第 4 章 三次元培養モデルによる転写因子活性化の評価
4.2 実験材料・方法
4.2.1 試験シガレットおよびAqCSEの調製
被験シガレット3R4FのAqCSEは2.2.4項と同様の方法で調製した。
4.2.2 HBECsの三次元培養
Lonza から購入した初代正常 HBECs (Lot:CC-2540S, donor; 29 歳男性) を、Supplement Pack (Promocell) を加えたAEGM培地 (Promocell) に懸濁させ、type I collagenをコートしたフラスコ上 で培養した。三次元培養には、HBECsをAEGM培地に3.0 × 105 cells/mlの濃度で懸濁させ、type IV collagen (Nitta Gelatin) をコートしたインサート (pore size 0.4 μm, Corning, Corning, NY) に播種
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した。細胞を播種したインサートは 24-well プレートにセットし、37°C、5% CO2下でコンフル エントに達するまで培養した。コンフルエントに達した HBECs は、インサート上の培地を除去 し、hydrocortisone (Stemcell Technologies, Vancouver, Canada) とheparin (Stemcell Technologies) を 加えたPneumaCult–ALI medium (Stemcell Technologies) を24-well プレートに加え、インサート底 面から培地を供給し ALI で培養した。インサート底面の培地は 2日または 3 日おきに交換し、
21日から23日間培養し、粘液線毛細胞に分化させた103)。
4.2.3 三次元培養HBECsの細胞障害性試験
三次元培養HBECsの細胞障害性評価として、アデニル酸キナーゼ (adenylate kinase: AK) 活性 を測定した。三次元培養した HBECs の基底面の培地を除去し、AqCSE または Triton X を含む AEGM 培地を加え、24 時間インキュベーター中で曝露した。曝露後の被験液を回収し、
ToxiLight bioassay kit (Lonza) に添付のAK detection reagentと15分間反応させた後、損傷した細 胞から放出された AK の酵素活性に相当する発光値を測定した。統計解析は、Dunnett 法を用い、
溶媒対象コントロールとの有意差を多重検定した。
4.2.4 転写因子タンパク質発現の測定
三次元培養した HBECs の基底面の培地を除去し、AqCSEを含む AEGM 培地を加え、6 時間 インキュベーター中で曝露した。被験液を除去し、PBSで洗浄後、細胞上面から、mRIPA buffer
を50 μl/well加え、ピペッティングにより細胞を回収した。回収した細胞溶解液は、2.2.8項と同
様の方法で、ウエスタンブロッティングに供したが、変更点として、電気泳動ゲルには Any kD™ Mini-PROTEAN® TGX™ Precast Protein Gels (Bio-Rad) 、 ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 に は PVDF Blocking Reagent (Toyobo) 、1次抗体および2次抗体の希釈液にはCan Get Signal Solution (Toyobo) を用いた。また、1次抗体は以下のものを、2次抗体は2.2.8項と同様のものを用いた。
o Anti-NRF2 rabbit antibody: ab62352, Abcam
o Anti-NF-κB (p65) rabbit antibody: #8242S, Cell Signaling Technology o Anti-phospho-p65 rabbit antibody: #3033S, Cell Signaling Technology o Anti-c-Jun rabbit antibody: ab32317, Abcam
o Anti-GAPDH mouse antibody: #3033S, Cell Signaling Technology
52 4.2.5 免疫組織染色
三次元培養した HBECs の基底面の培地を除去し、AqCSE を含む AEGM 培地を加え、6 時間 インキュベーター中で曝露した。被験液を除去し、PBS で 2 度洗浄後、4% paraformaldehyde を 細胞基底面に加え、4°Cでインキュベートした。固定された細胞は、パラフィンに包埋し、ミク ロトームを用いて 5 μm の厚さで切片を作製した。続いて切片を脱パラフィンし、hematoxylin
and eosin (H/E) 染色を行った。また、免疫染色においては、脱パラフィンした切片を、1 mMの
I-EDTA pH8.0 (Nacalai Tesque) 中で、90°Cで15分間熱処理し、抗原の賦活化を行った。次いで、
100倍希釈したanti-NRF2 rabbit antibody (ab62352, Abcam) またはanti-NF-κB (p65) rabbit antibody (#8242S, Cell Signaling Technologies) と切片を室温で1時間または4°Cで24時間インキュベート した。続いて切片を PBSで洗浄後、200倍希釈したAlexa Fluor 555をコンジュゲートしたdonkey anti-rabbit antibody (A-31572, Thermo Fisher Scientific) と室温で1時間インキュベートした。さら に切片を PBS で洗浄した後、標本を蛍光顕微鏡用の DAPI (Thermo Fisher Scientific) を含む Antifade Reagent proLong Gold にマウントし、KEYENCE BZ-9000 蛍光顕微鏡 (Keyence, Osaka,
Japan) により蛍光画像を得た。NRF2およびNF-κB (p65) の観測には励起波長470 nmおよび蛍光
波長535 nm、核の観測には励起波長360 nmおよび蛍光波長460 nmを用いた。
4.2.6 PCRアレイによる遺伝子発現測定
三次元培養した HBECsの基底面の培地を除去し、AqCSEを含む成長培地を加え、6時間イン キュベーター中で曝露した。被験液を除去し、PBS で 2 度洗浄後、細胞上面から Buffer RPE
(Qiagen) を 50 μl 加え、ピペッティングにより全量をチューブに回収した。細胞溶解液からの
total RNA の回収は、RNeasy® Mini Kit (Qiagen) を用い、回収した total RNA は濃度調整後、
SuperScript™ IV VILO™ Master Mix (Thermo Fisher Scientific) を用いてcDNAとした。
酸化ストレス関連遺伝子の測定には、Human Oxidative Stress RT² Profiler PCR Array (Ox-Array, Qiagen) を用い、ALB
、
ALOX12、
AOX1、
APOE、
ATOX1、
BNIP3、
CAT、
CCL5、
CCS、
CYBB、
CYGB、
DHCR24、
DUOX1、
DUOX2、
DUSP1、
EPHX2、
EPX、
FOXM1、
FTH1、
GCLC、
GCLM、
GPX1、
GPX2 GPX3、
GPX4、
GPX5、
GPX6、
GPX7、
GSR、
GSS、
GSTP1、
GSTZ1、
HMOX1、
HSPA1A、
KRT1、
LPO、
MBL2、
MPO、
MPV17、
MSRA、
MT3、
NCF1、
NCF2、
NOS2、
NOX4、
NOX5、
NQO1、
NUDT1、
OXR1、
OXSR1、
PDLIM1、
PNKP、
PRDX1、
PRDX2、
PRDX3、
PRDX4、
PRDX5、
PRDX6、
PRNP、
PTGS1、
PTGS2、
RNF7、
SCARA3、
SEPP1、
SFTPD、
SIRT2、
SOD1、
SOD2、
SOD3、
SQSTM1、
SRXN1、
STK25、
TPO、
TTN、
TXN、
TXNRD1、
TXNRD2、
UCP2および53
VIMPを対象遺伝子とし、ABI 7900 PCRシステム (Thermo Fisher Scientific) により測定した。炎 症関連遺伝子の測定は、NF-κB Signaling Pathway Plus RT2 Profiler PCR Array (NF-κB Array, Qiagen) を用い、AGT
、
AKT1、
ATF1、
BCL2A1、
BCL2L1、
BCL3、
BIRC2、
CARD11、
CASP1、
CASP8、
CCL2、
CCL5、
CD40、
CFLAR、
CHUK、
CSF1、
CSF2、
CSF3、
EGFR、
EGR1、
IKK1、
IL1A、
IL1B、
IL1R1、
IRAK1、
IRAK2、
JUN、
LTA、
LTBR、
MALT1、
MAP3K1、
MYD88、
NFKB2、
NOD1、
PSIP1、
RAF1、
REL、
RELA、
RELB、
RHOA、
RIPK1、
STAT1、
TBK1、
TICAM1、
TIMP1、
TLR1、
TLR2、
TLR3、
TLR4、
TLR6、
TLR9、
TNFRSF10A、
TNFRSF10B、
TNFRSF1A、
TNFSF10、
TRADD、
TRAF2、
TRAF3、
TRAF6、
BIRC3、
CCL20、
CXCL2、
CXCL3、
ICAM1、
CXCL8、
IRF1、
NFKB1、
NFKBIA、
NFKBIE、
STX11、
TIFA、
TNF、
TNFAIP2 および TNFAIP3 を対象遺伝子とした。それぞれのArrayは、ハウスキーピング遺伝子としてACTB
、
B2M、
GAPDH、
HPRT1、
RPLP0およびHGDC を対象遺伝子として含み、それぞれの遺伝子の発現量は、ハウスキーピング遺伝子の発 現量により標準化した。
PCR後のアレイは、Qiagenが提供するRT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5を使用し て定量化した。遺伝子発現結果は、溶媒対象コントロールからの倍数変化 (log2 (fold-change)) お よびt検定統計値 (–log10 (p-value)) を用い、Volcano plotにより解析した。考察においては、明確 に変動の見られた遺伝子に着目するため、t検定のp値 ≦ 0.005および倍数変化 ≧ 4以上の変動 を示した遺伝子に焦点をあてた104)。
NF-κB Arrayに含まれる遺伝子は、IPAを用い、IPAデータベース上にそれぞれの遺伝子の転
写制御因子として、 NF-κBのみ報告されているもの、NF-κBに加えてAP-1あるいはNRF2、ま たはその両方が報告されているものに分類し、ヒートマップを作製した。
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