･51 1 51 1 1● 151 201 251 341 350 400
TirrM! (S)
(A) STLl
51 1 50 1 10 1 51 200 250 310 350 400
TIJTNt (i)
400 LL g/mL 2(氾LL g/mL I(氾JL g/mL
50 FLg/mL
BSA 100 〟g/mL
400 FL g/mL +20 mM Rha
200 JL dmL
l00FL g/mL 50 ILgmL 25 JLdmL BSA 100 JLdmL 200 LL g/mL +20 mM Rha
Figure IV12･ Sensorgrams showing the interactions Of SML and STLs
Tablerv･l KD eStima(ed by the interaction Of SMLwith immobili2:ed L‑
rhamnose･ Data were Bt to association and dissociation models to obtain ka and kd･ KD Was Calculated from these parameters･
Mr, kd (LJMs) kd (1/S) KD (M)
SML 23.7 kDa 1.32E+06 0.70E･02 5.29E‑09
STL1 31.4 kDa 6.70Ed6 1.10E･02 1.67E.09
STL2 2 1.4 kDa 4.54E+07 2.73E･02 6.03E. 1 0
STL3 2 1.6 kDa 4.86E+08 1.47E‑02 3.03E‑1 1 0
0 知 0 0 知
● 胡 0 0 '
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叫m 33 t re t t0 Sa d
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魚類の撤胞子虫感染におけるレクチンの影響評価
緒 言
魚類に寄生する原虫類には鞭毛虫､繊毛虫､微胞子虫､アピコンプレックス類など 様々な生物群が含まれる｡それらのうち､養殖環境で異常に寄生数が増加することで 魚に致命的影響を与えるものがある一方､宿主には直接の害作用を及ぼさなくても､
筋肉などに寄生して商品としての価値を失わせる種類もある｡微胞子虫病には後者の 性質を持つものが多く､ウナギの体側筋が不規則な凹凸を呈するべこ病､サケ科魚の 筋肉や心臓内に小白点の病巣が形成される武田微胞子虫症､アユの腹腔内に無数のシ ストが形成されるグルゲア症などが知られている(浦和､ 1996 ;小川､ 2004)0
微胞子虫は真正細胞内寄生虫で､極管を持つ小型の胞子(大きさ3‑lo〟m)を産す る単細胞性の原生生物である｡宿主‑の感染は､胞子の極管が反転弾出して宿主の細 胞にささり､胞子原形質が極管を通して細胞内に挿入されることで始まるとされる｡
しかし､極管弾出の刺激因子や感染メカニズムには不明な点も多い｡侵入以降の発育 は､基本的にメロゴニー(増員生殖期)とスポロゴニー(胞子形成期)を経て胞子に 到るが､感染を受けた宿主細胞が肥大化して可視大の複合体､すなわちキセノマを形 成するものもある(浦和､ 1996)0
病原微生物や寄生虫の感葺削こ各種糖鎖が関与することは従前より報告されている
が(Beuth et al‥ 1995; Jacobson &Doyle, 1996; Ⅹu et a1., 2001)､マスノスケ
の鯉に寄生する微胞子虫(Loma salmoJ7ae)にサケ科魚卵由来レクチン様分子の存在 が示唆されたことから､微胞子虫と魚の間でもレクチンが何らかの役割を担っている と推察された.そこで本研究では､アユのグルゲア症原因微胞子虫Glugea plecoglossl'の感染に焦点を絞り､微胞子虫が宿主魚に侵入する過程を追跡して､そ
の間にレクチンがどのように影響するかを調べた｡
材料と方法 魚への感染実検系の確立
供試魚
Glugeaplecoglossl'はアユ以外にニジマスにも感染しうること､ニジマスは様々な
発育段階のものが入手しやすく飼育管理も容易であることから､当初の実験モデルと してニジマスを用いた｡ニジマスの発眼卵は東京都水産試験場奥多摩分場(現､奥多 摩さかな養殖センター)または山梨県水産技術センター忍野支所から提供を受け､イ
ソジン50ppm､ 15分間の薬浴後､水温15℃の水槽(1t)内で解化､飼育した｡飼育 条件は循環漉過式および半流水式で､自動給餌器を用いて1日4回､市販の固形餌料 を与えた｡
胞子
滋賀県水産試験場または滋賀県内のアユ養殖場から､グルゲア症に篠った養殖アユ
の提供を受け､解剖してキセノマ(シスト)を回収した｡滅菌蒸留水に懸濁したシス
トを細胞分取用ふるいキット(Sigma)と付属のスチールメッシュを用いて破砕しな がら爽雑物を除去し､さらに段階的な目合いのナイロンメッシュ(100lLh, 75pn, 50
川25JLn･ 10LLm･ 5FLm)を通過させて漉過した.次いで､嬢液を50%percoll (Sigma)
に重層し､ 750×gで20分間遠心分離した○上清を捨てて沈殿のペレットを回収し､
滅菌蒸留水で2回洗浄したo以上の過程で精製された6･ plecoglossl･胞子を滅菌蒸 留水に再懸濁し､血球算定盤を用いて胞子数を計数した｡胞子懸濁液には抗生物質
(100 U/ml penicillin, loo″ g/ml streptomycin, 0. 25〃 g/ml amphotericin B; Gibco
BRL)を添加して､使用時まで4℃で保存した｡使用直前に胞子懸濁液を一滴取り､等 量の過酸化水素水溶液を加えて混合し､位相差顕微鏡により胞子の極管弾出を確菰し てから実験に用いたoまた､感染初期における胞子の付着部位を調べる実験において は､胞子をあらかじめ蛍光色素uvitex‑2B (Ciba Geigy)で標識染色してから感染実 験に使用したo染色方法は､ 1% Uvitex‑2B溶液に胞子を懸濁し､室温で10分間静置 後､滅菌蒸留水で2回洗浄した.なお､予備実験により､ Uvitex‑2B蛍光染色が胞子 の感染力に影響を与えないことは確認されている｡
感染法
1)浸漬‥ニジマス稚魚1尾あたり100 mlの脱塩素水道水をガラスビーカーに入れ､
106胞子/mlの濃度となるように胞子懸濁液を添加した｡浸演は室温､暗条件､無 給餌で､エアレーションを施しながら24時間行った｡
2)体表塗布‥ニジマス稚魚を50 ppmのMS222 (Sigma)で麻酔した後､市販の綿棒に 胞子懸濁液(107胞子/ml)を吸着し､背鰭と腹鰭の間の体表に塗布した｡
3)腹腔内注射:ニジマス稚魚を麻酔し､ツベルクリン注射器(1 ml､テルモ)を用 いて1尾あたり0･l ml､胞子数は107胞子/尾になるよう､腹腔内に注射した｡
4)経口投与‥ツベルクリン注射器(lml)の先端部に内径1m､外径2mm､長さ5cm の滅菌シリコンチューブを装着し､麻酔したニジマス稚魚の食道内へ挿入して胞 子懸濁液を注入した｡投与量は1尾あたり0･1 ml､胞子数は107胞子/尾になるよ
う調整した｡
寄生検査
上記の方法で感染させたニジマスを水温20‑23℃に制御した水槽に移し､ 30‑35 日間程度飼育して定期的に採材したo寄生の判定法として､剖検による肉眼検査また は加sl'tuハイブリダイゼ‑ション法を用いた組織検査を実施した｡それぞれの検査 法の手順は､以下の通りである｡
1)剖検:外観の目視､または解剖して実体顕微鏡により､シストの有無を確認する ことで判定したoまた､シスト数(寄生強度)､シスト形成部位についても記録し
た｡
2) A sl'tuハイブリダイゼ‑ション(ISH)紘:基本的にはLee et al. (2000)の方
法を元にしたが､ハイブリダイゼ‑ションの過程はLeeet al. (2003)の迅速ISH
法を用いたoまず採材した魚を10%中性ホルマリンで3日間固定した後､エタノ ール系列を用いて脱水し､パラフィン包埋した｡常法に従い､厚さ5〟mのパラフ ィン切片を作製し､キヤピラリーギャップ･スライドグラス(ProbeOnPlus;Fisher
̲2̲
Scientific)に貼り付けた｡ a. plecogloss1'の小サブユニットリボソ‑マルRNA
遺伝子の塩基配列に基づき､以下の3つのオリゴヌクレオチド･プローブを設計
した｡
GPSR‑0 I : 5 '‑GCATCCACGTCAGACAGAATCAATCTGGTT‑3 '
GPSR‑02 : 5 '1;AACGAGCTCGTCAATCGCTCATCTTGTGT‑3 'GPSR‑03 : 5 '‑AATCCTGCACTCACTCGCTCTCGCTTGTTC‑3 '
これらのオリゴヌクレオチドはDIGオリゴヌクレオチド･ティリングキット (BoehringerMannheim)を用いて､ジゴキシゲニンーdUTPによりラベリングした｡
ISHはMicroProbe染色システム(Fisher Scientific)を用いて行った｡付属の反 応液により脱パラした後､トリスバッファー(pH7.4)で水和､ペプシン(2.5mg/ml) 溶液で消化した｡上記のプローブを反応させて45℃で30分間インキュベ‑トした
後､ 2×SSCバッファー､次いで1×Imnuno/DNAバッファーで洗浄した｡アルカリ
性フオスフアタ‑ゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体を載せて50℃で10分間反応させ た後､ APクロモゲンバッファーで2回洗浄した｡ NBT/BCIP (DIG標識核酸抽出キ
ット､Boehringer Mannheim)を用いて発色させ､0. 05%のBismark Brown Y (Sigma)
で対照染色を施した｡
各種レクチンのグルゲア感染における影響評価
Zh VL'tTO試験による各種レクチンのスクリーニング
以後の実験に用いるレクチンを選抜するため､市販の各種レクチンと G.
plecoglossl'胞子との結合性を調べた. 109胞子/mlに調整された胞子懸濁液30p lを スライドグラスに塗抹し､自然乾燥させた後､メタノールで固定､リン酸緩衝液(PBS)
で5分間洗浄した｡次に8種類のレクチン､すなわち､ concanavalin A (Con A),
Dolichos biflorus agglutinin (DBA), Lens culimaris agglutinin (LCA), Peanuts allutinin agglutinin (PNA) , Soybean agglutinin (SBA) , Ulex europaeus agglutinin(UEA‑1),恥eat germ agglutinin (WGA), Phaseolus vulgaris agglutinin (PHA‑E4)
を､ 5〟g/mlおよび10〃g/mlに調整してスライドグラスに載せ､ 1時間インキュベ‑
トした｡反応終了後､ pBSで5分間洗浄し､ 50〝1のfluoresence avidinD (5〝g/ml
in PBS)を載せて30分間培養した｡ PBSで3回洗浄後､ 90%グリセロールで封入して から蛍光療微鏡で検鏡した｡
レクチン処理による胞子の極管弾出試験
2×108胞子/mlに調整した胞子懸濁液に各種レクチン溶液(60〟g/ml)を添加し､
10分間および2時間後にサンプリングした｡胞子300個をランダムに観察し､極管弾 出率を測定した｡レクチンは､前述の結合性試験で強く陽性反応を示したConAとWGA､
逆に陰性であったDBAとLCAの4種類を使用し､対照としてはレクチンの代わりにPBS を用いた｡
レクチン処理した胞子による1'n vl'vo感染実験
G. plecoglossL'胞子をCon A, WGA, DBA, LCAの4種類のレクチンで2時間処理し
た後､ PBSで2回洗浄した懸濁液を感染実験に用いた.感典実験の材料と方法は､上 記のように､ニジマス稚魚に対して漫漬､塗布､および経口投与することで行った｡
魚卵および仔稚魚に対するゲルゲアの感染実験 供試魚および受精卵
ニジマス:前述の方法で発眼卵を入手､飼育管理し､ニジマスの発育段階別に感染 実験を行った｡発眼卵50粒､貯化仔魚(貯化1､ 9､ 14日後)各50尾､稚魚(貯化 30､ 59､ 86日後)各50尾を用いた｡
アユ:人工採卵したアユ発眼卵を日清マリンテック(樵)より購入し､実験に用い た｡卵が付着したキンランを20 1円形水槽に収容し､水温を19℃に設定した｡飼育 水は毎日卜2回､落下式水槽により置換し､僻化後2‑3日までは脱塩素水道水､そ れ以降は徐々に海水を混合して､ 7日目には100%海水に移行した｡稚魚への給餌は 毎日1‑2回､シオミズツボワムシ(以下､ワムシ)を各水槽に5個体/ml (水槽あた り500,000個体)の濃度になるよう行った｡給餌直前､ワムシ培養槽内の密度を計数 (1 mlにルゴール液200〟1を添加して染色し､カウント)した後､目合いが41〝m のプランクトンネットで必要量のワムシを回収して濃縮した｡ワムシ培養槽は水温
28℃に維持し､給餌は毎日1回､フレッシュグリーン(日清マリンテック)を0.2ml/1
の濃度で与えた｡アユ卿ヒ後10日日以降は翌日に給餌する分のワムシを別のバケツ に分け､マリンアルファ(日清マリンテック)により栄養強化した｡
感染実験
ニジマス:
1×108胞子/mlのG･ plecoglossl'胞子懸濁液300 mlに卵または仔稚魚を浸漬する
ことで感染実験した｡浸漬2時間後､卵は蒸留水に入れて軽く擾拝しながら5分間洗 浄を7回繰り返し､仔稚魚は脱塩素水道水中で一晩置くことで胞子を洗い流した｡以 後､飼育水槽に戻して20℃で飼育を継続した｡
アユ:
1)発眼卵と稚魚の感受性比較: 2. 0×106胞子/mlのG. plecoglossl･胞子懸濁液2‑1
にアユ発眼卵または摂餌を開始した貯化2日目の稚魚を1時間浸漬した後､ 20‑1 の流水式飼育樽に戻して､ 19℃で飼育した｡醇化25日目前後より寄生の有無を検 査し､寄生率および寄生強度を算定した｡
2)稚魚‑の感葺削こおけるレクチンの影響: 2.6×109胞子/mlの胞子懸濁液l mlにア ユ由来レクチンであるSFL3を10〃M (約0.3mg/ml)加え､ 23℃で90分間反応さ せた｡ 300×gで5分間の遠心分離により胞子を回収した後､飼育水槽に直接､胞 子懸濁液を添加し､ 1時間止水にして浸漬感染した(浸漬時の胞子の濃度は6.5×
104胞子/ml)｡その後､流水を開始して飼育水を入れ替え､ 19℃で飼育を継続した｡
浸漬27日後に寄生の有無を検査した｡
3)卵‑の胞子の付着におけるレクチンの影響:4.65×106胞子/mlの胞子を
Uvitex‑2B蛍光染色した後､ sFL3を10FLM (約0.3 mg/ml)添加し､ 23℃で90分