たとえば
– DNAのメチル化状態を調べる
Whole‐Genome Bisulfite Sequencing [WGBS]
Methylation-sensitive enzymatic digestion experiments (e.g. Reduced Representation Bisulfite Sequencing [RRBS])
Aza-labeled DNA
応用例
– 目的のDNAのメチル化状態について解析（経時的変化なども）
MyIllumina内の下記のリンクを参照ください
https://icom.illumina.com/download/summary/3xkQCsK7KUane-IlxkVdXg
その他のモード
実験から得られる生データ
– FASTQファイル：サードパーティーツールで解析可能
その他のモード
– DNA メチル化解析 ( バイサルファイトシーケンシング )
Protocol サンプル調製キット 必要な DNA 量 解析モード
RRBS Paired ‐ End Sample Prep Kit * 2-5 µg DNA
FASTQ only WGBS TruSeq DNA sample prep * 5 µg DNA
* 追加のキットや試薬が必要です。
イルミナでMiSeqを用いて検証したプロトコールですが、サポートは行っておりません。
ご理解の上、お試しください（先ほどご紹介いたしました資料を参照ください）。
注意点
– MiSeq Reporter (MSR)はバイサルファイト処理したDNAの解析に非対応 – 従って、得られたFASTQファイルをサードパーティーツールで解析
– サンプルの多様性が低い場合はPhiXのスパイクインを試す
– MiSeqにより得られる最大データ量が8Gbasesであることを考慮して
カバレッジを計算する。
その他の情報は弊社Websiteでもございます。
http://www.illuminakk.co.jp/applications/epigenetics/sequencing_based_methylation_analysis.ilmn
その他のモード
– DNA メチル化解析 ( バイサルファイトシーケンシング )
MiSeq で可能な実験のワークフロー RNA
RNA
DNA
MiSeq で可能な実験のワークフロー RNA
DNA
Small RNA シーケンシングとは？
– Dicer/Droshaで修飾されたmiRNA
– サンプル調製キットに用いるTotal RNAあるいは精製したSmall RNAが必要 – 全ての哺乳動物に適応可能
応用例
– Small RNAの定量解析・同定 – 遺伝子制御
– 薬剤のスクリーニング
RNA – Small RNA シーケンシング
Drosha/Dicer diagrams from: Barbara Weber, Carlo Stresemann, Bodo Brueckner, Frank Lyko*. Methylation of Human MicroRNA Genes in Normal
実験から得られる生データ
– FASTQファイル
– 既知のヒトmiRNAとの配列比較 – ヒット数の高い配列情報
– 分解産物のコンタミネーションの割合
(small RNA、mRNA、ゲノム配列、ミトコンドリアの配列の割合)
RNA – Small RNA シーケンシング
Protocol サンプル調製キット 必要な RNA 量 解析モード
TruSeq Small RNA 10-50 ng small RNA
1 µg total RNA Small RNA
注意点
– 多サンプル解析が可能か？ (１サンプルにどれだけのデータが必要か？）
– サンプルがヒト由来でない場合、
FASTQファイルを解析するためのどのサードパーティーツールを使用するか？
– 哺乳動物以外のSmall RNAサンプルにも適応可能
TruSeq Small RNA kitがお手持ちのサンプルに使用可能か？
MiSeq Reporter (MSR)だけでは解析を最後まで行うことが出来ない。
しかしFASTQファイルを作成することができる→サードパーティーツールの使用
RNA – Small RNA シーケンシング
MiSeq で可能な実験のワークフロー RNA
DNA
mRNA シーケンシングとは？
– 遺伝子の発現を解析するためmRNA配列 – アレル特異的な発現を解析する
応用例
– 遺伝子発現解析
– トランスクリプトーム解析 – バイオマーカーの特定 – 腫瘍プロファイル
– 薬剤のスクリーニング
RNA – mRNA シーケンシング
実験から得られる生データ
– FASTQファイル：サードパーティーツールで解析可能
RNA – mRNA シーケンシング
protocol サンプル調製キット 必要な RNA 量 解析モード
TruSeq RNA sample prep 0.1 - 4 µg total RNA 10 - 400 ng mRNA
RNA-Seq
TruSeq Stranded mRNA 0.1 – 4 µg total RNA
TruSeq Total RNA 0.1 – 1 µg total RNA
(FFPE / degradation)
注意点
– MiSeq ReporterのRNA-SeqモードではFASTQファイルのみ作成 – MiSeq Reporterではサンプルの種類を判別できない
– MiSeq Reporterでの配列比較ではexonとexonの境界配列に関しては、
解析が不可能
– FASTQファイルを解析するためにどのサードパーティーツールを使用する
か？
– 実験にどれだけのデータ量・カバレッジが必要か？
MiSeqのデータだけでは、mRNAや転写物の量の小さな変化を解析することが困難
どれだけのリード長が最適か？
シングルエンド・ペアドエンドのどちらを使用するか？