第 一 節 緒 言
ド キソ ル ビ シ ン (DOX) は 白 血 病， リ ン パ 腫 ， 乳が ん や 肉 腫を 含 む 悪 性 腫瘍 に対 して 幅 広い 抗 腫瘍 スペ ク トル を有 す るア ント ラサ イ クリ ン 系抗 がん 剤 であ
る111-113)．DOXの 抗腫 瘍 効果 は，DNAの塩 基 対間 に挿 入 され るこ と によ るDNA
複 製 阻 害 や ，DNA や 染 色 体 の 立 体 構 造 制 御 に 必 要 不 可 欠 な ト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ II を阻 害す るこ と によ って 惹 起さ れる 114)．また ，DOX は心 臓 や肝 臓な ど にお いて CYP発 現 量を mRNA や タン パク レ ベル で変 動さ せ るこ とが 知 られ て いる 医薬 品の １ つで ある 17, 115)．
DOXは 5-FUと は対 照 的に ，臨床 にお い てフ ェニ トイ ン の血 中濃 度 を 低 下 さ せる た め代 謝 クリ ア ラン スを 増 加さ せ ると の 見解 が 示さ れ てい る 14)． しか し，
ワル ファ リ ンと の薬 物 相互 作 用は 引き 起 こさ ない とす る 報告 116)や CYP2C の 基質 であ る ロサ ルタ ン の代 謝 物排 泄率 に 低下 が認 めら れ たた め CYP2C 活 性を 低下 させ る との 見解 も 示さ れ てお り 117)，DOX が CYP2C を 介 した 薬物 動 態学 的相 互作 用 を引 き 起こ すか 否 かに つい て 相反 する 情報 が 交錯 し てい る． そ の一 方 で ， ラ ッ ト を 用 い た 基 礎 研 究 で は ，DOX 単 回 投 与 24 時 間 後 に お い て 肝 CYP2C11 の mRNA お よび タ ンパ ク 発現 量 が低 下す る と報 告さ れ てい る が 17)， CYP2C6 につ いて の 報告 はな い ．ま た，第二 章で 得ら れ た知 見の よ うに ，CYP タン パク 発 現量 の 変動 がそ の 代謝 活性 や 併用 薬の 体内 動 態変 動 と必 ずし も 一致 しな いこ と か ら 118)，CYP2C11 発 現 量の 変動 が CYP2C 基質 薬物 の 体内 動態 を 変動 させ る か否 かに つ いて も 不明 であ る ．
TBは ， 代表 的 な SU 薬で あ り II 型糖 尿 病の 治療 薬で あ る． 過去 の 酵素 反 応 速度 論的 研 究か ら，TB は ヒト と同 様 にラ ッ トに おい て もほ ぼ全 てが4-OH-TB に代 謝さ れ ，CYP2C6/11 の典 型 的な 基質 薬 物と して 取 り扱 われ て いる 46-50)． 本章 では ，DOX による CYP2Cを 介し た 薬物 動態 学的 相 互作 用の 有 無を 明 らか とす るこ と を目 的と し，DOX投 与 後の ラ ット 肝CYP2C6/11発 現 量の 変動 がTB
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代謝 能に 反 映す るか 否 かを DOX 投 与ラ ッ ト の肝 ミク ロ ソー ムに お ける TB 4-水酸 化活 性 を酵 素反 応 速度 論 的に 解析 す るこ とで 検討 し た ．さ らに ，こ れら in vitroの酵 素活 性 変動 がin vivoのTB体内 動 態変 動と 連 動す るか 否 か 検 証 した．
45 第 二 節 実験材 料 および 方 法
3-2-1. 薬 物 およ び試 薬
DOX はMeiji Seika ファ ル マよ り購 入 した ．TB およ び クロ ル プロ パミ ド は 富士 フィ ル ム和 光純 薬 より 購 入し た ．4-OH-TB は Tronto Research Chemicals より 購入 し た．そ の 他の 試 薬類 およ び 溶媒 類 は特 級ま たは HPLC 用の もの を 使 用し た．
3-2-2. 実 験 動物
7 週齢 Sprague-Dawley 系 雄 性ラ ット は 日本 エス エル シ ーよ り購 入 し， 第 一 章 第二節 1-2-2. と 同 様に 取り 扱 った．な お ，DOXは 生理 食 塩水 に溶 解 し，15 mg/kg の用 量 でラ ッ トに 腹腔 内 投与 し た．DOX の投 与 量お よび 投 与経 路 は以 前の 報告 を 参考 に設 定 し 17)， 容 量は 1.5 mL/kgに 設定 した ．DOX 投 与 1 日 後 (Day 1) また は 4 日後 (Day 4) に 肝 ミク ロ ソー ム試 料 およ び血 清 試料 を 得た．
動物 実験 計 画は ，大 阪 大谷 大 学動 物実 験 委員 会の 審査 を 受け て承 認 され た ．
3-2-3. ラ ッ ト肝 ミク ロ ソー ム試 料 の調 製
第一 章 第二 節 1-2-8. と同 様の 操 作を 行い ， ミク ロソ ー ム試 料を 調 製し た ．
3-2-4. CYP2C 分 子 種の タン パ ク発 現 量の 比 較
第一 章 第二 節 1-2-10. に 従 い実 験 を行 った ．な お，CYP2C11 タ ン パク 発現 量は ，ウ サギ 抗 CYP2C11 ポリ ク ロー ナル 抗 体 (GeneTex) を 用い ，5,000倍希 釈 し た 二次 抗 体 と し て HRP で 標 識 さ れ た 抗 ウ サ ギ IgG ポ リ ク ロー ナ ル 抗 体 (GE Healthcare) を用 い て検 討し た ．
3-2-5. TB 4-水 酸 化活 性の 測 定
第一 章 第二 節 1-2-9. に準 じ て行 った ． なお ，酵 素反 応 速度 試験 で は TB 濃 度を 50 - 1500 µM の 範 囲で ，2 種の 酵 素反 応速 度モ デ ル式 の比 較 検討 では 2.5 - 2000 µM の 範囲 で 検討 した ．
46 3-2-6. 酵 素 反応 パラ メ ータ の算 出
TB 4-水 酸化 反応 の 酵素 反応 速 度論 的解 析 は ，Michaelis-Menten 式に 従う も のと して 行 った ． まず 初め に ，酵 素反 応 パラ メー タを 算 出す る ため に各 デ ータ を以 下の 単 一の Michaelis-Menten 式 (式 1) に 当て はめ た ．
V =Vmax× S
Km+ S (式 1) V，Vmax，S お よ び Kmは ，そ れ ぞれ 反 応速 度， 最大 反 応速 度，TB 濃度 お よ びミ カエ リ ス定 数を 示 す． そ の一 方で ， 雄性 ラッ トに お いて は TB 4-水 酸 化反 応に CYP2C6 お よび CYP2C11 の二 つ の酵 素が 関与 す ると 報告 さ れて い るた め， これ ら 二つ の 酵素 が代 謝 反応 に関 与 する こと を 仮 定 し， 各 デー タを 以 下の 式 (式 2) に 当 ては めた ．
V =Vmax1× S
Km1+ S +Vmax2× S
Km2+ S (式2) なお ，Km1お よ び Km2は そ れぞ れ 低親 和性 お よび 高親 和 性酵 素 のKmを 示し ， Vmax1およ び Vmax2は それ ぞ れ Km1およ び Km2に 対応 す る酵 素 の Vmaxを 示す ． 個々 のパ ラ メー タは ， 非線 形 最小 二乗 法 によ り算 出し た 88)． 本 章で は ，TB 4-水酸 化反 応 特性 を 説明 する た めに ，上 記 いず れの モデ ル 式が 適 切で ある か ，赤 池情 報量 基 準 (Akaike’s information criterion; AIC) を 指標 とし て 決定 した ． すな わち ，AIC 値の より 小 さい モ デル 式を 選 択し ，酵素 反 応パ ラメ ー タの 算出 に 用 い た 119, 120)． な お ， 選 択 し た モ デ ル 式 の 妥 当 性 を 評 価 す る た め ， Eadie-Hofstee プ ロッ ト を作 成 し， 視覚 的 に確 認し た．
3-2-7. TB 投 与 およ び採 血
第一 章 第二 節 1-2-3. に従 った ．な お ，TBの 血清 タン パ ク結 合率 を 測定 す る ため の血 清 試料 は TB投 与 60 分後 に採 血 し て得 た．
3-2-8. 血 清 中 TB 濃 度の 測 定
第一 章 第二 節 1-2-4. に従 い ，HPLC 法 で測 定し た． な お， 血清 タ ンパ ク 非 結合 型 TB 濃 度は ， 得ら れた 血 清の 一部 を 遠 心ろ 過デ バ イス (Nanosep®: 分 画
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分子量 30 kDalton; Pall) に 移 し ，5,000 g，37°C，5分 間の 条 件で 遠 心分 離し ， 得ら れた ろ 液中 の TB濃 度を 測 定す る こと で 得た ．TBの タ ンパ ク非 結 合率 (fu) は， 血清 タ ンパ ク非 結 合 型 TB 濃 度を 血 清 総 TB 濃 度 で除 す るこ とに よ って 算 出し た．
3-2-9. TB 体 内 動態 パラ メ ータ の解 析
第 一 章 第 二 節 1-2-7. に 従 っ た ． な お ， 消 失 半 減 期 (elimination half-life:
t1/2) は，ln2/keよ り算 出し た ．
3-2-10. 血 清ア ル ブミ ン濃 度 の測 定
血 清 ア ル ブ ミ ン 濃 度 は 生 化 学 自 動 分 析 装 置 (SPOTCHEMTM EZ sp-4430;
ARKRAY) を 用い て比 色 定量 法に て 測定 し た ．な お，測 定に 用い た 血清 は，TB 投与 前に 採 取し た血 液 から 得 た．
3-2-11. 統計 学的 解 析
結 果は ， 平 均±SD で 示し た ． な お ，2 群間 の 統計 学 的 比 較 には 対 応 の ない Student’s t-検定 を 行い ，い ず れも p<0.05を 有意 と判 定 した ．
48 第 三 節 結 果
3-3-1. DOX 投与 ラ ット の体 重 およ び肝 重 量
対照 群お よび DOX 投 与群 の 体重 お よび 肝重 量を Table 8 および 9 に示 す．
DOX 投 与 4 日 後 のラ ット 体 重お よび 肝 重量 は， 対照 群 と比 較し て 有意 に 減少 した が， 肝 重量 比は 両 群間 で 有意 な差 異 が認 めら れな か った ．
Table 8 Body and liver weights of the control and DOX-treated rats on Day 1.
Control DOX
Body weight (g) 242 ± 18 242 ± 14
Liver weight (g) 12.4 ± 1.6 11.5 ± 1.2 Liver weight/Body weight (%) 5.12 ± 0.55 4.76 ± 0.58
Body and liver weight were measured before preparation of the microsomal pellet. Results are shown as the mean ± SD of six rats per group.
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225-233.
Table 9 Body and liver weights of the control and DOX-treated rats on Day 4.
Control DOX
Body weight (g) 251 ± 17 200 ± 11**
Liver weight (g) 11.9 ± 2.0 9.1 ± 1.6*
Liver weight/Body weight (%) 4.76 ± 0.52 4.52 ± 0.60 Body and liver weight were measured before preparation of the microsomal pellet. Results are shown as the mean ± SD of six rats per group. *Significantly different from the control group (p<0.05, Student’s unpaired t-test).
**Significantly different from the control group (p<0.01, Student’s unpaired t-test).
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225 -233.
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3-3-2. CYP2C6 お よび CYP2C11発 現量 に 及ぼす DOX の 影 響
CYP2C6お よ びCYP2C11のタ ンパ ク 発現 量 に及 ぼ すDOXの影 響に つ いて ， ウェ スタ ン ブロ ット 法 を用 い て調 べた (Figure 12)．DOX群の CYP2C11 タ ン パク 発現 量 は，Day 1にお いて 有 意に 減少 し ，Day 4にお いて は対 照 群の 約 50%
まで 顕著 な 減少 が認 め られ た ．し かし ，Day 1 および Day 4の いず れ にお いて も ，CYP2C6 の 発 現量 に両 群 間で 有意 な 差異 は認 めら れ なか った ．な お ，いず れに おい て も DOX 群と 対 照群 にお け る PVDF膜 に転 写し た タン パク は 同様 の CBB 染色 像 を示 した ．
Figure 12 Hepatic protein expression of CYP2C6 and CYP2C11 in the control and DOX-treated rats.
Microsomal protein was obtained from rats 1 (Day 1) or 4 (Day 4) days after the administration of DOX or vehicle alone. Following the detection of immunoreactive bands (upper panels of A and B), the PVDF membranes were stained with CBB (lower panels of A and B). Calculated values for visualized immunoreactive bands of CYP2C6 (A) and CYP2C11 (B) are shown as the mean ± SD of four rats per group (C and D). **Significantly different from the control group (p<0.01, Student’s unpaired t-test). ***Significantly different from the control group (p<0.01, Student’s unpaired t-test).
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225 -233. 一部改 変
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3-3-3. TB 4-水 酸 化反 応に お ける 酵素 反 応パ ラメ ータ の モデ ル式 選 択
TB 4-水 酸化 反 応に 複 数の CYP 分 子種 が 関 与す るか 否 かを 調べ る ため ，2 種 の酵 素反 応 速度 モデ ル 式の 比 較検 討 に 用 い た Michaelis-Menten プロ ッ トお よ び Eadie-Hofstee プロ ット を Figure 13 に 示す ．TB 4-水 酸化 反 応に 関与 す る 酵素 が一 つ と仮 定し た 式 1 の AIC (71.5) は ，関 与す る 酵素 が二 つ と仮 定 した 式 2 の AIC (75.5) と 比 較し て小 さ い値 を 示 した ．さ らに ，Eadie-Hofsteeプ ロ ット は単 相 性を 示し た (Figure 13B)．そ の ため， 以 降の TB 4-水酸 化 反応 の酵 素反 応速 度 論的 解析 お よび パ ラメ ータ の 算出 には式 1 を用 いて 行 った ．
Figure 13 Michaelis-Menten plots (A) and Eadie-Hofstee plots (B) of TB 4-hydroxylation in rat hepatic microsomes.
TB at varying concentrations was reacted with 1 mg/mL of microsomes, the NADPH-generating system, 1 mM EDTA and 67.5 mM phosphate buffer (pH 7.4) for 10 min at 37°C. V and S are velocity of reaction and TB concentration, respectively. Results are shown as the mean ± SD of six male rats.
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2018;39:321-327. 一部改 変
51 3-3-4. TB 4-水 酸 化反 応に 及 ぼす DOXの 影 響
Day 1 お よ び Day 4 に お け る ミ ク ロ ソ ー ム の TB 4-水 酸 化 反 応 は 単 一 の Michaelis-Menten 式 に従 う もの とし ，酵素 反応 速度 論 的に 解析 し た．TB 4-水 酸 化 活 性 は ， 対 照 群 と DOX 群 の 両 方 で 基 質 濃 度 に 依 存 し た 双 曲 線 を 示 し た (Figure 14)．Day 1 にお ける TB 4-水 酸化 反 応パ ラメ ー タは ，DOX投 与に より Vmax値の 減少 傾 向が 認め ら れた も のの ，統計 学的 に有 意 な差 は認 め られ な かっ た．Day 4に おけ る DOX 群の Vmax値 は ，対 照群 と比 較 して 有意 な 低値 を 示し たが ，Km値 は両 群間 で 有意 な 差異 が認 め ら れな かっ た ．DOX 群の Vmax/Km値 は， 対照 群 と比 較し て 有意 な 低値 を示 し た (Table 10, 11)．
Figure 14 Michaelis-Menten plots of TB 4-hydroxylation in hepatic microsomes of the control and DOX-treated rats.
TB was incubated with 1 mg/mL of microsomes obtained from rats 1 (A) or 4 (B) days after the administration of DOX or vehicle alone for 10 min at 37°C. Results are shown as the mean ± SD of six rats per group. Open: control group; Closed:
DOX-treated group.
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225 -233.
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Table 10 Kinetic parameters of TB 4-hydroxylation in hepatic microsomes of the control and DOX-treated rats on Day 1.
Control DOX
Vmax (nmol/min/mg protein) 2.95 ± 0.52 2.50 ± 0.48
Km (µM) 752 ± 177 728 ± 157
Vmax/Km (µL/min/mg protein) 4.10 ± 1.14 3.61 ± 1.10 The kinetic parameters of TB were calculated using the Michaelis-Menten equation. Results are shown as the mean ± SD of six rats per group.
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225-233.
Table 11 Kinetic parameters of TB 4-hydroxylation in hepatic microsomes of the control and DOX-treated rats on Day 4.
Control DOX
Vmax (nmol/min/mg protein) 2.95 ± 0.37 1.93 ± 0.40**
Km (µM) 735 ± 154 669 ± 130
Vmax/Km (µL/min/mg protein) 4.15 ± 0.89 2.92 ± 0.41**
The kinetic parameters of TB were calculated using the Michaelis -Menten equation. Results are shown as the mean ± SD of six rats per group.
**Significantly different from the control group (p<0.01, Student’s unpaired t-test).
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225 -233.
3-3-5. 静 脈 投与 後の TB体内 動 態に 及ぼ す DOXの 影響
Figure 15 は， ラッ ト にお け る静 脈投 与 後 の TB 血 清 濃度 時 間推 移を 示 す．
Day 4 にお け る DOX 群の 各採 血 時点 の 血 清 TB 濃度 は， 対 照群 と比 較 して 低 値で 推移 し た． ノ ンコ ンパ ー トメ ント 解 析法 を用 いて 算 出し た 体内 動態 パ ラメ ータ は，Table 12 およ び 13 に示 す．Day 1にお いて は いず れの パ ラメ ー タも 両群 間で 有 意な 差異 が 認め ら れな かっ た もの の，Day 4 にお い て は DOX 群の AUC0→∞が対 照群 と 比較 し て有 意な 低 値を 示 し ，CLto tおよび Vdssは有 意な 高 値 を示 した ．
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Figure 15 Serum concentration-time courses of TB after its intravenous administration to the control and DOX-treated rats.
The pharmacokinetic examinations were conducted 1 (A) or 4 (B) days after the administration of DOX or vehicle alone. The serum concentrations of intravenously administered TB (10 mg/kg) are presented in a logarithmic scale. Results are shown as the mean ± SD of rats per group. Open: control group (Day 1: n= 6; Day 4: n= 5);
Closed: DOX-treated group (Day 1: n= 6; Day 4: n= 8).
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225 -233.
Table 12 Pharmacokinetic parameters of TB after its intravenous administration (10 mg/kg) to the control and DOX-treated rats on Day 1.
Control (n= 6) DOX (n= 6) AUC0→8h (mg·hr/L) 203 ± 12 192 ± 22 AUC0→∞ (mg·hr/L) 262 ± 20 246 ± 30 CLto t (mL/kg/hr) 38.4 ± 3.0 41.3 ± 5.7 ke (1/hr) 0.177 ± 0.013 0.180 ± 0.015
t1/2 (hr) 3.93 ± 0.27 3.87 ± 0.34
Vdss (mL/kg) 152 ± 8 161 ± 22
The pharmacokinetic parameters of TB were calculated on the basis of the non-compartmental method. Results are shown as mean ± SD of rats per group.
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225 -233.
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Table 13 Pharmacokinetic parameters of TB after its intravenous administration (10 mg/kg) to the control and DOX-treated rats on Day 4.
Control (n= 5) DOX (n= 8) AUC0→8h (mg·hr/L) 225 ± 32 179 ± 16**
AUC0→∞ (mg·hr/L) 303 ± 52 238 ± 30*
CLto t (mL/kg/hr) 33.9 ± 5.3 42.7 ± 5.5*
ke (1/hr) 0.164 ± 0.015 0.169 ± 0.026
t1/2 (hr) 4.26 ± 0.37 4.20 ± 0.61
Vdss (mL/kg) 140 ± 17 173 ± 14**
The pharmacokinetic parameters of TB were calculated on the basis of the non-compartmental method. Results are shown as the mean ± SD of rats per group. *Significantly different from the control group (p<0.05, Student’s unpaired t-test). **Significantly different from the control group (p<0.01, Student’s unpaired t-test).
引用）Fukuno S. et al., Biopharm Drug Dispos., 2019;40:225 -233.
3-3-6. DOX 投与 が TB の タン パ ク非 結 合型 分率 に及 ぼ す影 響
ラッ ト に DOX を投 与 する こと に よっ て，Day 4 では 血清 ア ルブ ミ ン濃 度が 有意 に減 少 した ．Day 4 に おけ る DOX 群で は，血清 総 TB濃 度は 減 少し て いる にも かか わ らず ，血 清タ ンパ ク 非結 合型 TB 濃度 は有 意 に増 加し た ．その 結 果，
DOX 群の fu は 対 照群 と比 較 して 有意 な 高値 を示 すこ と が明 らか と なっ た ．な お，Day 1 にお い ても 同様 の 傾向 が認 め られ たも のの ， それ らの 変 化は い ずれ も統 計学 的 な有 意水 準 に達 し なか った (Table 14, 15)．