本研究において私は、新規Shh経路の解析を目的としてPatched1遺伝子、並びにヒト 培養細胞において任意の遺伝子を安定的に発現させることを目的としてAAVS1領域を標的 に設定し、TALENコンストラクトを作製した。作製後、切断活性を評価するSSAアッセ イを行った結果、Patched1遺伝子のexon14、AAVS1領域でそれぞれ2種類のコンストラ
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クトに活性が認められた (Figure. 1-4)。次に、高い切断活性が得られたコンストラクトを 利用して、ゲノム遺伝子改変を試みた。しかし、genomic PCRによる変異細胞のスクリー ニングの結果、遺伝子改変が成功した細胞株を得ることはできなかった (Figure. 5)。
遺伝子改変が成功しなかった理由として、標的として設定した生物種や遺伝子によって
TALENの切断活性に著しい差異が生じてしまうことが考えられる。切断活性の不安定性に
関しては、その原因も含めて未だ体系的な理解は完全にはなされていない。しかし、ゲノ ムDNAに対する核内修飾についての見地と先行研究による経験則から、幾つかの原因と傾 向が示唆されている。
切断活性に差異が生じる主要な原因として、2本鎖DNAが受ける核内修飾があげられる。
例えば、DNAのクロマチン構造やメチル化の形成である[20, 21]。TALENが2本鎖DNA を切断し変異を導入するためには、塩基認識ドメインを介してゲノム上の認識配列と結合 する必要がある。そのため、認識配列周辺のDNA2本鎖は、TALENと結合できる様オー プンクロマチン構造にならなくてはならない。しかし、クロマチン形成やメチル化によっ て塩基配列が収納されてしまった場合、TALENは標的配列に結合することができなくなり、
結果として切断活性は著しく低下すると考えられた。
クロマチン形成などのDNA修飾以外にも、作製したTALENの設計によって切断活性は 大きく変化することが分かっている。例えばモジュール配列にNNとNIが多く含まれる場 合や、NNが３つ以上連続している場合は、高い活性を有するTALENが得られにくい傾向 にある。特に、NNの認識特異性は他のモジュールと比較して低いことが知られており、G 塩基に加えてA塩基も認識してしまうことが知られている[22]。実際に本研究においても、
SSAアッセイにより高い活性が得られたコンストラクトでは、NNとNIの数、またNNが 3つ以上連続している配列が、活性の認められなかったコンストラクトと比較して少なかっ た。
TALENの切断活性と設計、標的配列等の関係性については徐々に明らかにされ始め、そ
れに伴いTALEN作製の手順に関して幾つかの改良がなされている。その結果、切断活性
や塩基認識の特異性の向上が認められている。例えば、塩基認識特異性の低いNNモジュ ールの代わりに、より特異性の高いNH及びNKモジュールが開発され、TALENの切断 活性の向上に成功したことが報告されている[22]。また、TALENの制限酵素活性ドメイン であるFok Iのアミノ酸配列に一部変異を導入することで、TALENタンパク質が認識配列 以外の領域でホモダイマーを形成する確率を低下させ、結果としてオフターゲット効果を 低減させることにも成功している[23]。さらに、オリジナルのTALEN scaffoldからN末端・
C末端ドメインを部分的に欠失させた「deletion scaffold」を利用することで、左右TALEN のモジュール数が異なり、かつスペーサー長が15 bpである標的部位に対して、切断活性 が飛躍的に上昇することが報告されている[18]。加えて、広島大学の山本らは、2013年に
Platinum TALENという改良型TALENを利用した新しい手法を発表した。Platinum
TALENは、34アミノ酸残基からなる塩基認識モジュールの4番目と32番目のアミノ酸残
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基を改変することによって、より高い切断活性を得たTALENである[24]。現在TALENを 用いた遺伝子改変ではこのPlatinum TALENを利用した手法が非常に早い速度で普及して いる。本研究において私はTALENを用いた遺伝子改変に成功することができなかったが、
今後はPlatinum TALENを利用することで効率的に遺伝子改変を行うことができるのでは
ないかと考える。
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Figure S10 TALEN の塩基認識ドメインとモジュール
モジュールは34個のアミノ酸からなる。塩基の認識は、N末端側から12,13番目のアミ ノ酸配列により行われる。
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Figure S11 TALEN 発現ベクターの作製
モジュールを組み合わせて6モジュールを作製し、作製した6モジュールを
さらに組み合わせることによって (Golden gate法)、TALEN発現ベクターは完成する。
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0 20 40 60 80 100 120
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