の記述はこの研究が初めてである。これも妥協せずに、真に1分子だけを#ili捉することを追求した結果である。
図7.3HMM‑Actin相互作用のフォース・デイスタンス曲線
○
f 卿 鐸
E
40pN
D B
C