ｎ ｒ － Ｃ
2
８ ９2
メチレンジオキシタイプ蛍光誘導化試薬２９は第１章で開発した２と同様に，カル ポン酸との反応基として３位にプロモアセチル基を有している．このプロモアセチ ル基の反応性については，２において従来の反応基ブロモメチル基に比べ高い反応
前節において設計した２９はその合成も簡便であり，基本的に強蛍光性クマリン１０
の構造上の条件を満たしている．本節ではこの２９の蛍光誘導化試薬としての性質に ついて反応性および蛍光特性という点から検討を加えた．2‐１３－Bromoacetyl-6,7-methylenedioxycoumarinとカルポン酸との反応性
-3 3
‐
2
９ ３０ａ－ｉ
ａ:ＲローCH3,ｂ:Ｒﾛ･C6H5’ｃ:Ｒ画･CH2(CH2)ｇＣＨ３ ｄ:Ｒ＝･CH2(CH2)6CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH3
⑧:Ｒ=-CH2(CH2)11ＣＨ３ ｆ:Ｒ=ＣH2(CH2)6CH=CHCH2CH=CH(CH2)4ＣＨ３ ｇ:Ｒ=-CH2(CH2)13ＣＨ３ ｈ:Ｒ=-CH2(CH2)6CH=CH(CH2)7ＣＨ３
ｉ:Ｒ＝-CH2(CH2h5CH3
Scheme5
ＣＨ２０ＣＯＲ
まず反応溶媒の影響について検討し，その結果をFig.１２に示す．Fig.１２から明らか なようにアセトン，アセトニトリルといったaproticな極性溶媒中で円滑に誘導化反応
は進行し，２と同様の反応溶媒指向性が確認された．c
Ｈ２ＢｒＲＣＯＯＨ
〈 ～ r
ヘ ク〈
、／
／１１へ
c a 1 a I y s
t ① グ ー Ｕ
団 ＝ － Ｃ
性を示すことをすでに確認している．本項では，この２９においてもその高反応性が 保持されているかという点について再度検討を行なった．反応追跡は生成してくる
カルポン酸誘導化成績体をHPLCで分離，蛍光検出することにより行なった（Scheme 5）．
＞ － 記 字 一 一
１２
８４
（言コゴーＰ葛）》昌菖着＆
Ｆ 一 ○ 一 や
０
０ ２ ０ ４ ０ ６ ０ ８ ０ １ ０ ０ Ｔｉｍｅﾉｍｉｎ
Ｆｉｇ，ｚvatieDerionlhlvenlofSoffectl2Eａｔｉｏｎｏｆ
Ｌａｕｒｉｃａｃｉｄｗｉｔｈ２９ａｌＲoomtemperaturc
●;ace〔one‘○;aceloniUilc.■;bcmene {291＝５１』moUlOO山,118℃mwn-61＝３１』ｍClﾉ１００１』１，IKHCO31＝２ｍｇ
1 ２
乙云｡－５－毛
８４
（】旨．Ｊ逼周）豆響⑭昌茎困些
また，誘導化に対する反応温度の影響について検討したところ，Fig.１３に示すよ うに誘導化反応は室温において約20分で完結していることが認められた．一方，反 応温度50℃の高温条件下においては，誘導化成績体の分解によるものと思われるが，
それらのピーク高さの減少が認められた．
０ ２ ５ ５ ０ ７ ５ ｌ ０ ０ Ｔｍｌｅﾉｍｉｎ
ＦvireDｉe【hutt℃nTaｇrofeoeptcm・effE3l a t i z a t i o n o f
Lauricacidwith29inAcetone
●;momIempemUlrc,Ｏ;５０°Ｃ
【＝129５ﾄ１【,1U1＝06l0n-lﾉowocml8３0叫0ﾉ1oImu・【＝31COHK２ｍｇ
これらの結果は，前節で合成したメチレンジオキシタイプ蛍光誘導化試薬２９が，
第１章で開発した２と同様に，カルポン酸に対する高い反応性を継承していることを 示している．ところで，この誘導化反応においては相間移動触媒として18℃rOwn-6を
利用している．２９によるカルポン酸の誘導化反応が室温下円滑に進行することは先 に確認されたものの，この反応においてl8-cmwn-6が果たす役割は想像以上に全体の
反応収率に影響すると思われる．そこで，誘導化反応に及ぼすl8-crOwn-6濃度につい
て検討した．Fig.１４から明らかなように，カルポン酸濃度に対して試薬２９が過剰量
存在した場合においても，未だ反応収率にはl8-crOwn-6濃度依存性が認められる．この結果は，高反応性基を有する蛍光誘導化試薬といえども，その系に添加する触 媒の影響力が極めて大きいことを示している．ところで，第１章で開発した２と力
-3 5
‐
０ ２ ５ ５ ０ ７ ５ １ ０ ０ Ｔｉｍｅﾉmin
F i g
､ l 4 E f f b c t o f l 8 -C m w n -6 c o n c e n t r a t i o n o n t h e D e
【iotaiztaiv n
ofLauricacidwith29iｎＡcetoneatRoomtemperatuIe
l8Cmwn6：■；ｌＵｍｏＬ●;３１』mo1.0;５１１mol，
【21】＝５umoIﾉ10OIL【L“ncacidl＝lOOnnmI/IOOIll.【KHCO31＝２ｍｇ
１２
で＝＝＝8＝8＝１
８４
︵︼旨︒︺逼局︶︺昌菖舗鼻﹈
〃
０
０５５２
つ目ヨ曽尉）】昌一⑪昌制＆
ルポン酸との誘導化反応がDuoliOeA-375のような弱塩基性アニオン交換樹脂によっ
ても触媒されることが確認されている．そこで，２９でもこのような高分子触媒によ
る反応が可能かという点について以下に検討した．Fig.１５に種々の高分子触媒を用
いてステアリン酸の誘導化反応を行なった結果を示す．
7.5
［Z9】＝100,molﾉ､１.Isleancacidl＝１０molﾉｍｌ
●；にiIouDＡｍ52(537-ｍｇ0(1409ｍe5.■Oｇ2)ii(IIe0b-5m△Aｇ;A,c)tioIuD;）
０．０
０ ２ ０ ４ ０ ６ ０ 両ｍｅ姉in
F i g
・-eionAnofectff5El x c h a n g e r B s i n c a t a l y s t o n t h e D e r i v a t i z a t i o n
ofStearicacidwith29inAcetone
０ １ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０ ５ ０
面ｍｅノmin
F i g
､ l 6 E f f e c t o f S o l v e n t o n t h e D e r i v a t i z a t i o n o f
Steancacidwith29atRoomtemperature
■;ace0onG▲;“c0onit【ile.●;benzenebp;dichlomme8hane I29】＝100nmoUml.【S陸aricac遡I＝10,molﾉml．
【画』ou0eA戸375】＝25ｍｇ
7５
８
０ｓ
５２
つ日ヨョーｐ圏）】乱図》詞崖
0.0
いずれの触媒を用いても誘導化は進行するが，DuoliOeA-375の場合，他の弱塩基性ア ニオン交換樹脂AmberlibelRA-904，あるいはDuoliteA-561に比べ迅速な触媒効果が認
められた．また，このような高分子触媒を用いた場合の反応溶媒の影響をFig.１６に 示したが，ここでもアセトン，アセトニトリルといったapmticな極性溶媒中で円滑に
誘導化反応が進行することが確認された．さらに，この高分子触媒による誘導化反
応においても，先のl8-crOwn-6触媒の場合と同様な濃度依存性が認められた（Fig.１７）．
Fig.’７EfrectofAmountofCatalyst(DuoliOeA-375)on
DerivatizationofSOearicacidwith29inAcetone IZ91＝lOOnmoUml.〔s0earicacid】＝10,molﾉmｌ
６４
つ冒ヨ営圃︶︼邑爾且劃蝉﹈
２
０ ２ ５ s o ７ s １ ０ ０ １ ２ S A
m o u n t o f c a t a l y s t ノ、９
-3 7
‐
2-2誘導化成績体の蛍光特性
前項の検討から，メチレンジオキシタイプ蛍光誘導化試薬２９の３位プロモアセチ ル基が，第１章で開発した2と同様に，カルボン酸に対して高い反応性を有している ことが確認できた．そこで本項では，２９の誘導化反応によって生成するカルポン酸 誘導化成績体の蛍光特性が，前章で予想されたように高い蛍光性を示すかという点
について検討した．
Fig.１８にメタノール中における２９によるラウリン酸誘導化成績体30ｃの蛍光スペ
ルトルを，３およびBrＭＭＣによるそれらとともに示す．
（。・画一語芸四口の》ロ『①○口の○画の駒。．『』
３ ０ ０ ４ ０ ０ ５ ０ ０ ６ ０ ０
Ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈノnm
Fig,l8F1uoresccncespectraof30c,３ａｎｄＭＭＣ・ＬａｕｉｎＭｅＯＨ
Ｉ３０ｃｌ＝＝l＝u1a3L1-CM１M(．０ｘ１０．６。lom、〕.
Fig.１８から明らかなように，２９によるラウリン酸誘導化成績体30ｃの蛍光波長は
他の誘導化成績体に比べ長波長側へシフトするとともに，著しく高い蛍光強度を示
以上の結果は，メチレンジオキシタイプ蛍光誘導化試薬２９が，プロモメチル基な どよりは格段の高い反応性を有していること示す．しかしながら，誘導化反応全体 を考えると反応溶媒，触媒あるいはその量などに注意を向ける必要があることが示 唆された．0(CH2)1oCH3 0(CH2)1oCH3
すことが判った．この結果は，２９が３あるいはそれより高い蛍光強度を与える BrＭＭＣよりも蛍光誘導化試薬として優れた蛍光性を有していることを示している．
ところで，このBrＭＭＣの４位プロモメチル反応基を利用した蛍光誘導化試薬として，
F a r i n o t t i 等 c o y o x h e t i m d は 7 - 3 ) 6 , ' - y l t h e o m m r o - b 4 u m a r i n ,
Ｂ ｒ Ｄ Ｍ Ｃ を 開 発 し ， こ の Ｂ ｒ Ｄ Ｍ Ｃ
によるカルポン酸誘導化成績体（例えば，ラウリン酸誘導化成績体DMC-Lau）が BrＭＭＣによるそれに比べ高い蛍光量子収率を与えることを報告している．さらに，
N a g a n u m a 等 , n i l a u m も o ) c 4 y ' x o i d e n e ４ l y h t e m - , 7 6 - － l y h t e m o m o r b
Ｂ ｒ Ｍ Ｄ Ｃ を 合 成 し ， そ の カ
ルポン酸誘導化成績体（例えば，ラウリン酸誘導化成績体MDC-Lau）について FarinoUi等'3)と同様の事実を報告している．
３３
“ＨＭＨ〈し（しr〕ｒ‐Ｃ
、 ｒ ‐ Ｃ
ＢｒＤＭＣ ＢｒＭＤＣ
Ｃ
しかしながら，これらの試薬は蛍光感度こそ改善されてはいるものの，反応性とい う点からはＢｒＭＭＣの場合と同様にクラウンエーテル触媒下長時間に及ぶ高温加熱条 件を必要としている．反応性という点では，２９のプロモアセチル基が上記試薬で利 用されているブロモメチル基より高いことはすでに確かめられいる．そこで，
BrＭＭＣによるラウリン酸誘導化成績体よりも高い蛍光強度を与えた29によるラウ
リン酸誘導化成績体30cの蛍光特性について，DMC-LauおよびＭＤＣ－Ｌａｕと比較検
討することとした．これらの各種溶媒中におけるスペクトル特性をその蛍光量子収
率（①F）とともにTnble5に示す．三者のラウリン酸誘導化成績体を比較すると，い
ずれの溶媒においても３０Cの蛍光励起ならびに発光波長は他に比べ長波長側へシフト
-3 9
‐
Ｃ
３３
“Ｈ叩ＨＣＣ
ＭＤＣ－Ｌｎ１Ｉ ｏ ｒ ‐ Ｃ DMC-Lau
342 442 0.33
346 439 0.33
391 467 0.80
Table5SpectmlPropertlesandFluomescenceQuantumYieldsof ●
ＤＭＣ－Ｌａｕ,ＭＤＣ－Ｌａｕａｎｄ３０ｃｉｎＳｏｍｅＳｏｌｖｅｎｔｓ
344 439 0.38
348 433 0.31
Solvent Laurate
１１Ｉ
BenzeneCH2Cl2ＭｅＯＨＣＨ３ＣＮＤＭＣ－Ｌａｕ
入ｕｖnｍ(） 入Ｆ（nｍ）
のＦ 入ｕｖ）m(n 入Ｆ（nm）
のＦ 入ｍ(nvu） 入Ｆ（nm）
のＦ
344 446 0.40
348 441 0.53
392 479 0.80
し，蛍光量子収率も著しく高い値を示すことが判った．
393 460 0.71 ３４５
４４５ ０．１９ ３４８ 431 0.07
３９０ 454 0.36
これらの結果は，２９が反応性および蛍光性，両面において他の試薬を凌駕する誘 導化試薬であることを明らかに示している．ところで，２９によるラウリン酸誘導化 成績体の蛍光特性を，第２章で見出した強蛍光性クマリン１０のそれと比較すると，
その蛍光量子収率がいずれの溶媒においても増加していることがわかる．これはお
そらく，試薬自身の３位カルポニル基に加え，誘導化反応によって導入されたカル ポン酸のエステルカルボニル基の相乗的な電子吸引効果によるためと考えられる．
このように，前章において検討したクマリンの蛍光発光機構の解明に基づいて高反 応性および高蛍光性を示す誘導化試薬２９を開発することができた．そこで，この試 薬を用い，ヒト血清中の遊離脂肪酸の蛍光誘導化分析への応用について検討した．
先ず対象脂肪酸として，ラウリン酸からステアリン酸までの誘導化成績体30c-iを別
途合成し（Scheme5），Fig.１９に示すようなHPLC分離クロマトグラム条件を設定し
た．このFig.１９から明らかなように，７種の誘導化成績体が完全に分離され蛍光検
出されている．
ＭＤＣ－Ｌａｕ
30ｃ
の切ｃｏＱめ①』』◎一○の一のロ①。ｃ①○い①』◎三匹
１ ０ ２ ０ ３ ０ ４ ０ Ｔｉｍｅノmin
Fig・l9HPLCchroma〔ogmmofSlandardfatWacids P c a k s
：a２ic;ndcciol１ancUri.ua.l c i d
; ３U$Tiym. c a c i d
； ４lconU. i c a c i a 5
・tmj1ap j c 8 c i d
; 6 . o l c i c a c i d
；
７．．cidGearica$
さらに，ヒト血清中の遊離脂肪酸を２９により蛍光誘導化した時のクロマトグラム
をFig.２０(A)に示す．また，比較として２を用いた場合のクロマトグラムをFig.２０
(B)に示す．このクロマトグラムからも各脂肪酸が良好に分離されていることが判る．
さらに，２９による誘導化成績体の蛍光ピーク強度は２のそれらに比べ格段に大きく なっており，２９はヒト血清中の遊離脂肪酸を迅速に誘導化し，これらを高感度に蛍 光検出できる試薬であることが判った．
2 ０ ３ ０ Ｔ１ｍｅノ、ｉｎ
F i g . ２０ffi℃grzmomatoLCchmHPmaninhuacidsfatXyc
b l o o d p l a s m a d c r i v c d b y Z 9 ( A ) a n d Ｚ(B）
P c a k s
：虫1.1ｍｃａｄｄ３;２d;icｍ8.c，mc1oｙnj〔：IsdiicTacj ４c1nOi.I l c a c i a 5
・cUdn81p 8 c i d
; ６aiccoI. c i d
：
７.sIc8ric8cM
-4 1
‐
1
０ ０4
第 ３ 節 小 括
本章においては，前２章において見出した強蛍光性クマリンフルオロフォア１０を 利用して強蛍光性誘導化試薬２９の合成とその性質について検討し，以下の知見を得
た．
ｌ）強蛍光性クマリンフルオロフォア１０を利用して２９を設計し，これを高収率で 合成することができた．
２）２９とカルポン酸との反応はアセトンあるいはアセトニトリルといったaprOtic
な極性溶媒中，クラウンエーテルあるいは強塩基性イオン交換樹脂触媒を用いるこ
とにより室温で円滑に進行した．しかしながら，誘導化反応収率に対して触媒濃度 依存性が認められるなど，反応系全体を考えた場合，これらの重要性が示唆された．３）２９との反応によって生成するカルポン酸成績体の蛍光特性は，これまで報告 されているクマリン系誘導化試薬の中で最も高い蛍光量子収率を与えることが判っ た．特にＨPLCなどで繁用されるメタノール，アセトニトリルのような極性溶媒中 において，その値は０．８以上にもおよぶことが判った．
４）この試薬を用いてヒト血清中の遊離脂肪酸の高感度蛍光分析が可能であること が示された．