謝辞 - FTA card 及び RNAlater に保存したイヌ糞便検体内 RNA の比較

実験 4 FTA card 及び RNAlater に保存したイヌ糞便検体内 RNA の比較

7. 謝辞

本研究を行うにあたり、押谷仁教授、斉藤繭子准教授には、終始熱心なご指導、ご鞭撻を賜りました。また、微生物学分野に所属する先生方をはじめとする学生およびスタッフの皆様にも、研究を進めるにあたって多くの助言を頂きました。さらに、生誕コホート研究に参加していた乳児とその保護者の方々には、本研究に欠かせない糞便検体の提供にご協力頂きました。また、フィールドナースの皆様には、糞便検体の採取にご協力頂きました。ご協力頂いた皆様に心より御礼申し上げます。

33 8. 参考文献

1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Morgan D, Raff M, Roberts K. Molecular Biology of THE CELL. 6th edition. New York: Garland Science; 2015. p.299–438.

2. Karp G. CELL AND MOLECULAR BIOLOGY. 5th edition. New jersey: Wiley Publishing, Inc; 2007. p.42–84.

3. Robinson TR. Genetics For Dummies. 2nd Edition. New jersey: Wiley Publishing, Inc;

2010. p.129–142.

4. Sambrook J, Green MR. Molecular cloning: A laboratory manual. 4th edition. New York:

Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2012. p.365–392, 450–451.

5. Imbeaud S, Graudens E, Boulanger V, et al. Towards standardization of RNA quality assessment using user-independent classifiers of microcapillary electrophoresis traces.

Nucleic Acids Res 2005;33(6):e56.

6. Reck M, Tomasch J, Deng Z, et al. Stool metatranscriptomics: A technical guideline for mRNA stabilisation and isolation. BMC Genomics 2015;16:494.

7. Herberg JA, Kaforou M, Wright VJ, et al. Diagnostic Test Accuracy of a 2-Transcript Host RNA Signature for Discriminating Bacterial vs Viral Infection in Febrile Children.

JAMA 2016;316(8):835–45.

8. Suzuki S, Horinouchi T, Furusawa C. Prediction of antibiotic resistance by gene expression profiles. Nat Commun 2014;5:5792.

9. Enosi Tuipulotu D, Netzler NE, Lun JH, Mackenzie JM, White PA. RNA Sequencing of Murine Norovirus-Infected Cells Reveals Transcriptional Alteration of Genes Important to Viral Recognition and Antigen Presentation. Front Immunol 2017;8:959.

10. Zhong NS, Zheng BJ, Li YM, et al. Epidemiology and cause of severe acute respiratory syndrome (SARS) in Guangdong, People’s Republic of China, in February, 2003. The Lancet 2003;362(9393):1353–8.

11. Ebola haemorrhagic fever in Sudan, 1976. Bull World Health Organ 1978;56(2):247–70.

12. Yan H, Yagyu F, Okitsu S, Nishio O, Ushijima H. Detection of norovirus (GI, GII), Sapovirus and astrovirus in fecal samples using reverse transcription single-round multiplex PCR. J Virol Methods 2003;114(1):37–44.

13. Roos-van Groningen MC, Eikmans M, Baelde HJ, de Heer E, Bruijn JA. Improvement of extraction and processing of RNA from renal biopsies. Kidney Int 2004;65(1):97–105.

14. Link A, Balaguer F, Shen Y, et al. Fecal MicroRNAs as novel biomarkers for colon cancer screening. Cancer Epidemiol Biomark Prev Publ Am Assoc Cancer Res Cosponsored Am Soc Prev Oncol 2010;19(7):1766–74.

15. Kalimutho M, Del Vecchio Blanco G, Di Cecilia S, et al. Differential expression of miR-144* as a novel fecal-based diagnostic marker for colorectal cancer. J Gastroenterol 2011;46(12):1391–402.

16. El-Khoury V, Pierson S, Kaoma T, Bernardin F, Berchem G. Assessing cellular and circulating miRNA recovery: the impact of the RNA isolation method and the quantity of input material. Sci Rep 2016;6:19529.

17. Kasahara T, Miyazaki T, Nitta H, et al. Evaluation of methods for duration of preservation of RNA quality in rat liver used for transcriptome analysis. J Toxicol Sci 2006;31(5):509–19.

18. Kono N, Nakamura H, Ito Y, Tomita M, Arakawa K. Evaluation of the impact of RNA preservation methods of spiders for de novo transcriptome assembly. Mol Ecol Resour 2016;16(3):662–72.

19. Passow CN, Kono TJY, Stahl BA, Jaggard JB, Keene AC, McGaugh SE. Nonrandom RNAseq gene expression associated with RNAlater and flash freezing storage methods.

Mol Ecol Resour 2018; Accepted for publication.

20. Angebault C, Ghozlane A, Volant S, Botterel F, d’Enfert C, Bougnoux M-E. Combined bacterial and fungal intestinal microbiota analyses: Impact of storage conditions and DNA extraction protocols. PloS One 2018;13(8):e0201174.

21. GE Healthcare UK Limited. Whatman FTA cards. [Internet]. 2011 [cited 2018 Dec 29];Available from:

https://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/manual/pdf/28984354%20AA_FTA%20Ca rdsDataSheet.pdf.

22. Schroeder A, Mueller O, Stocker S, et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol 2006;7:3.

23. Illumina, Inc. RNA-Seq ~研究に合わせたアプリケーションの選び⽅~ [Internet].

2014 [cited 2018 Dec 26];Available from: https://jp.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/apac/japan/documents/pdf/2015_techsupport_session7.pdf.

24. Strand C, Enell J, Hedenfalk I, Fernö M. RNA quality in frozen breast cancer samples and the influence on gene expression analysis--a comparison of three evaluation methods using microcapillary electrophoresis traces. BMC Mol Biol 2007;8:38.

25. Mueller O, Lightfoot S, Schroeder A. RNA Integrity Number (RIN) – Standardization of RNA Quality Control [Internet]. RNA Integr. Number RIN – Stand. RNA Qual. Control.

2004 [cited 2019 Jan 18];Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/5989-1165EN.pdf

26. Martin NM, Cooke KM, Radford CC, Perley LE, Silasi M, Flannery CA. Time course analysis of RNA quality in placenta preserved by RNAlater or flash freezing. Am J Reprod Immunol N Y N 1989 2017;77(4).

27. Sinha R, Chen J, Amir A, et al. Collecting Fecal Samples for Microbiome Analyses in Epidemiology Studies. Cancer Epidemiol Biomark Prev Publ Am Assoc Cancer Res Cosponsored Am Soc Prev Oncol 2016;25(2):407–16.

28. Nechvatal JM, Ram JL, Basson MD, et al. Fecal collection, ambient preservation, and DNA extraction for PCR amplification of bacterial and human markers from human feces.

J Microbiol Methods 2008;72(2):124–32.

29. Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ. Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease. Biochemistry 1979;18(24):5294–

30. Lader ES. Methods and reagents for preserving RNA in cell and tissue samples. U.S.

Patent 6,528,641B2 [Internet]. 2003 [cited 2019 Jan 18];Available from:

https://patents.google.com/patent/US6528641B2/en

31. GE Healthcare UK Limited. FTA cards: high-quality media for storage and transport of DNA [Internet]. 2015 [cited 2018 Dec 29];Available from:

https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf/29156954AA_FTA_Whitepaper.pdf 32. Jones S, Sutherland CJ, Hermsen C, et al. Filter paper collection of Plasmodium falciparum mRNA for detecting low-density gametocytes. Malar J 2012;11:266.

33. Seelenfreund E, Robinson WA, Amato CM, Tan A-C, Kim J, Robinson SE. Long term storage of dry versus frozen RNA for next generation molecular studies. PloS One 2014;9(11):e111827.

36 10. 図・

図1. 実験の流れ本研究は、図1の流れで行った。 FTA card : FTA Classic Card, RNAlater : RNAlater Stabilization Solution, TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX: MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

9. 図・表

37 図 2. FTA Card

核酸安定化製品の一種である FTA Card を本研究の糞便検体の採取に使用した。

FTA card : FTA Classic Card

図 3. RNA 抽出キット別のイヌ糞便検体から抽出した RNA の濃度の比較

4 種類の RNA 抽出キットにおいて、TRIzol で最も高濃度な RNA が抽出された。RNA 濃度の中央値を赤い線で示す。

* : p 値 < 0.02, ** : p 値 < 0.01

TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX : MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図 4. RNA 抽出キット別のイヌ糞便検体から抽出した RNA の純度の比較

4 種類の RNA 抽出キットにおいて、MoBio はタンパク質の混入が少ないだけではなく、最も有機化合物などの残留が少なく、高純度な RNA を抽出した。RNA の純度の中央値を赤い線で示す。

** : p 値 < 0.01

TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX : MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図 5. RNA 抽出キット別のイヌ糞便検体から抽出した RNA の RIN の比較

RIN の結果より 4 種類の RNA 抽出キットにおいて抽出した RNA の RIN は、いずれも低値であった。RIN の中央値を赤い線で示す。

TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX : MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図6.電気泳動によるRNA抽出キット別のイヌ糞便検体から抽出したRNAの品質の比較いずれのRNA抽出キットにおいても、抽出したRNAのバンドは確認できなかった。 PC1・2 : ヒト由来の細胞株から抽出されたRNA, NC : 各RNA抽出キットを用いて糞便検体の代わりに各RNA溶出緩衝液から抽出した抽出液, TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX : MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図 7. 抽出対象別の RNAlater を用いて保存したイヌ糞便検体の RNA 濃度の比較

RNAlater に保存され、沈殿物から抽出した RNA においては、RNAlater に保存され、上清から抽出した RNA と比べて高濃度な RNA を抽出した。上清から抽出した RNA においては、全 5 標本中 5 標本で RNA 濃度が検出限界以下であった。

** : p 値 < 0.01

RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

図 8. RNAlater による希釈倍率別のイヌ糞便検体の RNA 濃度の比較

1 倍量の希釈倍率の RNAlater に保存され、抽出した RNA においては、

3 倍量の希釈倍率に対して約 2 倍以上の RNA 濃度であった。RNA の濃度の中央値を赤い線で示す。

** : p 値 < 0.01

RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

図 9. RNAlater による希釈倍率別のイヌ糞便検体の RNA 純度の比較

1 倍量の希釈倍率および 3 倍量の希釈倍率の RNAlater に保存され、抽出した RNA において、いずれもタンパク質の混入は認められなかった。

一方で有機化合物などの残留は 1 倍量の希釈倍率および 3 倍量の希釈倍率でいずれも認められ、3 倍量の希釈倍率では比較的著しい汚染が認められた。RNA 純度の中央値を赤い線で示す。

* : p 値 < 0.02

RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

図 10. RNAlater によるイヌ糞便検体の希釈濃度の違いによる RIN の比較

1 倍量の希釈倍率および 3 倍量の希釈倍率の RNAlater に保存され、抽出した RNA の RIN は、いずれも低値であった。RIN の中央値を赤い線で示す。

RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

図 11. RNA 抽出キット別の FTA card を用いて保存されたイヌ糞便検体の RNA の濃度の比較

4 種類の RNA 抽出キットのうち、TRIzol により抽出した RNA が最も高濃度であった。Zymo で抽出した 5 標本中 3 標本の RNA の濃度は、検出限界以下であった。RNA 濃度の中央値を赤い線で示す。

** : p 値 < 0.01

FTA card : FTA Classic Card, TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX : MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図 12. RNA 抽出キット別の FTA card を用いて保存されたイヌ糞便検体の RNA の純度の比較

4 種類の RNA 抽出キットのうち、MoBio ではタンパク質の混入が少ないだけではなく、最も有機化合物などの残留が少なく高純度な RNA が抽出された。RNA 純度の中央値を赤い線で示す。Zymo において検出限界以下の RNA 濃度であった 3 標本は、RNA そのものの純度を反映していないとして、RNA 純度を評価しなかった。

** : p 値 < 0.01

FTA card : FTA Classic Card, TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX : MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図 13. FTA card 内に保存されたイヌ糞便検体を用いた各 RNA 抽出キットにおける RNA の RIN の比較

MoBio の 5 標本および Zymo の 1 標本においては高い RIN を認めた。しかし、

Zymo の 5 標本中 3 標本は RNA 濃度が RIN の算出限界以下の濃度であったため、RIN の算出ができなかった。RIN の中央値を赤い線で示す。

* : p 値 < 0.02, ** : p 値 < 0.01

FTA card : FTA Classic Card, TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX : MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図14. 電気泳動によるRNA抽出キット別のイヌ糞便検体のRNAの品質の比較 MoBioで抽出したRNAにおいて2本のバンドを確認した。しかし確認された2本のバンドは、陽性コントロールのバンドの位置よりも低い位置であった。一方、他の3種類のRNA抽出キットにおいては、明確なバンドは確認できず、陽性コントロール付近にスメア状のブロードバンドを確認した。 PC1・2 : ヒト由来の細胞株から抽出されたRNA, NC1 : 糞便検体の代わりに何も塗布していないFTA cardから抽出された抽出液, NC2 : 糞便検体の代わりにUltraPure DNase / RNase-Free Distilled Waterから抽出された溶出液, FTA card : FTA Classic Card, TRIzol : TRIzol LS Reagent, MoBio : RNeasy PowerMicrobiome Kit, MagMAX: MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit, Zymo : Quick-RNA Miniprep Kit

図 15. FTA card および RNAlater を用いた保存方法別のイヌ糞便検体の RNA 濃度の比較

RNAlater から抽出した RNA に比べ、FTA card から抽出した RNA は高濃度であった。RNA の濃度の中央値を赤い線で示す。

** : p 値 < 0.01

FTA card : FTA Classic Card, RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

図 16. FTA card および RNAlater を用いた保存方法別のイヌ糞便検体の RNA 純度の比較

タンパク質の混入は FTA card から抽出した RNA および RNAlater から抽出した RNA のどちらにも認められなかった。一方で、有機化合物などの残留は RNAlater で認められたものの、FTAcard では認められなかった。RNA の純度の中央値を赤い線で示す。

** : p 値 < 0.01

FTAcard : FTA Classic Card, RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

図 17. FTA card および RNAlater による保存方法別のイヌ糞便検体の RIN の比較

FTA card から抽出した RNA では RNAlater から抽出した RNA に比べて、より高い RIN を示していた。RIN の中央値を赤い線で示す。

FTA card : FTA Classic Card, RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

図 18. 電気泳動による FTA card および RNAlater における保存方法別のイヌ糞便検体の RNA の品質の比較

FTA card から抽出した RNA においてのみ 2 本のバンドを確認した。しかし確認された 2 本のバンドは、陽性コントロールのバンドの位置よりも低い位置であった。一方 RNAlater から抽出した RNA においては、明確なバンドは確認できず、陽性コントロール付近にスメア状のブロードバンドを確認した。

NC1 : 糞便検体の代わりに UltraPure DNase / RNase-Free Distilled Water から抽出された抽出液, NC2 : 糞便検体の代わりに RNAlater から抽出された抽出液, PC1・2 : ヒト由来の細胞株から抽出された RNA, FTA card : FTA Classic Card, RNAlater : RNAlater Stabilization Solution

ドキュメント内高品質なRNAの回収のための糞便検体の保存およびRNA抽出方法 (ページ 37-64)