○SSM, ent-SSM, threo-SSM 1) SSM (2.0 mg, 2.73 µmol) 2) ent-SSM (2.0 mg, 2.73 µmol) 3) threo-SSM (2.0 mg, 2.73 µmol)
○SSM, ent-SSM
1) SSM(1.5 mg, 2.05 µmol), ent-SSM(0.5 mg, 0.68 µmol) 2) SSM(1.3 mg, 1.82 µmol), ent-SSM(0.7 mg, 0.91 µmol) 3) SSM(1.0 mg, 1.37 µmol), ent-SSM(1.0 mg, 1.37 µmol) 4) SSM(0.7 mg, 0.91 µmol), ent-SSM(1.3 mg, 1.82 µmol) 5) SSM(0.5 mg, 0.68 µmol), ent-SSM(1.5 mg, 2.05 µmol)
○D/L-DPPC
1) D-DPPC(2.0 mg, 2.72 µmol)
2) D-DPPC(2.0 mg, 2.04 µmol), L-DPPC(2.0 mg, 0.67 µmol) 3) D-DPPC(2.0 mg, 1.81 µmol), L-DPPC(2.0 mg, 0.90 µmol) 4) D-DPPC(1.0 mg, 1.36 µmol), L-DPPC(1.0 mg, 1.36 µmol) 5) D-DPPC(2.0 mg, 0.90 µmol), L-DPPC(2.0 mg, 1.81 µmol) 6) D-DPPC(2.0 mg, 0.67 µmol), L-DPPC(2.0 mg, 2.04 µmol) 7) L-DPPC(2.0 mg, 2.72 µmol)
○PSM/SSM, PSM/ent-SSM 1) PSM(1.9mg, 2.73 µmol)
2) PSM(1.4 mg, 2.05 µmol), SSM(0.5 mg, 0.68 µmol) 3) PSM(1.3 mg, 1.82 µmol), SSM(0.7 mg, 0.91 µmol) 4) PSM(1.0 mg, 1.36 µmol), SSM(1.0 mg, 1.37 µmol) 5) PSM(0.6 mg, 0.91 µmol), SSM(1.3 mg, 1.82 µmol) 6) PSM(0.5 mg, 0.68 µmol), SSM(1.5 mg, 2.05 µmol) 7) PSM(1.4 mg, 2.05 µmol), ent-SSM(0.5 mg, 0.68 µmol) 8) PSM(1.3 mg, 1.82 µmol), ent-SSM(0.7 mg, 0.91 µmol) 9) PSM(1.0 mg, 1.36 µmol), ent-SSM(1.0 mg, 1.37 µmol) 10) PSM(0.6 mg, 0.91 µmol), ent-SSM(1.3 mg, 1.82 µmol) 11) PSM(0.5 mg, 0.68 µmol), ent-SSM(1.5 mg, 2.05 µmol)
106
○L-PSPC/L-DPPC, L-PSPC/D-DPPC 1) L-PSPC(2.0 mg, 2.62 µmol)
2) L-PSPC(1.5 mg, 1.97 µmol), L-DPPC(0.5 mg, 0.65 µmol) 3) L-PSPC(1.3 mg, 1.75 µmol), L-DPPC(0.6 mg, 0.87 µmol) 4) L-PSPC(1.0 mg, 1.31 µmol), L-DPPC(1.0 mg, 1.31 µmol) 5) L-PSPC(0.7 mg, 0.87 µmol), L-DPPC(1.3 mg, 1.75 µmol) 6) L-PSPC(0.5 mg, 0.65 µmol), L-DPPC(1.4 mg, 1.97 µmol) 7) L-PSPC(1.5 mg, 1.97 µmol), D-DPPC(0.5 mg, 0.65 µmol) 8) L-PSPC(1.3 mg, 1.75 µmol), D-DPPC(0.6 mg, 0.87 µmol) 9) L-PSPC(1.0 mg, 1.31 µmol), D-DPPC(1.0 mg, 1.31 µmol) 10) L-PSPC(0.7 mg, 0.87 µmol), D-DPPC(1.3 mg, 1.75 µmol) 11) L-PSPC(0.5 mg, 0.65 µmol), D-DPPC(1.4 mg, 1.97 µmol) サンプル調製法と測定条件
最初に目的脂質をそれぞれクロロホルム/メタノール4:1溶液に溶かして1
mg/mL溶液を調製した。バイアルに、上記に示す量でそれぞれの溶液をと
り、溶媒を減圧留去した。真空条件下で12時間以上乾燥させた後、milliQ水
500 µLを加えて5分間55℃で加熱、ボルテックスで振動させて水和した。エ
ッペンドルフチューブに移し、遠心分離器を用いて減圧下で10分間脱気した 後、500 µLの試料をセルに加え、温度変化速度を0.5℃/分として測定を行っ た。
II. 重水素固体NMR
○10’,10’ -d2-SSM
1) d2-SSM(5.0 mg, 6.84 µmol), SSM(10.0 mg, 13.7 µmol)
2) d2-SSM(5.1 mg, 6.96 µmol), SSM(10.5 mg, 14.3 µmol), Cho(8.0 mg, 21.0 µmol)
3) d2-SSM(5.0 mg, 6.84 µmol), SSM(2.7 mg, 3.7 µmol), ent-SSM(7.7 mg, 10.5 µmol), Cho(8.01 mg, 21.0 µmol)
4) d2-SSM(5.0mg, 6.84 µmol), SSM(10.4 mg, 14.3 µmol), CME(8.41 mg, 21.0 µmol)
○10’,10’ -d2-ent- SSM
1) d2-ent-SSM(5.0 mg, 6.84 µmol), ent-SSM(10.4 mg, 14.3 µmol)
2) d2-ent-SSM(5.2 mg, 7.09 µmol), ent-SSM(10.0 mg, 13.7 µmol), Cho(8.05
107
mg, 20.8 µmol)
3) d2-ent-SSM(5.1 mg, 6.96 µmol), SSM(7.7 mg, 10.5 µmol), ent-SSM(2.7 mg, 3.7 µmol), Cho(8.01 mg, 21.0 µmol)
4) d2-ent-SSM(5.0 mg, 6.84 µmol), ent-SSM(10.4 mg, 14.3 µmol), CME(8.42 mg, 21.1 µmol)
○10’,10’ -d2-threo- SSM
1) d2-threo-SSM(5.1 mg, 6.96 µmol), threo-SSM(10.2 mg, 14.0 µmol)
2) d2-threo-SSM(5.0 mg, 6.84 µmol), threo -SSM(10.4 mg, 14.3 µmol), Cho(8.01 mg, 21.0 µmol)
○10’,10’ -d2- PSPC
1) d2- PSPC(5.0 mg, 6.84 µmol), PSPC(10.8 mg, 14.2 µmol), Cho(8.01 mg, 21.0 µmol)
2) d2-PSPC(5.1 mg, 6.69 µmol), PSPC(10.8 mg, 14.1 µmol), CME(8.42 mg, 21.1 µmol)
サンプル調製方法
適量の脂質をクロロホルム/メタノール(1/1)に溶かし、50 mg/mL 溶液を調製 した。脂質フィルムを均一な状態になるまで、溶媒を留去およびクロロホルム/
メタノール溶液に溶かす作業を繰り返した。均一な脂質フィルムにした後、12 時間以上真空中乾燥させた。次にmillQ水(脂質重量の約30倍量)を加え、55℃
に加熱して試験管ミキサーおよび超音波振動器で激しく撹拌し、脂質フィルム を水和させた。さらに凍結融解を 10 回繰り返した後、12 時間以上凍結乾燥し た。得られた残渣物にdeuterium depleted water(脂質重量と等量)を加え、試験 管ミキサーで激しく撹拌しつつ、凍結融解を繰り返した。最後に脂質水和物が均 一になったことを確認し、NMR管(5 mm×10 mm)に移し、接着剤で閉じた。
測定条件
90˚ pulse width : 2 µs,
interpulse delay τ1 : 30 µs, τ2 : 20 µs repetition rate : 0.5 s
スペクトルの観測幅は250 kHzで、積算回数は～150000とした。ポイント数は 8192とした。
108
III. 蛍光寿命測定
1) SSM(90 nmol), POPC(180 nmol), Cho(30 nmol) 2) ent-SSM(90 nmol), POPC(180 nmol), Cho(30 nmol) 3) threo-SSM(90 nmol), POPC(180 nmol), Cho(30 nmol)
4) SSM(30 nmol), ent-SSM(45 nmol), POPC(180 nmol), Cho(30 nmol)
サンプル調製方法
使用するSSM, ent-SSM, threo-SSMはメタノールに、Choはヘキサン/2-プロ パノール (3:2 v/v)に溶解させた。濃度を酢酸マグネシムを用いたリン酸定量に よって決定した脂質のメタノール溶液 (合計300 nmol) とtPAのメタノール溶 液 (3.0 nmol)を試験管に加えて、N2フローで溶媒を留去した。Ar置換したmillQ 水 (2000 µL) を加え、超音波振動器で激しく撹拌した (75 °C、5 min)。そして サンプルが室温に戻った後、測定を行った。
測定条件
励起波長：298 nm 蛍光波長：405 nm 温度範囲：20～45 °C 測定時間：10～25 min
測定は3 回行い、蛍光寿命および fractional amplitude は平均値をとった。装 置Fluo Time 200のオベレーションおよびデータ解析はFluoFit Pro softwareで行 った。
109
IV. 蛍光顕微鏡
○顕微鏡観察
1) SSM (30 µL, 41.1 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.6 nmol), 488SSM 0.2 mol%, Texas-red DHPE 0.2 mol%
2) ent-SSM (30 µL, 41.1 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.6 nmol), 594ent-SSM 0.2 mol%, BODIPY-PC 0.2 mol%
3) SSM (15 µL, 20.6 nmol), ent-SSM (15 µL, 20.6 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.6 nmol), 488SSM 0.2 mol%, 594ent-SSM 0.2 mol%
○分配比算出
1) SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594SSM 0.002 mol%
2) SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594 ent-SSM 0.002 mol%
3) SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 488SSM 0.002 mol%
4) SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 488ent-SSM 0.002 mol%
5) ent-SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594ent-SSM 0.002 mol%
6) ent-SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594SSM 0.002 mol%
7) ent-SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 488ent-SSM 0.002 mol%
8) ent-SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594SSM 0.002 mol%
9) SSM (15 µL, 20.6 nmol), ent-SSM (15 µL, 20.6 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594SSM 0.002 mol%
10) SSM (15 µL, 20.6 nmol), ent-SSM (15 µL, 20.6 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594ent-SSM 0.002 mol%
11) SSM (15 µL, 20.6 nmol), ent-SSM (15 µL, 20.6 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 488SSM 0.002 mol%
12) SSM (15 µL, 20.6 nmol), ent-SSM (15 µL, 20.6 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 488ent-SSM 0.002 mol%
110
○FCS
1) SSM (15 µL, 20.6 nmol), ent-SSM (15 µL, 20.6 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594SSM 0.002 mol%
2) SSM (15 µL, 20.6 nmol), ent-SSM (15 µL, 20.6 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594ent-SSM 0.002 mol%
3) SSM (30 µL, 41.2 nmol), DOPC (32 µL, 38.1 nmol), Cho(8 µL, 20.7 nmol), 594SSM 0.002 mol%
サンプル調製法
まず使用する脂質と蛍光標識脂質をそれぞれクロロホルム/メタノール 4:1 溶液 に溶かして1 mg/mL溶液を調製した。バイアルに、モル比が以下の比率となる ように溶液を加えた。2本の白金線をスライドガラスの上にテープで止めて、そ の白金線の上に脂質の混合溶液を 10 µL 乗せ、5 分ほど室温で乾燥させたのち 真空条件下で12時間以上乾燥させた。白金線の周りをゴムで囲った後、脱イオ
ン交換水500 µLを加えて上からさらにスライドガラスを被せた(図1)。55 ℃で
加熱しながら白金線を通して10 Hz、10 Vppのパルスを60分間かけて単層膜 を形成、室温で30分放置して測定を開始した。
測定条件
励起波長：473 nm、559 nm
蛍光波長：485~545 nm、600~700 nm 測定時間：5～15 min
レンズ : LUCPLFLN 60 ×, Olympus Corp., Tokyo, Japan FCS : UPLSAPO 60×W, Olympus Corp., Tokyo, Japan
なお、測定後のサンプルについて質量分析によりDOPCの酸化がないことを確 認
図1 サンプルの図
111
V. FRET観測
○SSM, ent-SSM
1) F: SSM (500 nmol) 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (250 nmol), ent-SSM (250 nmol), 488SSM 0.1 mol%
2) F: SSM (250 nmol), ent-SSM (250 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (250 nmol), ent-SSM (250 nmol), 488SSM 0.1 mol%
3) F: SSM (300 nmol), Cho(300 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (300 nmol), Cho(300 nmol), 488SSM 0.1 mol%
4) F: SSM (150 nmol), ent-SSM (150 nmol), Cho(300 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: SSM(150 nmol), ent-SSM(150nmol), Cho(300nmol), 488SSM 0.1 mol%
○DOPC/Cho
1) F: DOPC (400 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: DOPC (400 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
○SSM/DOPC/Cho
1) F: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
2) F: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
3) F: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%
4) F: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%
○ent-SSM/DOPC/Cho
112
1) F: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
2) F: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
3) F: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
4) F: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: ent-SSM (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%
○SSM/ent-SSM/DOPC/Cho
1) F: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
2) F: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
3) F: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594 ent-SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%
4) F: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(200 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(200 nmol), 488SSM 0.1 mol%
5) F: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(200 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
113
Fo: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(200 nmol), 488SSM 0.1 mol%
6) F: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(200 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: SSM (100 nmol), ent-SSM (100 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(200 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%
○DSPC/DOPC/Cho
1) F: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
2) F: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488SSM 0.1 mol%
3) F: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594SSM 1.0 mol%
Fo: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%
4) F: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%, 594ent-SSM 1.0 mol%
Fo: DSPC (200 nmol), DOPC (200 nmol), Cho(100 nmol), 488ent-SSM 0.1 mol%
サンプル調製方法
使用するリン脂質と蛍光標識化脂質はメタノールに、Choはクロロホルム/メタ ノール 4:1 溶液に溶解させ、濃度 1～2mM の溶液を調製した。必要な量(全体
500 nmol)を試験管に加えて、N2フローで溶媒を留去した。Ar置換した millQ
水 (2000 µL) を加え、水和した(70 °C、15 min)後、50 °Cの遮光環境下で激し く撹拌した (15 min)。その後、凍結融解を10回繰り返した後、室温に戻したサ ンプルを用いて測定を行った。
測定条件
励起波長：480 nm 蛍光波長：530 nm
114
DSC サーモグラム
115
・SSM, ent-SSM, racemic SSM, threo-SSMの3回測定データ
○(a)SSM, (b)ent-SSM, (c)threo-SSMのサーモグラム、上段初回、中段二回目、下段三回目
116
○SSM/ent-SSMの3回測定データ。3回目のscanにより取得したデータを示す。
117
○ent-SSM/PSM(a)50:50, (b)66:33, (c)75:25の3回測定のサーモグラム, 上段初回、中段二 回目、下段三回目
118
2
H-NMR スペクトルデータ
119
表．各標識体を用いて得られた分裂幅(kHz)
120
・SSM, ent-SSM, racemic SSM, threo-SSM 50℃
121
・SSM/Cho (1:1) 10’10’-d2-SSM
122
・ent-SSM/Cho (1:1) 10’10’-d2-ent-SSM
123
・threo-SSM/Cho (1:1) 10’10’-d2-threo-SSM
124
・SSM/ent-SSM/Cho (1:1:2) 10’10’-d2-SSM
125
・SSM/ent-SSM/Cho (1:1:2) 10’10’-d2-ent-SSM
126
・SSM/CME (1:1) 10’10’-d2-SSM
127
・ent-SSM/CME (1:1) 10’10’-d2-ent-SSM
128
・PSPC/Cho (1:1) 10’10’-d2-PSPC
129
・PSPC/CME (1:1) 10’10’-d2-PSPC
130
・SSM/POPC/Cho(30:60:10) 10’10’-d2-SSM
131
蛍光寿命測定データ
132
SSM/POPC/Cho、ent-SSM/POPC/Cho、threo-SSM/POPC/Cho、SSM/ent-SSM/POPC/Cho 膜におけるtPAの蛍光寿命
τAVEは平均寿命時間、τ1~3は寿命時間、α1~3はそれぞれの寿命成分の割合を示す。
133
蛍光観測データ
134
・分配比(ILo/ILd) 25℃
・FRET観測による得られる温度(℃)とF/Foデータ SSM
SSM/ent-SSM
135 SSM/Cho
SSM/ent-SSM/Cho
DOPC/Cho
136 DSPC/DOPC/Cho
137 SSM/ent-SSM/DOPC/Cho