3.1 分析法開発
3.1.1 各血清型検出用プライマーセットのサルモネラに対する感度及び特異性
各血清型検出用プライマーセットのサルモネラに対する感度及び特異性を確認するために，
2.1.6により試験菌株128株を正しく判定できるか確認した．
その結果はTable 4のとおり，主要血清型は，S. Infantisが4株，S. Typhimuriumが11株，残 りの5血清型が1株と目的の血清型の株数は少ないが，全て陽性，その他の試験菌は全て陰性で あり，正しく判定できた．
Table 4 Sensitivity and specificity of each primer sets
Salmonella Number of
serovar strains tested Choleraesuis Dublin Enteritidis Gallinarum Hadar Infantis Typhimurium
Choleraesuis 1 1 0 0 0 0 0 0
Dublin 1 0 1 0 0 0 0 0
Enteritidis 1 0 0 1 0 0 0 0
Gallinarum 1 0 0 0 1 0 0 0
Hadar 1 0 0 0 0 1 0 0
Infantis 4 0 0 0 0 0 4 0
Typhimurium 11 0 0 0 0 0 0 11
Others 108 0 0 0 0 0 0 0
Sensitivity (%) 100 100 100 100 100 100 100
Specificity (%) 100 100 100 100 100 100 100
Number of positive results of target serovar detecting primer pair set
3.1.2 抽出方法の検討
始めに，2.1.2 の 1)にそれぞれ主要血清型を添加した試料を用い，2.1.7 の1)のアルカリ熱抽出 法による DNA 抽出を検討したが，スメアリングにより判定が難しい試料及び菌種があったため，
DNA 精製が必要であることがわかった．そのため，アルカリ熱抽出法で特に判定が困難であっ た試料として米ぬか，菌種としてS. Choleraesuisを用い，2.1.7により抽出方法の検討を行った．
その結果はFig. 1のとおり，InstaGene MatrixとEthachinmateを用いた抽出方法（Fig. 1のレー
ン9及び20）が最も判定が容易であり，105 CFU/mLでも濃いバンドが得られたため，この抽出
方法を採用した．
Fig. 1 Comparison of DNA extraction methods of Salmonella Choleraesuis mixed with rice bran a) Rice bran was incubated in pre-enrichment broth at 37 °C for 16 hours and then mixed
with Salmonella Choleaesuis. The DNAs were extracted with 8 extraction method.
Choleraesuis detecting primer set was used in PCR.
b) Lane 1, 12, 23: 100 bp Ladder. Lane 2~9: 106 CFU/mL of Salmonella Choleraesuis in pre-enrichiment broth. Lane 13~20: 105 CFU/mL of Salmonella Choleraesuis in
pre-enrichiment broth. Lane 10, 21: Positive control. Lane 11, 22: Negative control. Lane 2, 13: Alkali-heat treatment. Lane 3, 14: Alkali-heat treatment and Ethachinmate. Lane 4, 15: MonoFas Bacterial genom DNA extraction kit VII. Lane 5, 16: QIAamp DNA stool.
Lane 6, 17: Dneasy Blood & Tissue. Lane 7, 18: MagExtractor. Lane 8, 19: InstaGene Matrix. Lane 9, 20: InstaGene Matrix and Ethachinmate.
3.1.3 前増菌培養液中での検出可能な菌濃度の検討
2.1.8により検出可能な菌濃度を確認した．
その結果は Table 5 のとおり，前増菌培養液中で概ね 103~106 CFU/mL まで菌濃度が増えてい れば，検出可能であった．本法の抽出法により DNA を精製することで，アルカリ熱抽出法では 検出不能であったS. Choleraesuisについても106 CFU/mL以上の菌濃度であれば同定できた．ま た，アルカリ熱抽出法において DNA 抽出溶液の希釈をしないと検出できなかった試料について は，本法の抽出法では DNA 抽出溶液の希釈をせずとも検出できた．アルカリ熱抽出法と本法の 抽出法での検出可能な最小菌濃度を比較すると，多くの試料では本法の抽出法の方が少ない菌濃 度でも検出できた．なお，サルモネラを添加しない前増菌培養液についても同時に試験を行った が，全てを正しく陰性と判定できた．
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
← 600 bp
← 300 bp
← 100 bp
← 200 bp
Table 5 Minimum concentration of Salmonella to be identifiable in pre-enrichiment brotha), b)
S.Dublin S.Gallinarum S.Hadar S.Infantis
Sample Method A Method B Method A Method A Method B Method A Method A Method A Method A Method B Corn gluten meal 1.9×106 1.5×105 4.0×103 8.8×104 6.5×102 9.6×104 6.0×105 9.0×103 1.1×105 6.0×103
Rice bran 1 U NT NT 8.8×104 NT NT NT NT 1.1×106 NT
Rice bran 2 NT 1.3×106 U NT 6.3×103 9.6×105 6.0×104 9.0×105 NT 5.9×104
Rapeseed meal 1.9×106 1.5×104 4.0×105 8.8×104 6.5×103 9.6×105 6.0×105 9.0×105 1.1×106 6.0×103
Brewers grains 1.9×104 1.4×105 4.0×104 8.8×104 6.5×104 9.6×104 6.0×105 9.0×103 1.1×105 7.9×104
Meat bone meal 1 1.9×104 NT 4.0×104 8.8×104 NT 9.6×104 6.0×105 NT 1.1×105 NT
Meat bone meal 2 NT 1.6×104 NT NT 7.6×104 NT NT 9.0×105 NT 1.1×103
Chicken meal 1.9×104 3.0×104 4.0×104 8.8×104 3.6×105 9.6×104 6.0×105 9.0×103 1.1×105 2.9×104
Fether meal 1.9×104 1.3×104 4.0×104 8.8×104 1.1×103 9.6×104 6.0×105 9.0×103 1.1×104 6.9×103
Fish meal 1 1.9×104 NT 4.0×104 8.8×104 NT 9.6×104 >6.0×105 NT 1.1×104 NT
Fish meal 2 NT 1.6×104 NT NT 1.2×103 NT NT 9.0×105 NT 1.1×105
Molasses adsorption
feed U 1.6×106 U 8.8×104 1.5×105 9.6×105 6.0×105 9.0×105 1.1×106 1.6×105
Mixed feed 1.9×105 1.4×105 4.0×104 8.8×104 8.7×103 9.6×104 >6.0×105 9.0×105 1.1×106 8.8×105 Formula feed for
layer U 1.6×106 U 8.8×104 1.5×105 9.6×105 6.0×105 9.0×105 1.1×106 1.6×105
Formula feed for
broirer 1.9×106 1.4×105 U 8.8×104 6.5×103 U 6.0×105 9.0×105 1.1×106 7.9×104
Formula feed for
finishing beef cattle 1 1.9×106 NT 4.0×105 8.8×104 NT 9.6×104 6.0×105 NT 1.1×106 NT Formula feed for
finishing beef cattle 2 NT 1.6×104 NT NT 1.2×105 NT NT 9.0×105 NT 1.0×104
Formula feed for
dairy cattle 1.9×105 1.4×105 4.0×104 8.8×104 8.7×103 9.6×104 6.0×105 9.0×104 1.1×105 8.8×104 Formula feed for
finishing pig 1.9×106 1.3×105 NT 8.8×104 1.1×104 9.6×105 6.0×105 9.0×105 1.1×106 6.9×104 S.Typhimurium
S.Choleraesuis S.Enteritidis
Minimum concentration of Salmonella (CFU/mL)
a) Each sample was mixed with Salmonella after incubation in buffered peptone water at 37 °C for 16 hours.
DNA extracts were performed with alkali-heat treatment (Method A) or combination of InstaGene Matrix and Ethachinmate (Method B) and then multiplex PCR was performed.
b) Each value represents the minimum concentration of Salmonella with positive result. "NT" indicates that the sample was not tested; "U" indicates that the serovar of Salmonella inoculated in the sample was not identified; and underline indicates that the result was in the case of 10-fold diluted DNA extract.
3.1.4 陽性試料に対する迅速検出法の適用性の検討
主要血清型を迅速に同定することは重要であるが，飼料中にサルモネラが含まれているかどう かを迅速に判定することも重要である．そこで，2.1.9 の迅速検出法により試験を行い，各血清
型検出用プライマーセットに含まれている invA 検出用プライマーによる invAの増幅を確認する ことで，サルモネラの検出に使用できないか確認した．
2.1.2の2)のサルモネラの陽性試料44点を確認に用いた．これらの試料は，主要血清型は含ま
れていない．また，試料は長期冷蔵保存されたものであるため，培養法により改めてサルモネラ の生菌の存在を確認した．
迅速検出法では操作の簡便性を考え，2.1.3の15)の中から2種類のプライマーセットを選択し 用いることとした．一つは畜産物由来の食中毒を引き起こすリスクが高いことから S. Enteritidis 検出用プライマーセットを，もう一つは過去に飼料からの検出例があることからS. Typhimurium 検出用プライマーセットを選択した．
その結果はTable 6のとおり，培養法で再度陽性となった試料17点のうち両方のプライマーセ ットでinvA陽性であったのが16点であり，両方のプライマーセットでinvA陰性であったのは1 点のみであった．培養法で改めて陰性となった 27点のうち両方のプライマーセットで invA陰性 であったのが 23 点であり，S. Enteritidis 検出用プライマーセットのみ invA 陽性が 1 点，S.
Typhimurium検出用プライマーセットのみinvA陽性が3点であった．
培養法及び迅速検出法でともに陰性と判定された試料は，長期保存中にサルモネラが死滅した，
あるいは検出可能な濃度にまでサルモネラが増菌していない可能性が示唆された．
培養法で陰性と判定され，迅速検出法で陽性と判定された試料は，他の陽性となった試料の電 気泳動の結果と比較すると，invA に対応する増幅産物のバンドが薄かったため，抽出された DNA 量が少なかったことが原因として考えられた．このことから，死菌の微量な DNA を迅速 検出法で検出した，invA とは異なる DNA を増幅した誤検出及び試料中のサルモネラが検出限界 以下8)であった可能性が示唆された．
一方，S. Enteritidis 検出用プライマーセットと比較して，S. Typhimurium 検出用プライマーセ ットで偽陽性がより多く確認された．これは，前述の可能性のほかに，S. Typhimurium検出用プ ライマーセットと S. Enteritidis 検出用プライマーセットでは用いた 4 つのプライマー対のうち invA に対応するプライマー対以外のプライマーが異なっており，特異性に差が生じた可能性も 示唆された．
なお，培養法で陽性と判定され，迅速検出法で陰性と判定された1試料は，再度両試験法を実 施したが，どちらも陰性と判定され，再現性がなかった．このことから，当該試料中にサルモネ ラが局在していた，あるいは試料中のサルモネラ菌数が微量であった可能性が考えられた．
以上の結果から，迅速検出法は，培養法と高い一致率を示しており，飼料中のサルモネラを迅 速にスクリーニングする方法としても有用と考えられた．
Table 6 Relative accuracy of multiplex PCR method compared to reference method (culture method) a)
invA positive invA negative invA positive invA negative
Reference method Positive 16 1 16 1
(Culture) Negative 1 26 3 24
Enteritidis detecting primer set
40 42
Typhimurium detecting primer set
Agreement
Accuracy (%)b) 95.5 90.9
a) All samples in this table had been once determined Salmonella-positive by the reference method.
All samples were re-tested using reference method because of long term storage.
b) Accuracy: percentage of the results consistent with reference method 3.2 共同試験
本法及び迅速検出法の室間再現精度を検証するため，2.2により共同試験を実施した．
その結果は Table 7 のとおり，本法については，全てのプライマーセットで全ての試験室が血 清型を正しく同定できた．また，迅速検出法については，魚粉の前増菌培養液に S. Infantis を添 加したものを S. Hadar 検出用プライマーセットでマルチプレックス PCR を行った結果で，6 試 験室中 1 試験室のみ invA 陰性となった．サルモネラ陰性試料については，全ての試験室が全て のプライマーセットで正しく判定できた．この invA 不検出の原因の一つは，今回添加した菌濃
度である105 CFU/mLがS. Hadar検出用プライマーセットの検出下限を下回ることが考えられた
ほか，実施試験室での DNA の抽出効率が悪かったために，検出可能な量の増幅産物が得られな かった可能性が考えられた．しかし，目的とするS. Hadarを添加した試料については検出できて いたこと，また，S. Typhimurium検出用プライマーセットとS. Enteritidis検出用プライマーセッ トをスクリーニング用プライマーセットとすることを想定したことから，サルモネラの陽性・陰 性判定には問題ないと考えられた．
Kind of serovar
Level (CFU/mL)S. CholeraesuisS. DublinS. EnteritidisS. GallinarumS. HadarS. InfantisS. Typhimurium Saline-SterilizedNTd)NT0/6 (0)NTNTNT0/6 (0) S. Enteritidis1.67×105SterilizedNTNT6/6 (6)NTNTNT0/6 (6) S. Infantis1.80×105Sterilized0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)6/6 (6)0/6 (6) Saline-SterilizedNTNT0/6 (0)NTNTNT0/6 (0) Fish mealS. Enteritidis1.67×105SterilizedNTNT6/6 (6)NTNTNT0/6 (6) S. Infantis1.80×105Sterilized0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (5)6/6 (6)0/6 (6) Brewers grainsSaline-DNANTNT0/6 (0)NTNTNT0/6 (0) Formula feed for finishing beef cattleS. Typhimurium1.65×105 DNANTNT0/6 (6)NTNTNT6/6 (6) Formula feed for finishing pigS. Choleraesuis2.60×105 DNA6/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6) Chichen mealS. Dublin3.13×105DNA0/6 (6)6/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6) Fether mealS. Gallinarum1.97×105DNA0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)6/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6) Soybean mealS. Hadar1.86×105DNA0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)0/6 (6)6/6 (6)0/6 (6)0/6 (6) Salmonella negative samples in buffered peptone water at 35~37 °C for 18~24 hours, then DNA extraction and multiplex PCR were performed (Sterilized). In the case of DNA of Salmonella, DNA solutions which were extracted from Salmonella-inoculated feeds were analyzed as template DNA (DNA). d) Not tested.
Table 7 Results of collaborative studya) a) The collaborative study was performed with 6 laboratories. The thermal cyclers that all laboratories used were PE9700 (Applied Biosystems). b) Sterilized Salmonella and DNA of Salmonella were distributed to each laboratory. In the case of sterilized Salmonella, the sterilized strains were mixed after incubation of c) Results are expressed as "number of laboratories who reported target serovar positive/number of laboratories (number of laboratories who reported invA positive).
InoculationNumber of positive results/number of samples tested (number of invA positive results)c) Formula feed for layerSampleType of distributionb)
3.3 実試料によるモニタリング結果
本法及び迅速検出法の有用性を確かなものとするために，FAMIC が実施している飼料のサル モネラのモニタリングにおいて培養法と並行して本法及び迅速検出法による試験も行い，培養法 と比較した．試料は2.1.2の3)を用いた．
その結果は Table 8のとおり，培養法では試料272点中 4点がサルモネラ陽性と判定されたが，
そのうち主要血清型に当たるものはなかった．
本法では試料 272 点のうちチキンミール 1 点及び糖蜜吸着飼料 1 点で PCR反応の阻害が認め られたが，その割合は約 0.7 %と低く，本法で採用した抽出法は飼料中のサルモネラ迅速同定法 に用いるのに支障はないと考えられた．なお，PCR 阻害の原因としては，DNA を抽出する際に，
PCR 反応を阻害する成分を十分に除去できなかった可能性が考えられた．阻害のなかった試料 270 点については，本法でも主要血清型に該当するサルモネラは存在しないと正しく判定された．
迅速検出法に関しては，S. Hadar検出用プライマーセットを除いて偽陰性は認められなかった が，全てのプライマーセットで偽陽性が認められたことから，更なる検討が必要であると考えら れた．偽陽性が認められた原因としては，死菌の DNA が増幅された，invA と異なる DNA が非 特異的に増幅された，あるいは前増菌培養液中のサルモネラが同定可能な菌量に達していなかっ たことが示唆された．