49
16）。AKTとS6Kのリン酸化はSAR245409 1uMで抑制され、pimasertib併用に よる明らかな影響は認めなかった。ERKのリン酸化はpimasertib 30nMにより抑 制されたが、SAR245409 1uMとpimasertib 30nMとの併用によりさらに抑制され た。
図16 SAR245409とpimasertibの単剤および併用時の標的タンパクの脱リン酸 化
MCAS, OAW42株にそれぞれSAR245409 1000nM, pimasertib 30nMを単剤もしく は併用で添加し、MAPK経路（p-ERK）、PI3K/mTOR経路(p-AKT, p-S6K)のリン 酸化をウエスタンブロット法にて評価した。
II-3． SAR245409と pimasertibの併用療法によるアポトーシス誘導
50
図17 MCAS, OAW42, JHOM-2Bにおける細胞周期解析
SAR245409 1uM、pimasertib 30nMを各単剤もしくは併用で添加した。いずれも 3回の実験を行い、平均値を算出した。
そこで、Annexin Vアッセイによりアポトーシス誘導能を検証した。
SAR245409 1uMとpimasertib 30nMの併用によりアポトーシスが有意に誘導され ることが示され（図18）、両薬剤の併用効果はcytotoxicな作用も含むことが明 らかとなった。
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図18 MCAS, OAW42, JHOM-2BにおけるAnnexin-Vアッセイ
SAR245409 1uM、pimasertib 30nMを各単剤もしくは併用で添加し、Apoptosis細 胞の比率を算出した。いずれも3回の実験を行い、平均値 SD値を算出した。
II-4． MEK1/2、ERK1/2ノックダウンによる SAR245409感受性の増強効果
併用療法におけるMAPK経路抑制の効果を検証するために、OAW42におい てMEK1/2またはERK1/2をノックダウンしてからSAR245409を添加しMTTア ッセイを行った。ウエスタンブロット法により、MEK1/2に対するsiRNAで
MEK1/2の発現が、ERK1/2に対するsiRNAでERK1/2の発現が、それぞれネガ
ティブコントロールと比較して80%以上抑制されていることを確認した（図19
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52
A）。MEK1/2もしくはERK1/2のノックダウンによる効果に加えて、MEK1/2も
しくはERK1/2のノックダウンによりSAR245409の増殖抑制効果が増強され、
ネガティブコントロールと比較して有意に細胞増殖が抑制された（図19 B）。
図19 (A) OAW42においてMEK1/2, ERK1/2をそれぞれ2種類のsiRNA
（siMEK1/2-1, siMEK1/2-2, siERK1/2-1, siERK1/2-2） にてノックダウンし、ウエ スタンブロット法にてそれぞれTotal MEK, Total ERKの発現抑制を確認した。（B）
（A）で用いたsiRNAにより、MEK, ERKをノックダウンした条件下で、
SAR245409を添加し、MTTアッセイを施行した。コントロールsiRNAである
NCに比し、MEK1/2, ERK1/2のノックダウン併用では有意に細胞増殖が抑制さ れた（青線と赤・緑線を比較）。
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4 4
53
II-5． FRETイメージング法による S6K、ERK活性の定量化
併用療法の抗腫瘍効果におけるPI3K/mTOR経路とMAPK経路それぞれの阻 害作用の効果を評価するために、FRETバイオセンサーを用いて検証した。FRET バイオセンサーは、S6Kに対してはEevee-S6K-NES、ERKに対しては
EKAREV-NLSをそれぞれ用いた（図20 A）。内因性のS6KやERKによりバイ
オセンサーがリン酸化されると、センサードメインとリガンドドメインが分子
内で結合する。その形態変化によりYFPがCFPに近接し、FRETが生じる53。 まずS6KとERKに対するFRETバイオセンサーを安定発現する細胞株を樹立し
た。EKAREV-NLS発現細胞株とEevee-S6K-NES発現細胞株を両薬剤に3時間曝
露すると、ERK活性はpimasertib濃度依存性に徐々に低下していった（図20 B）。 S6K活性は、SAR245409低濃度（-100nM）ではむしろ活性が上がり、高濃度で はS6K活性が抑制された（図20 C）。この結果はウエスタンブロッティング法 を用いたリン酸化の定量（図13）と矛盾しない結果であり、FRETイメージン グ法の定量解析法としての信頼性を確認できた。
54
図20 (A) FRETバイオセンサーの模式図。内因性のERKやS6Kによりバイオ
センサーがリン酸化されると、形態変化を起こしFRETが生じる。FRET/CFP比 に従って染色され、青が低活性を意味する。(B, C) ERK(B)またはS6K(C)に対す るバイオセンサーの安定発現MCAS細胞株に、図に示す濃度で各薬剤を添加し、
3時間後に各濃度におけるキナーゼ活性を観察した。
続いて、MCAS, OAW42においてERK, S6K活性を定量化した（図21）。細胞 を96 well plateに撒き、両薬剤を64通りの濃度の組合せで添加し、0分、30分、
3時間、24時間、48時間後に測定した。 SAR245409によるS6Kの低下は、30 分以降、高濃度下（＞1.0 uM）で確認された（図21A, B）。ERK活性は低濃度の
pimasertib（0.032-0.32uM）により薬剤添加30分後から速やかに抑制された（図
21C, D）。細胞間の接触により、キナーゼ活性は阻害されるため、両薬剤の添加
A
Linker
ERK or S6K 440 nm
440 nm 475 nm
515 nm FRET
Phosphatase Substrate
peptide
T
Ligand domain
CF YF P
P
P
B
C FRET/CFP ratio 1.2 2.0
Pimasertib treatment for 3 hours
ERK activity (nucleus)
S6K activity (cytoplasm)
0µM 0.01µM 0.032µM 0.1µM 0.32µM 1.0µM 3.2µM 10µM
0µM 0.01µM 0.032µM 0.1µM 0.32µM 1.0µM 3.2µM 10µM SAR245409 treatment for 3 hours
1.8 1.2
FRET/CFP ratio
20 um
20 um
55
の有無によらず、48時間後にはS6K、ERKともに、活性値が低下していた（図 21A-D）。
1.61 1.83 1.64 1.6 1.67 1.61 1.58 1.58 1.63 1.6 1.58 1.63 1.61 1.6 1.6 1.67 1.65 1.66 1.86 1.59 1.61 1.67 1.57 1.58 1.62 1.63 1.61 1.73 1.66 1.64 1.63 1.63 1.62 1.63 1.63 1.64 1.6 1.75 1.69 1.64 1.56 1.66 1.62 1.7 1.69 1.64 1.68 1.59 1.59 1.68 1.69 1.68 1.58 1.67 1.64 1.59 1.54 1.62 1.69 1.7 1.57 1.56 1.65 1.6
1.3 1.23 1.32 1.28 1.28 1.26 1.3 1.31 1.46 1.52 1.48 1.47 1.43 1.46 1.48 1.54 1.61 1.58 1.67 1.52 1.63 1.62 1.55 1.62 1.59 1.62 1.63 1.71 1.61 1.63 1.69 1.68 1.71 1.6 1.64 1.69 1.49 1.52 1.57 1.56 1.57 1.55 1.53 1.65 1.51 1.52 1.59 1.53 1.54 1.49 1.54 1.44 1.48 1.5 1.5 1.5 1.45 1.44 1.43 1.49 1.44 1.45 1.52 1.47
1.36 1.33 1.34 1.34 1.31 1.29 1.33 1.31 1.47 1.51 1.51 1.47 1.45 1.44 1.55 1.64 1.61 1.63 1.7 1.57 1.64 1.62 1.57 1.6 1.59 1.63 1.64 1.7 1.69 1.66 1.66 1.71 1.74 1.77 1.72 1.6 1.56 1.56 1.53 1.59 1.53 1.59 1.53 1.55 1.49 1.52 1.62 1.55 1.55 1.57 1.49 1.46 1.48 1.53 1.51 1.51 1.45 1.46 1.47 1.47 1.48 1.51 1.53 1.49
1.4 1.43 1.46 1.34 1.4 1.31 1.34 1.25 1.52 1.52 1.58 1.52 1.49 1.48 1.51 1.54 1.58 1.62 1.69 1.57 1.65 1.63 1.53 1.54 1.65 1.58 1.57 1.64 1.59 1.61 1.61 1.6 1.61 1.64 1.6 1.64 1.52 1.5 1.5 1.45 1.58 1.58 1.54 1.54 1.47 1.46 1.53 1.47 1.54 1.54 1.44 1.46 1.48 1.47 1.47 1.45 1.49 1.46 1.5 1.5 1.49 1.48 1.45 1.41
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56
図21 (A) SAR245409とpimasertibを右下の図に示す様々な濃度の組み合わせ で添加されたMCASにおけるS6K活性。薬剤添加前、添加から30分、3時間、
1日、2日後に測定し、定量化した。個々の数値はFRET/CFP比の平均（10細胞 以上）、つまりS6K活性を意味している。赤や青の色分けはS6K活性の高低を
1.84 1.97 2 1.97 1.87 1.85 1.84 1.99 1.93 1.95 1.93 1.8 1.87 1.87 1.92 1.92 1.92 2.01 2.01 1.91 1.96 1.91 1.84 1.85 1.91 1.86 1.91 2.07 1.84 1.9 1.92 1.9 1.91 1.85 1.84 1.96 1.88 1.96 1.92 1.9 1.88 1.91 1.94 1.84 1.96 1.92 1.9 1.88 2.05 1.94 1.88 1.9 1.91 1.79 1.88 1.87 1.92 1.93 2.02 1.9 1.8 1.91 1.96 1.86
1.52 1.39 1.45 1.4 1.39 1.39 1.35 1.42 1.7 1.58 1.54 1.5 1.52 1.48 1.54 1.55 1.87 1.62 1.65 1.59 1.6 1.63 1.58 1.58 1.91 1.62 1.56 1.75 1.6 1.58 1.63 1.61 1.95 1.62 1.56 1.7 1.53 1.6 1.56 1.58 1.91 1.6 1.56 1.57 1.53 1.54 1.58 1.59 1.88 1.57 1.53 1.54 1.53 1.54 1.54 1.54 1.87 1.56 1.55 1.53 1.54 1.54 1.58 1.55
1.64 1.59 1.5 1.51 1.53 1.49 1.4 1.44 1.82 1.84 1.71 1.62 1.54 1.52 1.56 1.64 1.87 1.77 1.76 1.72 1.62 1.63 1.58 1.63 1.88 1.76 1.7 1.68 1.69 1.63 1.62 1.62 1.99 1.77 1.72 1.69 1.61 1.61 1.62 1.59 1.92 1.74 1.67 1.7 1.58 1.61 1.65 1.57 1.97 1.75 1.67 1.6 1.59 1.6 1.6 1.57 1.85 1.78 1.66 1.61 1.64 1.56 1.57 1.58
1.69 1.57 1.46 1.5 1.35 1.32 1.27 1.18 1.85 1.76 1.72 1.53 1.57 1.49 1.48 1.49 1.84 1.79 1.69 1.64 1.58 1.58 1.48 1.58 1.83 1.77 1.66 1.64 1.61 1.55 1.56 1.51 1.88 1.75 1.64 1.62 1.55 1.52 1.53 1.51 1.85 1.72 1.64 1.58 1.53 1.53 1.51 1.5 1.83 1.67 1.61 1.55 1.55 1.5 1.49 1.45 1.81 1.66 1.61 1.58 1.56 1.5 1.5 1.51
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1.55 1.52 1.5 1.49 1.48 1.45 1.45 1.41 1.6 1.55 1.53 1.57 1.56 1.45 1.51 1.52 1.65 1.56 1.59 1.55 1.53 1.49 1.51 1.47 1.69 1.62 1.55 1.54 1.54 1.62 1.57 1.52 1.72 1.6 1.6 1.54 1.56 1.55 1.49 1.55 1.61 1.58 1.6 1.55 1.54 1.48 1.5 1.47 1.66 1.6 1.55 1.5 1.49 1.54 1.5 1.55 1.66 1.63 1.61 1.54 1.57 1.52 1.54 1.51
1.52 1.46 1.48 1.49 1.45 1.46 1.39 1.35 1.52 1.54 1.51 1.56 1.53 1.43 1.39 1.46 1.59 1.53 1.63 1.53 1.51 1.46 1.43 1.47 1.67 1.61 1.56 1.54 1.53 1.56 1.46 1.5 1.66 1.61 1.62 1.61 1.56 1.5 1.44 1.45 1.7 1.55 1.56 1.57 1.52 1.45 1.41 1.38 1.71 1.58 1.53 1.52 1.51 1.51 1.42 1.47 1.6 1.58 1.5 1.5 1.51 1.48 1.45 1.43
1.48 1.5 1.48 1.52 1.49 1.47 1.41 1.43 1.53 1.58 1.56 1.55 1.53 1.46 1.44 1.46 1.6 1.56 1.63 1.61 1.55 1.51 1.43 1.45 1.65 1.62 1.58 1.58 1.58 1.55 1.44 1.46 1.69 1.59 1.62 1.64 1.59 1.49 1.43 1.45 1.7 1.62 1.6 1.63 1.58 1.45 1.43 1.4 1.7 1.62 1.56 1.51 1.51 1.5 1.41 1.41 1.55 1.55 1.47 1.47 1.47 1.45 1.43 1.43
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57
表しており、赤色が濃いほど活性が高く、青色が濃いほど活性が低い。(B, C, D)
(A)と同様の条件で測定された、OAW42におけるS6K活性(B)、MCASにおける
ERK活性(C)、OAW42におけるERK活性(D)。
II-6． 細胞増殖、細胞死における S6K, ERK活性の役割
ERK, S6K活性と細胞増殖、細胞死との関連を調べるために、MTTアッセイと
LDHアッセイを用いて、両薬剤のもとでの細胞増殖と細胞死のデータと、FRET イメージングのデータを数理モデルで統合し、S6K, ERK活性がどの程度細胞増
殖や細胞死に関与しているか検証した（図22 A）。細胞増殖とS6K活性、ERK 活性との関連性を図22Bに、細胞死とS6K活性、ERK活性との関連性を図22C
に示す。MCAS、OAW42の両細胞株において、ERKは活性度依存的に細胞増殖
や細胞生存を促進している（図22B, 22C）。すなわち、pimasertibによるERK活 性の低下は、細胞増殖抑制能と細胞死誘導の双方において、濃度依存的に誘導 されることが明らかとなった。一方、S6K活性は、細胞増殖と細胞生存におい
て作用の仕方が異なり、細胞株による差も存在する結果を示した（図22B, 22C）。 まず、細胞増殖に対してはONとOFFの“スイッチ”の切り替えが行われ、一 定の活性度（閾値）を下回った場合に（MCASにおける閾値は -0.15、OAW42
における閾値は-0.3）、細胞増殖抑制効果が強く誘導されていた（図22B）。閾値 の比較からは、OAW42の方がPI3K/mTOR阻害剤に対してより感受性が高いこ とが示唆される。細胞死との関連については、S6K活性が株毎に異なった結果
58
となった（図22C）。すなわち、MCASにおいてはS6K活性度は細胞死には寄与 しておらず、細胞死はERK活性度の低下とのみ相関していた。一方で、OAW42 においてはS6K活性は、ERK活性と同様に、濃度依存的に細胞死と関連してい た。以上のように、OMC株においては、細胞増殖抑制的な側面と殺細胞的な側
面の両者において、PI3K/mTOR阻害剤、MEK阻害剤のもたらす効果は細胞株ご とに異なることが、定量的に示された。
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59
図22 (A) ERK活性とS6K活性のデータをAND gate modelにより統合し、MCAS における細胞増殖への各活性の相関程度を算出する、イメージ模式図。 (B, C)
MCAS, OAW42の細胞増殖(B)、細胞死(C)に対する、薬剤添加3時間後のERK
活性（赤線）とS6K活性（青線）それぞれの相関。横軸は蛋白活性レベルを、
縦軸は細胞増殖または細胞死の程度の相対値を表している。
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第４章 考察
I．子宮体癌における SAR245409（PI3K/mTOR阻害剤）と pimasertib（MEK 阻害剤）の併用療法の検討
子宮体癌におけるSAR245409（PI3K/mTOR阻害剤）とpimasertib（MEK阻害 剤）の併用療法に注目し、MEK阻害剤に対して感受性の高い細胞株において、
SAR245409と低濃度のpimasertibの併用療法が相乗的に細胞増殖を抑制するこ とが明らかとなった。
まずSAR245409とpimasertibの併用療法が、pimasertibに対して感受性が高い 子宮体癌細胞株においてのみ相乗効果を示すことを明らかとした（表2）。PI3K 経路とMAPK経路の同時阻害による相乗的な抗腫瘍効果は、大腸癌、卵巣癌、
肺癌、横紋筋肉腫などいくつかの癌腫の細胞株で報告がある39,54,55。さらに、
RAS/MEKの活性化がPI3K経路とMAPK経路の阻害剤の併用の相乗効果に関与
しているとの報告もある56-58。しかしながら、本研究においては、KRAS変異は
MEK阻害剤への感受性や併用療法の相乗効果の有無と関与していなかった。そ の一因としては、PI3K経路の活性化がMEK阻害剤への抵抗性に関与している 可能性が考えられる。子宮体癌においてKRAS変異はしばしばPIK3CA変異と共 存している28。例えば、pimasertib抵抗性のHHUAはKRAS, PIK3CA, PTEN全て の変異を有する。また別の機序としては、他の経路がMEK阻害剤への抵抗性に
61
関与している可能性が挙げられる。β-カテニン(CTNNB1)やサイクリンD1 (CCND1)の変異によりWnt/beta-catenin/cyclin D1経路が活性化され59,60、その結 果、今回の併用療法に対して様々な感受性を示したという可能性が考えられる。
MEK阻害剤に対する感受性がどのように制御されているかということや、なぜ MEK阻害剤に対する感受性が併用療法の相乗効果のバイオマーカーとなりうる のか、ということを明らかにするためには、さらなる研究が求められる。
次に、SAR245409との併用で相乗効果を示すのに必要なpimasertibの濃度を検 討したところ、30nMにおいて、CIがもっとも低くなる（相乗効果が高い）結果 となった（表2）。30nMというpimasertibの濃度は、同剤単独の場合のIC50値（図 4B）よりもずっと低いことがわかる。SAR245409の至適濃度である1uMも同剤 単独の場合のIC50値よりも低いが、その差はpimasritibよりも小さい。これら2 剤の至適濃度の組合せは、それぞれの阻害剤に対する薬理学的なマーカーの重
要性を示唆している。すなわち、PI3K/mTOR経路の標的蛋白であるAKTは SAR245409 1uM以上という高濃度で抑制される（S6は100 nM以上で抑制され る）のに対し、MAPK経路の標的蛋白であるERKのリン酸化レベルは、pimasertib 30nM以上で著明に抑制されていた。以上より、単独で薬剤を添加する場合、標 的タンパクの抑制が得られる濃度以上でないと目的とするPhenotypeが得られ ない可能性があり、併用療法を構築していく必要性が示唆される。pimasertib単