13 (5.40 g, 12.6 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後、ピリジン (20 mL) に溶 解し、無水トリフルオロ酢酸 (3.57 mL, 25.2 mmol) を0 °C で滴下しアルゴン 雰囲気下室温で1時間攪拌した。反応終了後、0 °CでMeOH (10 mL) を加え反 応を終結させた。溶媒を減圧留去した後、残渣を中性シリカゲルカラムクロマ トグラフィー (クロロホルム : メタノール= 30 : 1 → 20 : 1) で分離精製し、淡 黄色油状14 (5.21 g, 79%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.47–7.21 (m, 5H), 4.75 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 3.95–3.93 (m, 2H), 3.70–3.57 (m, 2H), 3.47–3.42 (m, 1H), 3.38–3.34 (m, 1H), 1.08–1.07 ppm (m, 21H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 158.2 (q, J = 37.2 Hz),
132.8, 131.9, 128.9, 128.1, 115.6 (q, J = 286 Hz), 85.3, 78.7, 74.8, 72.8, 64.6, 54.9, 17.9, 11.7 ppm; MS (DRAT) m/z 524 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C23H36F3NO5SSi [M+H]+: 524.2114. Found: 524.2128; Anal. Calcd for C23H36F3NO5SSi: C, 52.75; H, 6.93; N, 2.67. Found: C, 52.73; H, 6.89; N, 2.67.
Phenyl 3,4-di-O-benzoyl-2-deoxy-1-thio-2-trifluoroacetylamino-6-O- triisopropylsilyl-β-D-glucopyranoside (15)
14 (5.21 g, 9.95 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後、ピリジン (20 mL) に溶 解し、BzCl (4.62 mL, 39.8 mmol) を0 °C で滴下しアルゴン雰囲気下室温で1 時間攪拌した。反応終了後、0 °CでMeOH (25 mL) を加え反応を終結させた。
溶媒を減圧留去した後、残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘ キサン : 酢酸エチル = 5 : 1 → 4 : 1) で分離精製し、無色油状15 (6.07 g, 83%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.86–7.85 (m, 4H), 7.59–7.41 (m, 4H), 7.34–7.19 (m, 7H), 6.00–5.95 (m, 1H), 5.61–5.56 (m, 1H), 5.10 (d, J = 10.0 Hz, 1H), 4.48–4.40 (m, 1H), 4.03–3.98 (m, 1H), 3.95–3.91 (m, 2H), 1.02–1.01 ppm (m, 21H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.6, 165.0, 157.3 (q, J = 37.2 Hz), 133.8, 133.3, 132.8, 131.8, 129.8, 129.4, 128.9, 128.5, 128.3, 128.2, 128.1, 115.4 (q, J = 287 Hz), 86.3, 79.6, 74.5, 69.2, 62.8, 53.6, 17.9, 11.8 ppm; MS (DRAT) m/z 732 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C37H45F3NO7SSi [M+H]+: 732.2638. Found: 732.2655.
1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-3,4-di-O-benzoyl-2-trifluoroacetylamino-6-O- triisopropylsilyl-β-D-glucopyranose (16)
15 (6.07 g, 8.30 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後、CH2Cl2 (15 mL) に溶解 し、MS 4Å (2 g)、 NIS (4.70 g, 20.8 mmol)、TfOH (150 μL) を加えアルゴン雰 囲気下室温で15分間攪拌した。反応終了後、MS 4Å をセライトでろ過した。
ろ液を CHCl3 (50 mL) にて抽出し、有機層を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液
(50 mL) 、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 (50 mL) 、飽和食塩水 (50 mL) で
洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリ カゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン : 酢酸エチル = 3 : 1) で分離精 製し、淡黄色油状16 (5.01 g, 78%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91–7.88 (m, 4H), 7.55–7.47 (m, 2H), 7.38–7.27 (m, 9H), 5.68–5.63 (m, 1H), 5.57–5.52 (m, 1H), 4.87 (d, J= 8.4 Hz), 4.59–4.48 (m, 2H), 4.28–4.20 (m, 1H), 4.03–3.98 (m, 1H), 3.94–3.76 (m, 4H), 3.70–3.59 (m, 2H), 1.01–1.00 ppm (m, 21H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 166.9, 165.0, 157.4 (q, J = 37.2 Hz), 137.9, 133.6, 133.3, 129.9, 129.6, 129.1, 129.0, 128.4, 128.4, 127.8, 127.7, 125.4, 115.6 (q, J = 287 Hz), 100.7, 75.5, 73.2, 72.9, 69.3, 69.1, 68.8, 62.7, 55.1, 17.8, 11.9 ppm; MS (DRAT) m/z 774 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C40H51F3NO9Si [M+H]+: 774.3285. Found: 774.3252; Anal. Calcd for C40H51F3NO9Si: C, 62.08; H, 6.51; N, 1.81. Found: C, 61.91; H, 6.37; N, 1.68.
3,4-Di-O-benzoyl-2-deoxy-1-O-(2-hydroxyethyl)-2-trifluoroacetylamino-6-O- triisopropylsilyl-β-D-glucopyranose (17)
16 (1.50 g, 1.93 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後、THF (80 mL) に溶解し、
20% Pd(OH)2/C (450 mg, 30 wt %)を加えH2雰囲気下室温で72時間攪拌した。反 応終了後、Pd(OH)2/Cをセライトでろ過した。ろ液をを減圧留去した後、残渣 を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で分離精製し、無色固体17 (1.18 g, 89%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.90–7.86 (m, 4H, H-Ph), 7.51–7.45 (m, 2H), 7.36–7.30 (m, 4H), 5.71–5.66 (m, 1H), 5.55–5.50 (m, 1H), 4.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.29–4.22 (m, 1H), 3.90–3.71 (m, 7H), 1.00–0.99 ppm (m, 21H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 167.1, 165.0, 157.7 (d, J = 37.2 Hz), 133.7, 133.4, 129.9, 129.6, 128.9,
128.5, 128.4, 128.3, 115.5 (d, J = 286 Hz), 101.2, 75.5, 72.8, 72.5, 69.0, 62.7, 62.1, 55.3, 17.8, 11.8 ppm; MS (DRAT) m/z 684 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C33H44F3NO9Si [M+H]+: 684.2816. Found: 684.2817; Anal. Calcd for C33H44F3NO9Si: C, 57.96; H, 6.49; N, 2.05. Found: C, 57.60; H, 6.23; N, 2.00.
3,4-Di-O-benzoyl-2-deoxy-1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]-2-trifluoroacet yl-amino-6-O-triisopropylsilyl-β-D-glucopyranose (18)
17 (1.18 g) をデシケーターで一晩乾燥後、ピリジン (12 mL) に溶解し、
DMTrCl (697 mg, 2.07 mmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で24時間攪拌した。
反応終了後、MeOH (10 mL) を加え反応を終結させ、溶媒を減圧留去した。残 渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー (数滴ピリジンを有する酢酸 エチル) で分離精製し、無色固体18 (1.67 g, 98%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.91–7.87 (m, 4H), 7.51–7.17 (m, 15H), 6.83 (d, J = 8.8 Hz, 4H), 5.63–5.51 (m, 2H), 4.80 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.30–4.22 (m, 1H), 4.02–3.74 (m, 4H), 3.34–3.29 (m, 1H), 3.22–3.19 (m, 1H), 1.01–1.00 ppm (m, 21H);
MS (DRAT) m/z 986 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C54H63F3NO11Si [M+H]+: 986.4123. Found: 986.4166.
3,4-Di-O-benzoyl-2-deoxy-1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]-2-trifluoroacet yl-amino-β-D-glucopyranose (19)
18 (597 mg, 600 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後、THF (10 mL) に溶解し、
TBAF (910 μg, 910 μmol) を加えアルゴン雰囲気下室温で22時間攪拌した。反
応終了後、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフ ィー (数滴ピリジンを有するヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で分離精製し、無 色固体19 (341 mg, 68%) を得た。
1H NMR (CDCl3) δ 8.00–7.94 (m, 4H), 7.56–7.23 (m, 15H), 6.80 (d, J = 8.8 Hz, 4H),
5.29–5.25 (m, 1H), 4.91 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.58–4.54 (m, 1H), 4.42–4.38 (m, 1H), 4.29–4.24 (m, 1H), 3.98–3.94 (m, 2H), 3.76–3.69 (m, 8H), 3.35–3.19 ppm (m, 2H);
MS (DRAT) m/z 830 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C45H43F3NO11 [M+H]+: 830.2788. Found: 830.2761; Anal. Calcd for C45H42F3NO11·H2O: C, 63.75; H, 5.23; N, 1.65. Found: C, 63.45; H, 5.25; N, 1.73.
Solid support (20)
19 (531 mg) をCPG樹脂固層担体11の合成方法と同様に合成を行い、CPG樹脂
固層担体20 (1.56 g) を得た。その活性は19.3 μmol/gであった。
N3-Bz-Thymine79)
Thymine (10.0 g, 78.5 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後、pyridine (40 mL) とMeCN (100 mL) に溶解し、 BzCl (28 mL, 235.5 mmol) を加えアルゴン雰囲 気下室温で24時間攪拌した。原料が消えた後、MeOHを加え反応を終結させ、
Tolueneと共沸し、溶媒を減圧留去した。粗生成物に0.5 MのK2CO3 (60 mL) と Dioxane (120 mL) を加え、さらに室温で24時間攪拌した。反応液をCHCl3 (120 mL) にて抽出し、有機層を2 MのHCl水溶液 (100 mL) 、飽和炭酸水素ナト リウム水溶液 (100 mL) 、飽和食塩水 (100 mL) で洗浄し、無水硫酸ナトリウ ムで乾燥させた。CHCl3で再結晶を行い、N3-Bz-Thymine (8.22 g, 45%) を得た。
Scheme 3. Synthesis of N3-Bz-Thymine and Di-Boc-Adenine. Reagents and conditions: (a) BzCl, pyridine, MeCN; (b) K2CO3, Dioxane, H2O
1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-2-phthalimino-3,4,6-tri-O-acetyl-β-D-gluco- pyranose80) (21)
2 (50 mg, 105 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後、MeCN (2 mL) に溶解し、
2-benzyloxy ethanol (150 μL, 1.05 mmol)、BF3·OMe2 (29 μL, 315 μmol) を加えア ルゴン雰囲気下90 °Cで5時間還流した。反応終了後、反応温度を室温まで戻 し、TEA を加え反応を中和し、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲル カラムクロマトグラフィー (ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1 → 1 : 2) で分離精
Scheme 4. Synthesis route of 6'-basic glucosamine monomer unit. Reagents and conditions: (a) Benzyloxyethanol, Me2O·BF3, MeCN, reflux, 67%; (b) MeONa, MeOH, rt, 88%; (c) N3-Benzoyl-thymine, PPh3, DEAD, THF, rt, 84%; (d) Ethylenediamine, EtOH, reflux, 87%; (e) (CF3CO)2O, pyridine, rt, 90%; (f) Pd(OH)2/C, H2, THF, rt, quant; (g) DMTrCl, Pyridine, rt, 79%;
(h) (i) Succinic anhydride, DMAP, pyridine, rt; (ii) CPG, EDC, DMF, rt, 37 umol/g.
製し、無色固体21 (40 mg, 67%) を得た。
1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-2-phthalimino-β-D-glucopyranose (22)
21 (1.42 g, 2.50 mmol) をデシケーターで一晩乾燥後、MeOH (20 mL) に溶解し、
MeONa (28% in MeOH) (10.0 mL, 48.9 mmol) を加え室温で30分間攪拌した。
反応終了後、AcOHを加え反応を中和し、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シ リカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 2) で分 離精製し、無色固体22 (1.06 g, 88%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.82–7.77 (m, 2H), 7.70–7.66 (m, 2H), 7.24–7.20 (m, 3H), 7.11–7.08 (m, 2H), 5.34 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 4.39–4.34 (m, 1H), 4.27 (2H, s), 4.16 (dd, J = 11.0 Hz, 8.5 Hz, 1H), 3.97–3.87 (m, 3H), 3.73–3.66 (m, 2H), 3.56–3.52 (m, 1H), 3.48–3.45 ppm (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 168.5, 138.0, 134.0, 131.7, 128.2, 127.4, 123.4, 98.5, 75.5, 72.9, 71.7, 71.6, 69.1, 68.8, 61.9, 56.6 ppm;
MS (DRAT) m/z 444 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C23H26NO8 [M+H]+: 444.1658. Found: 444.1664; Anal. Calcd for C23H25NO8·1/4H2O: C, 62.30; H, 5.68; N, 3.16. Found: C, 61.72; H, 5.59; N, 3.14.
6-(N3-Benzoylthymine-1-yl)-1-O-(2-benzyloxyethyl)-2-deoxy-2-phthalimino-β-D -glucopyranose (23)
22 (603 mg, 1.36 mmol)、N3-benzoylthymine (315 mg, 1.36 mmol)、PPh3 (716 mg,
2.72 mmol) の混合物をデシケーターで一晩乾燥後、THF (20 mL) に溶解し、
DEAD (1.27 mL, 2.72 mmol) を加え室温で48時間攪拌した。反応終了後、MeOH
(20 mL) を加え反応を終結させ、溶媒を減圧留去した。残渣を中性シリカゲル
カラムクロマトグラフィー (ヘキサン : 酢酸エチル = 1 : 2) で分離精製し、
無色固体23 (751 mg, 84%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.94 (d, J = 7.8 Hz), 7.84–7.82 (m, 2H), 7.72–7.66 (m,
3H), 7.56–7.52 (m, 2H), 7.29–7.21 (m, 4H), 7.16–7.13 (m, 2H), 5.36 (d, J = 8.8 Hz), 4.52–4.47 (m, 1H), 4.46–4.40 (m, 1H), 4.31 (d, J = 3.9 Hz), 4.22–4.17 (m, 1H), 3.94–3.91 (m, 1H), 3.77–3.67 (m, 3H), 3.54–3.49 (m, 2H), 3.28–3.22 (m, 1H), 1.95 ppm (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 168.4, 168.2, 162.7, 151.6, 141.5, 137.9, 135.2, 134.0, 131.7, 131.3, 130.4, 129.3, 128.3, 127.5, 127.4, 123.4, 111.3, 98.8, 74.2, 73.0, 71.9, 70.2, 69.0, 68.8, 55.9, 48.5, 12.4 ppm; MS (DRAT) m/z 656 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C35H34N3O10 [M+H]+: 656.2244. Found: 656.2244.
2-Amino-1-O-(2-benzyloxyethyl)-2-deoxy-6-(thymine-1-yl)-β-D-glucopyranose (24)
23 (54 mg, 82 μmol) をデシケーターで一晩乾燥後、EtOH (5 mL) に溶解し、
エチレンジアミン (335 μL, 4.94 mmol) を加えアルゴン雰囲気下90 °Cで2時 間還流した。反応終了後、反応温度を室温まで戻し、溶媒を減圧留去した。残 渣を中性シリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム : メタノール
= 4 : 1) で分離精製し、無色固体24 (30 mg, 87%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.32–7.26 (m, 5H), 7.05 (s, 1H), 4.53 (s, 2H), 4.27 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.19–4.16 (m, 1H), 3.89–3.85 (m, 1H), 3.76–3.65 (m, 2H), 3.62–3.60 (m, 2H), 3.50–3.43 (m, 2H), 3.22–3.17 (m, 1H), 2.72–2.67 (m, 1H), 1.79 ppm (s, 3H);
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 164.4, 151.9, 141.9, 137.7, 128.2, 127.5, 110.0, 103.5, 76.5, 75.2, 74.1, 72.9, 71.2, 68.8, 68.7, 56.7, 48.6, 11.9 ppm; MS (DRAT) m/z 422 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C20H28N3O7 [M+H]+: 422.1927. Found: 422.1955;
Anal. Calcd for C20H27N3O7·H2O: C, 54.66; H, 6.65; N, 9.56. Found: C, 54.37; H, 54.37; N, 9.50.
1-O-(2-Benzyloxyethyl)-2-deoxy-6-(thymine-1-yl)-2-trifluoroacetyl- amino-β-D-glucopyranose (25)
24 (273 mg) を化合物16の合成方法と同様に合成を行い、中性シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー (酢酸エチル) で分離精製し、無色固体25 (300 mg, 90%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.39 (s, 1H), 7.35–7.26 (m, 5H), 4.53–4.50 (m, 3H), 4.49–4.45 (m, 1H), 3.85–3.79 (m, 1H), 3.76–3.72 (m, 1H), 3.68–3.61 (m, 2H), 3.60–3.57 (m, 2H), 3.55–3.52 (m, 1H), 3.50–3.47 (m, 1H), 3.25–3.20 (m, 2H), 1.82 ppm (s, 3H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 166.9, 159.4 (q, J = 35.7 Hz), 153.0, 144.76, 139.6, 129.4, 128.8, 128.6, 117.6 (q, J = 285 Hz), 110.2, 101.9, 75.2, 74.8, 74.1, 73.9, 70.4, 69.9, 57.7, 50.3, 12.1 ppm. MS (DRAT) m/z 518 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C22H26F3N3O8 [M+H]+: 518.1750. Found: 518.1734; Anal. Calcd for C22H26F3N3O8·2/3H2O: C, 49.91; H, 5.20; N, 7.94. Found: C, 49.82; H, 5.09; N, 7.87.
2-Deoxy-1-O-(2-hydroxyethyl)-6-(thymine-1-yl)-2-trifluoroacetylamino-β-
D-glucopyranose (26)
25 (299 mg) を化合物17の合成方法と同様に合成を行い、中性シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー (ヘキサン : 酢酸エチル = 2 : 1) で分離精製し、無色 固体27 (247 mg, quant.) を得た。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.22 (s, 1H), 9.20 (d, J= 9.20 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 5.40 (d, J = 5.60 Hz, 1H), 5.30 (d, J= 6.00 Hz, 1H), 4.48–4.46 (m, 1H), 4.39–4.36 (m, 2H), 3.55–3.49 (m, 2H), 3.44–3.27 (m, 3H), 3.06-2.99 (m, 1H), 1.73 ppm (s, 3H). MS (DRAT) m/z 428 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C15H21F3N3O8
[M+H]+: 428.1281. Found: 428.1232; Anal. Calcd for C15H20F3N3O8·1/2H2O: C, 41.29; H, 4.85; N, 9.63. Found: C, 41.44; H, 4.69; N, 9.48.
2-Deoxy-1-O-[2-(4,4'-dimethoxytrityloxy)ethyl]-6-(thymine-1-yl)- 2-trifluoroacetylaminoβ-D-glucopyranose (27)
26 (740 mg) を化合物18の合成方法と同様に合成を行い、中性シリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー (数滴ピリジンを有する酢酸エチル) で分離精製し、無 色固体27 (994 mg, 79%) を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 7.43–7.39 (m, 3H), 7.29–7.18 (m, 7H), 6.85 (d, 4H, J = 8.80 Hz), 4.49 (d, 1H, J = 8.00 Hz), 4.48–4.44 (m, 1H), 3.77 (s, 6H), 3.75–3.64 (m, 3H), 3.62–3.59 (m, 2H), 3.57–3.51 (m, 3H), 3.30–3.22 (m, 1H), 1.87 ppm (s, 3H). MS (DRAT) m/z 730 [M+H]+, HRMS (DART) Calcd for C36H39F3N3O10 [M+H]+: 730.25875. Found: 730.26187; Anal. Calcd for C36H38F3N3O10: C, 59.26; H, 5.25; N, 5.76. Found: C, 58.88; H, 5.21; N, 6.16.
Solid support (28)
27 (399 mg) をCPG樹脂固層担体20の合成方法と同様に合成を行い、CPG樹脂
固層担体28 (1.29 g) を得た。その活性は36.7 μmol/gであった。
オリゴヌクレオチドの合成と粗精製
DNA/RNA自動合成機 (Applied Biosystem Model 3400) を用い、ホスホロア ミダイト固相合成法に従い、1 μmolスケールで合成を行った。ホスホロアミダ
イトrA、rU、rG、rC、dTおよびは5'-末端蛍光ホスホロアミダイト5'-Fをそれ
ぞれ0.1 Mになるように MeCN に溶解し、RNA protocolの常法に従い合成し
た。オリゴヌクレオチドの 5末端は DMTr 基を除去した状態で合成を終了し た。
合成終了後、ArガスでCPG樹脂を十分乾燥させた。CPG樹脂体を蓋付きの エッペンドルフチューブに移し、NH4OH : EtOH = 3 : 1 (v/v) 水溶液(1.2 mL) を 加え、室温で12時間振とうさせ、樹脂からの切り出しおよび脱保護を行った。
上清をエッペンドルフチューブに移した後、H2O : EtOH = 3 : 1 (v/v) 水溶液(1.2 mL) でCPG樹脂を洗浄し、同様に上清をエッペンドルフチューブに移すこと を2回繰り返した。スピードバックにて一晩乾固させた。残渣に1 M TBAF/THF 溶液 (1 mL) を加え、室温で12時間振とうさせ、シリル基の脱保護を行なっ た。反応溶液を0.1 M TEAA buffera (30 mL) に希釈し、逆相カラムクロマトグ ラフィー (Sep-Pak C18) に通し、オリゴヌクレオチドをカラムに吸着させ、滅 菌水 (10 mL) で洗浄するにより脱塩した。また、50 % MeCN (1 mL × 3) で オリゴヌクレオチドをエッペンドルフチューブに洗い出し、スピードバックに て乾固した。残渣にloading solution (90% formamide in 1×TBE) 200 μLを加え、
20％ PAGEb 電気泳動によりオリゴヌクレオチドの粗精製を行い、目的オリゴ
ヌクレオチドのバンドを切り出し、溶出液c (20 mL) に浸し、一晩振とうした。
この濾液をSep-Pak C18により脱塩させ、スピードバックにて乾固した。
a. 0.1 M TEAA buffer: AcOH (114.38 mL) にTEA (277.6 mL) を加え、Milli Qで 1 Lにし、pH 7.0に調整し、2 M TEAA bufferを調製した。これを滅菌水にて 20倍希釈した。
b.40%アクリルアミド (19：1) 溶液d (40 mL) 、尿素 (33.6 g) 、10× TBE buffere 8 mLを混合し、Milli Qを加え、80 mLにした。最後にAPS (55 mg) を加え 溶かし、TEMED (40 μL) を加え、振り混ぜた後、速やかに1.5 mmスペーサ ーを挟んで固定した2枚のガラス板の間に流し込み、固化するまで静置した。
1×TBE bufferを泳動用緩衝液として用いた。
c. 溶出液: 2 M TEAA buffer (1 mL) 、0.1 M EDTA水溶液f (0.2 mL) を滅菌水に
て20 mLにし、調整した。
d.40%アクリルアミド (19 : 1) 溶液: アクリルアミド (190 g)、N,N-ビスアク リルアミド (10 g) をMilli Q にて溶解させ、500 mLとした。
e. 10× TBE buffer: Tris(hydroxymethyl)aminomethane (108 g)、ホウ酸 (55 g)、
EDTA-4Na (7.43 g) を水に溶解させ、1 Lにし、調製した。1 × TBE bufferは
10 × TBE bufferを水にて10倍希釈し、調製した。
f. 0.1 M EDTA水溶液: EDTA-4Na (1.81 g) を滅菌水で40 mLにし、調製した。
オリゴヌクレオチドの定量と構造確認
オリゴヌクレオチドを滅菌水 (1 mL) に溶かし、260 nmにおける吸光度を測 定し、その収量を求めたa。また、30 pmolを乾固し、3 μLの滅菌水に溶解さ
せ、3 μLのマトリックス溶液 b を加え、よく混和させた後、プレートにサン
プルをアプライした。サンプルが乾固した後、MALDI-TOF/MS で分子量の確 認を行った。
a. オリゴヌクレオチドは水溶液とし、波長260 nmでの吸光度(Abs260) が，吸 光度計の有効範囲になるように希釈した。光路長(l) 1 cmの吸光度測定用石 英セルを用い、室温にて Abs260を測定した。OD260値の計算には次式を用い た。ここでVは溶液の全量を示す。
OD260 (Mε-1・mL-1・cm-1)=Abs260 (Mε-1) ・ V-1 (mL) ・ l-1 （cm）
また、N1pN2pN3p･･･Nn-1pNn で表される一本鎖オリゴヌクレオチドのモル 吸光係数 ε260 の算出には、次式を用いた。
ε260= 2 {ε (N1pN2) +ε (N2pN3) + ･･･ +ε (Nn-1pNn) } – {ε (N2) +ε (N3) + ･･･ +ε (Nn-1)}
ここで、ε (Nn) はある核酸 Nnの ε260を示し、ε (Nn-1pNn) はある核酸二量体 Nn-1pNn のε260を示す。
また、濃度C (mol/L) の算出には、次式を用いた。
C = Abs260 ・ ε260-1 ･ l-1
b. マ ト リ ッ ク ス 溶 液: 3-hydroxypicolinic acid (4.85 mg) と di-Ammonium hydrogen citrate (0.8 mg) を50 % MeCN in Milli Q (50 μL) に溶解させ調整し た。なお、di-Ammonium hydrogen citrate は、Na+ やK+ が付着するのを阻害
するために加えている。
HPLCによるオリゴヌクレオチドの再精製
各サンプル最大5 OD260分を、HPLC (測定波長: 260 nm、流速: 1.0 mL / min、
C18逆相カラム) により粗精製したオリゴヌクレオチドの再精製を行った。
bufferは以下の通り、カラムはC-18を用いた。
A buffer : 5% MeCN in 0.1M TEAA (pH 7.0) B buffer : 50% MeCN in 0.1M TEAA (pH 7.0)
熱変性法による50%融解温度 (Tm) の測定
オリゴヌクレオチドの 50%融解温度 (Tm) 測定におけるそれぞれの鎖の濃 度は3 μMになるように調整し、測定用緩衝液 (10 mM NaH2PO4
-, Na2HPO4, 100 mM NaCl (pH7.0)) 200 μLに溶解し、100 ºCで5分間アニーリングを行なった後、
1 時間常温に放置した。そのサンプルのうち 150 μLを専用八連セルに入れ、
20 ºCから100 ºCへと加熱 ( 0.5 °C/min) し、吸光度の変化を測定し、中線法 で50%融解温度(Tm) を求めた。
Dual-luciferase reporter assay
HeLa細胞を4000 cell/mLになるように調整し、96 well plateの各wellに100 μLずつ入れ、24時間培養した。合成したsiRNAのセンス鎖およびアンチセン ス鎖をTE buffer (100 mM NaCl) に溶解し、アニーリングを行なった。siRNA 各量、培地(OPTI-MEM) 各量、0.1 μg/μL psi-CHECK (Firefly, Renilla 各々の sequenceを持つベクター) 1 μL、transfast (transfection試薬) 1.5 μLを総量175 μL になるように混合し、培地を吸出し、96 well plateの各wellに 35 μLずつ入れ、
1時間後、培地を100 μL加えて24時間培養した。24時間後、培地を吸出し、
一晩－80 ˚Cで冷凍保存した。解凍後、Dual glo substrate (Firefly基質) 24 μLを
加え、10分間放置後、サンプル24 μLを発光測定用の96 well plateに移し、Firefly luciferaseを測定した。その後、Stop and glo substrate (Renilla 基質) 24 μLを加 え10分放置後、Renilla luciferaseを測定した。Renilla luciferaseの値をFirefly luciferaseの値で割り、% of controlを用いて比較した。なお、luciferase測定に は、Luminescenser JNRを使用した。
SVPD (snake venome phosphodiesterase) を用いたヌクレアーゼ耐性評価
5′-末端をフルオレセインで蛍光標識したsiRNAアンチセンス鎖300 pmolを
緩衝液 (250 mM Tris-HCl, 50 mM MgCl2 (pH 8.0))で希釈したSVPD 10 unit/mL (100 μL) に溶解し、37 ºCでインキュベートした。1 min、3 min、5 min、10 min、
15 min、30 min、1 h後に、予め別のエッペンドルフチューブに分注しておいた
反応停止液 (色素マーカー : 7M 尿素含有) 15 μL中に、反応液を5 μLずつ加
え、100 ºCで5分間インキュベートし、反応を停止させた。なお、0 minのサ
ンプルはSVPD を加えていないものとした。この反応溶液を 20% PAGEにて 分離した後、ルミノ・イメージアナライザー LAS4000により分析した。
共焦点レーザースキャン顕微鏡を用いた細胞膜透過性評価
エッペンに乾固させた各二本鎖 RNA (100 pmol) を OPTI-MEM (80 μL) (Invitrogen) に溶解させ、別のエッペンに用意した0.1 μg/μLのTransFast溶液 3
μL in 20 μL OPTI-MEM と混合させ、10分間静置させた。この溶液の全量をウ
ェルに加えた。1 時間インキュベート後、血清入り培養培地 (10%BS 入り D-MEM (WAKO) 、以下培地と略す) を500 μL /well 加えた。4時間後、各ウ ェルの培地を吸引し、新しい培地で3回ウェルを洗浄し培地交換を行った。そ の後 1 mM DMSO 溶液から 20 nM に培地を用いて希釈した MitoTraker Red
CMXRos (invitrogen製品) 溶液を各ウェルに加え、5分インキュベート後、培
地500 μLを各ウェルに追加した。その後岐阜大学生命科学総合研究支援セン
ター内の共焦点レーザースキャン顕微鏡（LSM710; Carl Zeiss社製）にて付属 の培養装置を用いながら細胞観察を行った。
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