39
40
実験の材料と方法
DNA コンストラクトの作成
・pGEX-6p-p54nrb
このプラスミドは本研究室の谷口一郎博士から分与していただいた。ヒト p54nrb は HeLa cDNA libraryからPCRにより増幅し、pGEX-6pベクターのBamHⅠおよびXhoⅠ 認識部位に挿入した。
・pET15-PSF
このプラスミドは産業技術総合研究所の富田耕三博士から分与していただいた。
・pUC118-U1 ⊿Sm
U1 ⊿Sm を発現するコンストラクトからEcoRV と HindⅢによって切り出し、pUC ベクターの同認識部位に挿入した。さらにU1プロモーターをヒトゲノムからPCRにより 増幅し、pUC118-U1 ⊿SmのEcoRⅠおよびEcoRⅤ認識部位に挿入した。
レコンビナントタンパク質の発現と精製
・レコンビナントp54nrb
ヒトの p54nrb cDNA がクローニングされた pGEX-6p-1 ベクター（Amersham Bioscience）をタンパク質発現用の大腸菌BL21(DE3)codon plus-RIL（STRATAGENE）
に形質転換した。そしてその大腸菌を2lのLB/Amp培地中でOD600が0.6になるまで振 盪培養し、IPTGを最終濃度0.1mMになるように加え、さらに30℃で6時間培養した。そ の後、大腸菌を5,000rpm,10分間遠心を行うことにより回収した。大腸菌をPBSでけん濁、
洗浄後、再び遠心により回収し、凍結保存した。大腸菌を融解後、bufferA（20mM Tris-HCL[pH7.5]、500mM NaCl、1mM DTT、1mMEDTA、0.1% NP-40、10% glycerol）
にけん濁した。そして、大腸菌をフレンチプレスにより破砕後、15,000rpm、30 分間遠心
41
し、上清を回収した。あらかじめ、bufferA で平衡化した Glutathione Sepharose 4B
（Amersham Biosciences）ビーズに、回収した上清を加え、4℃で1時間転倒混和した。
その後、ビーズをbufferAで4回洗浄後、bufferB（20mM Tris-HCL[pH7.5]、100mM NaCl、
1mM DTT、1mMEDTA、10% glycerol）で2回洗浄した。p54nrbを精製するために、タ ンパク質をビーズに結合させたまま、PreScissionproteaseを添加し、4℃で2日間保温し、
GSTタグを切断した。さらに、HiTrap Hisカラムによりさらに精製した。精製後、bufferB に対して透析し、凍結保存した。
・レコンビナントPSF
ヒトのPSF cDNAがクローニングされたpET-15ベクターをタンパク質発現用の大腸 菌BL21(DE3)codon plus-RIL（STRATAGENE）に形質転換した。そしてその大腸菌を2l のLB/Amp培地中でOD600が1.0になるまで振盪培養し、IPTGを最終濃度0.1mMにな るように加え、さらに20℃で20時間以上培養した。その後、大腸菌を5,000rpm,10分間 遠心を行うことにより回収した。大腸菌をPBSでけん濁、洗浄後、再び遠心により回収し、
凍結保存した。大腸菌を融解後、bufferC（50mM Tris-HCL[pH8.0]、500mM NaCl、1mM DTT、2mM be-ta-mercaptoethanol、20mM Imidazol、0.1% NP-40、10% glycerol）にけ ん濁した。そして、大腸菌をフレンチプレスにより破砕後、15,000rpm、30 分間遠心し、
上清を回収した。あらかじめ、bufferCで平衡化したNi-NTA（QIAGEN）ビーズに、回収 した上清を加え、4℃で1 時間転倒混和した。その後、ビーズを bufferC で 4 回洗浄後、
imidazol濃度が500mMのbufferCで溶出した。最後にbufferD（20mM Tris-HCL[pH8.5]、
250mM NaCl、6mM be-ta-mercaptoethanol、10% glycerol）対して透析し、凍結保存し た。
・レコンビナントPHAX、CRM1、Ran、CBP20、CBP80
これらのレコンビナントの発現・精製は以前に行われた方法に従った(Ohno et al.,2000)。
42
GST プルダウン
Glutathione Sepharose 4Bに32P標識したA-cap DHFR mRNA、Ftz mRNA、A-cap U1+50 snRNA、U1 snRNAおよび、10%HNE、GST-PHAX（0.2μM）、CBC（0.2μM）、
tRNA（0.8mg/ml）とPBSを加え4℃、1時間、転倒混和しビーズにGST-PHAXを固定し た。その後、ビーズをRSB100N（10mM Tris-HCl、2.5mM MgCl2、100mM NaCl、0.1％
NP-40）で4回洗浄し、HomoMix（50mM Tris[pH7.4]、5mM EDTA、1.5%SDS、300mM NaCl、1.5mg/ml Proteinase K）にビーズをけん濁、振倒し、フェノール/クロロホルム処 理、エタノール沈澱を行った。以上のように抽出したRNAをRNA dye（95% Fomamide、
0.05% SDS、0.05% Xylenecyanol FF、0.05% Bromophenol blue）に溶かし、7Mの尿素 を含む変性ポリアクリルアミドゲル（PAGE）で電気泳動し、オートラジオグラフィーで解 析を行った。
ゲルシフトアッセイ
32P標識したU1 snRNAとレコンビナントタンパク質、T buffer（40 mM Hepes-KOH [pH 7.3], 110 mM KOAc, 6 mM Mg(OAc)2）、0.8mg/ml tRNA、を混合し、25℃で40分 間保温した。保温後、サンプルを非変性 6%のアクリルアミドゲルに泳動し、オートラジオ フラフィーで解析を行った。シグナルの解析は、BAS-2500 (FujiFilm)を用いて行った。
タンパク質相互作用の解析
GST-PHAXを固定したGlutathione Sepharose 4Bに、レコンビナントp54nrb、PSF およびRSB100Nを加え、を加え、4℃、1時間転倒混和した。その後、ビーズをRSB100N
（10mM Tris-HCl、2.5mM MgCl2、100mM NaCl、0.1％NP-40）で4回洗浄しビーズか らタンパク質を2×SDS PAGE サンプルバッファー（0.125M Tris-HCl
(pH6.8)、10%β-43
メルカプトエタノール、4％SDS、10%スクロース、0.004％ブロモフェノルブルー）で溶
出し、SDS-PAGEを行った。シグナルの検出はウエスタンブロッティング法により行った。
ウエスタンブロッティング
SDS-PAGE 終 了 後 、 ゲ ル 中 に 存 在 す る タ ン パ ク 質 を Nitrocellulose Transfer Membrane(Schleicher & Schuell)に転写した。転写は0.8から2mA/cm2で1時間程度行っ た。次に、メンブレンをスキムミルク溶液（5% non-fat dry milk）で1時間ブロッキング 後、1次抗体と1時間室温で保温した。そして、メンブレンを0.1％のNP40を含んだPBS で3回洗浄し、HRP（Horseradish Peroxidase）を標識したマウスのIgGに対する抗体を 2次抗体として(Jackson ImmunoReserch）、室温で1時間保温した。その後、メンブレン を先ほどと同様に3回洗浄し、最後にPBSで洗浄後、ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham Biosciences)でシグナルを検出した。
免疫沈降法
レコンビナントp54nrb、PSF、CRM1、Ran、hnRNPA1とそれぞれの抗体を結合さ せたProtein A Sepharose (GE Health care)と混合し1mg/ml RNase A存在下で、4℃、60 分間転倒混和した。その後Peotein A SepharoseをRSB150Nで洗浄し、ウエスタンブロッ ティングにより解析を行った。
FLAG 抗体を用いた免疫沈降法
FLAG-PHAXを発現するプラスミドをLipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)を用 いてHeLa細胞にトランスフェクションした。24時間後にHeLa細胞をPBSで2回洗浄 し、1% ホルムアルデヒドで10分間クロスリンクを行った。終濃度が0.15Mになるように glycine (pH 7.0)を加え5分間保温した。その後、PBSで2回洗浄しHeLa細胞を回収した。
44
ANTI-FLAG M2 Agarose from mouse(SIGMA)をRSB100Nで2回洗浄後、HeLa細 胞の細胞抽出液を加え4℃、60 分間転倒混和した。その後、アガロースを RSB100Nで4 回洗浄し、2×SDS PAGEサンプルバッファーでタンパク質を溶出し、SDS-PAGEで分離 した。そして、ウエスタンブロッティング法によりシグナルを検出した。
抗体
FLAFペプチド、hnRNP C1/C2、p54nrb、PSF、GAPDHに対するモノクローナル 抗体はそれぞれ、M2（Sigma）、4F4（Sigma）、3/p54nrb（BD）、B92（Sigma）、HyTest
(6C5)を用いた。PHAX に対するポリクローナル抗体は His-PHAX で免疫したラビットか
ら血清を回収し、GST-PHAXを用いてアフィニティー精製を行い調整した。
試験管内転写
試験管内転写は、T7 RNAポリメラーゼ（Promega）を用いて、10μℓの反応系で行っ た。0.1μg/μℓ の DNA、0.5mM ATP、0.5mM CTP、0.5mM GTP、0.5mM UTP、1mM m7GpppG RNA cap structure Analog（NEB）、1.2U/μℓ RNasin（Promega）、1.5U/μℓ RNA ポリメラーゼ、[α-32P]UTP（GE Healthcare）、ポリメラーゼに添付のbufferを混合し、
37℃で 60 分間保温した。キャップ構造を付加しない RNA の転写反応の場合は、Cap Strucure Analogを除き、0.5mM GTPの反応条件で行った。
アフリカツメガエル卵母細胞の摘出
アフリカツメガエルを0.4パーセントのMS222に15分間浸し麻酔処理を行い、腹部 より卵母細胞を摘出した。卵母細胞をBarth buffer（10mM HEPES[pH7.6]、88mM NaCl、
1mM KCl、0.82mM MgSO4、2.4mM NaHCO3）で洗浄の後に、5mg/mlのCollagenase B
（Roche）処理を60分間室温で行った。Barth+Ca buffer（Barth buffer+4mM CaCl2、
45
3.4mM Ca(NO3)2、10μg/ml Ampicillin、10μg/ml Streptomycin）で洗浄し、19℃で2時 間以上保温し、顕微鏡注入実験を行った。
アフリカツメガエル卵母細胞への RNA の微量注入
RNAの微量注入実験は以前に行われた方法に従った（Jarmolowski et al.,1994）。以 下に簡単に示す。試験管内転写によって合成したRNAを、RNasin 2U/μl、Blue Dextran
（MW 2,000,000、Sigma）を7.5 μg/μlになるように加えて顕微注入のサンプルを調製した。
卵 母 細 胞 に サ ン プ 約 33nℓ を 微 量 注 入 し た 。 一 定 時 間 の 保 温 後 、J buffer（10mM Hepes[pH7.6]、70mM NH4Cl、7mM MgCl2、0.1mM EDTA、10%glycerol）内で卵母細 胞を核と細胞質とにピンセットにより分離し、HomoMix（50mM Tris[pH7.4]、5mM EDTA、
1.5%SDS、300mM NaCl、1.5mg/ml Proteinase K）にそれぞれ画分をけん濁、振倒し、
フェノール/クロロホルム処理、エタノール沈澱を行った。以上のように抽出した RNA を RNA dye（95% Fomamide、0.05% SDS、0.05% Xylenecyanol FF、0.05% Bromophenol blue）
に溶かし、7Mの尿素を含む変性ポリアクリルアミドゲル（PAGE）で電気泳動し、オート ラジオグラフィーで解析を行った。
リアルタイム PCR
HeLa細胞からのtotal RNAの抽出はSepasolRNAI Super (Nacalai Tesque)を用いて 行った。抽出したRNAは、RQ1RNase-Free DNase (Promega) により処理した。
リアルタイム PCR は SuperScriptIII Platinum SYBRGreen One-Step qRT-PCR (Invitrogen) を用い、7500 RealTime PCR System(Applied Biosystems)で検出した。使用 したプライマーは以下に示す。
Pre-U1: CAGGGCGAGGCTTATCCATTG, AACTCCAGAAAGTCAGGGGAAAG.
Pre-U4atac: GGCAGTACTGCTAACGCCTG, CTGCTGTTTGAACTGATAAG.
46
GAPDH: ATGAGAAGTATGACAACAGCCTCAA, AGTCCTTCCACGATACCAAAGTT.
siRNA を用いたノックダウン
StealthTMRNAi は invitrogen から購入した。それぞれの標的配列は以下に示す。
StealthTMRNAi の HeLa 細胞へのトランスフェクションは Lipofectamine RNAiMAX (invitrogen)を用いて行った。
p54nrb ; GGUGCAUUCCUGAAGUCUCUAAUGU PSF ; GGAGGCCCGCCGCCUCCGCCCGCGG PHAX ; ,UUCAUUUCUGGUCUGUUCCCUAGCC control ; GCAUCGAAGUAUUCCGCGUACGAAG
免疫染色
HeLa細胞を 8-well glass chamber slide (Nunc) で培養し、PBS+4%ホルムアルデヒ ドで20分間固定処理を行った。PBS＋0.5% Triton X-100で透過処理をし、PBSで室温10 分×2回洗浄した後に、PBS＋3% BSAで30分間ブロッキングした。一次抗体を加え一時 間保温した後に TBS＋0.1% Tween-20 で洗浄した。二次抗体として Alexa569-または Alexa400-を用い DAPI 染色を行った。抗体反応したのちのスライドは Fluorescent Mounting Media (CALBIOCHEM) でマウントした。
顕微鏡観察は倒立顕微鏡で室温にて行った( Axio Observer Z1; Carl Zeiss, Inc.)。画像 はAxioVision software (version 4.7; Carl Zeiss, Inc.)を使い、カメラ(AxioCam MRm; Carl Zeiss, Inc.)で撮影した。
47
参考文献
Arts,G.J.,Fornerod,M.,and Mattaj,I.W.(1998a).Identification of a nuclear export receptor for tRNA. Curr Biol 8,305-314.
Arts,G.J.,Kuersten,S.,Romby,P.,Ehresmann,B.,and Mattaj,I.W.(1998b).The role of exportin-t in selective nuclear export of mature tRNAs. EMBO J 17,7430-7441.
Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ.(2001). Role for a
bidentateribonuclease in the initiationstep of RNA interference. Nature 409,363-6.
Bohnsack,M.T.,Regener,K.,Schwappach,B.,Saffrich,R.,Paraskeva,E.,Hartmann,E.,andG orlich,D.(2002).Exp5 exports eEF1A via tRNA from nuclei and synergizes with other transport pathway to confine translation to the cytoplasm. EMBO J 21,6205-6215
Bohnsack MT, Czaplinski K, Gorlich D.(2004)Exportin 5 is a RanGTP-dependent dsRNA-binding protein that mediates nuclear export of pre-miRNAs.RNA185-91
Bond CS, Fox AH. Paraspeckles: nuclear bodies built on long noncoding RNA.(2009). J Cell Biol 186,637-44.
Buxadé M, Morrice N, Krebs DL, Proud CG.(2008). The PSF.p54nrb complex is a novel Mnk substrate that binds the mRNA for tumor necrosis factor alpha.J Viol Chem 283,57-65.
Brennan CM, Gallouzi IE, Steitz JA.(2000).Protein ligands to HuRmodulate its interaction with targetmRNAs in vivo. J Cell Biol.151,1-14.
Calado,A.,Treichel,N.,Muller,E.C.,Otto,A.,and Kutay,U.(2002). Exportin5-mediated nuclear export of eukaryotic elongation factor 1A and tRNA. EMBO J 21,6216-6224 Mol Cell. 2009 Aug 28;35(4):467-78. doi: 10.1016/j.molcel.2009.06.027.
.
48
The transcriptional landscape of the mammalian genome.
Carninci P, Kasukawa T, Katayama S, Gough J, Frith MC, Maeda N, Oyama R, Ravasi T, Lenhard B, Wells C, Kodzius R, Shimokawa K, Bajic VB, Brenner SE. (2005). The transcriptional landscape of the mammalian genome.Science309,1559-63.
Chen LL, Carmichael GG.(2009). Altered nuclear retention of mRNAs containing inverted repeats in human embryonic stem cells: functional role of a nuclear noncoding RNA. Mol Cell35,467-78.
Cheng H, Dufu K, Lee CS, Hsu JL, Dias A, Reed R.(2006).
HumanmRNAexportmachineryrecruited to the 5' end of mRNA.Cell 127,1389-400.
RNA.2002 Sep;8(9):1102-11.
Clemson CM, Hutchinson JN, Sara SA, Ensminger AW, Fox AH, Chess A, Lawrence JB.(2009). An architectural role for a nuclear noncoding RNA: NEAT1 RNA is essential for the structure of paraspeckles.Mol Cell33,717-26.
Emili A, Shales M, McCracken S, Xie W, Tucker PW, Kobayashi R, Blencowe BJ, Ingles CJ.(2002). Splicing and transcription-associated proteins PSF and p54nrb/nonO bind to the RNA polymerase II CTD.RNA 8,1102-11.
Fornerod,M.,Ohno,M.,Yoshida,M.,and Mattaj,I.W.(1997).CRM1 is an export receptor for leucine-rich nuclear export signals.Cell 90,1051-1060.
Fox AH, Lam YW, Leung AK, Lyon CE, Andersen J, Mann M, Lamond AI.(2002).
Paraspeckles: a novel nuclear domain.Curr Biol 12,13-25.
Gadal,O.,Strauss,D.,Kessl,J.,Trumpower,B.,Tollervey,D.,and Hurt,E.(2001).Nuclear export of 60S ribosomal subunits depends on Xpo1p and requires a nuclear export sequence-containing factor, Nmd3p, that associates with the large subunit protein Rpl10p. Mol Cell Biol 10,3405-3415.
Gallouzi IE, Steitz JA.(2001). Delineation of mRNA export pathways by the use of cell-permeable peptides.Science294,1895-901.
49
Hamm,J.,and Mattaj,I.W.(1990).Monomethylated cap structures facilitate RNA export from the nucleus.Cell 63,109-118.
Hata K, Nishimura R, Muramatsu S, Matsuda A, Matsubara T, Amano K, Ikeda F, Harley VR, Yoneda T.(2008). Paraspeckle protein p54nrb links Sox9-mediated transcription with RNA processing during chondrogenesis in mice. J Clin Invest 118,3098-108.
Ho,J.H.,Kallstrom,G.,and Johnson,A.W.(2000).Nmd3p is a Crm1p-dependent adapter protein for nuclear export of the large ribosomal subunit.J Cell Biol 151,1057-1066.
Huang Y, Carmichael GG.(1997). The mouse histone H2a gene contains a small element that facilitates cytoplasmic accumulation of intronless gene transcripts and of unspliced HIV-1-related mRNAs.
Huber,J.,Cronshagen,U.,Kadokura,M.,Marshallsay,C.,Wada,T.,Sekine,M.,and
Luhrmann,R.(1998).Snurportin-1,an m3G-cap-specific nuclear import receptor with a novel domain structure. EMBO J 17,4114-4126.
Huang Y, Steitz JA.(2005). SRprisesalong a messenger'sjourney.Mol Cell.17,613-5.
Izaurralde,E.,Lewis,J.,Gamberi,C.,Jarmolowski,A.,McGuigan,C.,and Mattaj,I.W.(1995).
A cap-binding protein complex mediating U snRNA export.Nature 376,709-712.
Izaurralde,E.,Lewis,J.,McGuigan,C.,Jankowska,M.,Darzynkiewicz,E.,and Mattaj,I.W.
(1994).A nuclear cap binding protein complex involved in pre-mRNA splicing.Cell 78,657-668.
Izaurralde,E.,Stepinski,J.,Darzynkiewicz,E.,and Mattaj,I.W.(1992).A cap binding protein that may mediate nuclear export of RNA polymerase II-transcribed RNAs.J Cell Biol 118,1287-1295.
50
Johnson,A.W.,Lund,E.,and Dahlberg,J.(2002).Nuclear export of ribosomal subunits.
Trends. Biochem Sci 27,580-585
Kaneko S, Rozenblatt-Rosen O, Meyerson M, Manley JL.(2007). The multifunctional protein p54nrb/PSF recruits the exonuclease XRN2 to facilitate pre-mRNA 3' processing and transcription termination. Genes Dev 21,1779-89.
Katahira J, Strässer K, Podtelejnikov A, Mann M, Jung JU, Hurt E.
TheMex67p-mediated nuclear mRNA export pathway is conserved from yeast to human.EMBO J18,2593-609.
Kim,V.N.and Dreyfuss,G.(2001).Nuclear mRNA binding proteins couple pre-mRNA splicing and post-splicing events.Mol Cells 12,1-10.
Kim,V.N.,Yong,J.,Kataoka,N.,Abel,L.,Diem,M.D.,and Dreyfuss,G.(2001).The Y14 protein communicates to the cytoplasm the position of exon-exon junctions.
EMBO J 20,2062-2068.
Kutay,U.,Lipowsky,G.,Izaurralde,E.,Bischoff,F.R.,Schwarzmainer,P.,Hatmann,E.,and Gorlich,D.(1998).Identification of a tRNA-specific nuclear export receptor.
Mol Cell 1,359-369.
Le Hir,H.,Izaurralde,E.,Maquat,L.E.and Moore,M.J.(2000).The spliceosome deposits multiple protein 20-24 nucleotides upstream of mRNA exon-exon junctions.
EMBO J 19,6860-6869.
Li S, Kuhne WW, Kulharya A, Hudson FZ, Ha K, Cao Z, Dynan WS.(2009). Involvement of p54(nrb), a PSF partner protein, in DNA double-strand break repair and
radioresistance.Nucleic Acids Res 37,6746-53.
Lu S, Cullen BR.(2004).Adenovirus VA1 noncoding RNA can inhibit small interfering RNA and MicroRNA biogenesis.J Virol.78,12868-76.