糖鎖制御 Fed-batch 培養初期検討

以上の発見に基づいて，高い deFuc%抗体の製造を工業スケールで実現するシンプルな 方法を検討した．抗体の工業製造においてフェドバッチは最も標準的な製造方法である．

しかし，培養期間を通じて浸透圧を制御することは，多くの因子に影響され簡単ではない．

pH 調整のためのアルカリの添加， dCO_２の蓄積（それは培地のバッファー能にも影響する）， 栄養成分の消費，生産物と副産物の蓄積が挙げられる．さらに，タンクサイズによって Feed 添加量の制限が生じるので，工業スケールではもはや希釈法は実現的ではない．よ って，希釈をともなわない浸透圧低下方法が必要である．そこで， NaCl 量を低減した特 注粉末培地を採用した．我々はグルコース濃度を制御することにによる浸透圧制御を試み た．初期に高濃度で添加されたグルコースは動物細胞培養で主たる基質として消費される

（結果として浸透圧が下がる）．初期の高濃度グルコースは，培養経時とともに，グルコ

Culture periods (days) 6 9 11 12

Gene Symbol

Gene name

Gck Glucokinase 0.14 0.11 0.15 0.13

Hk1 Hexokinase1 0.37 0.23 0.27 0.26

Hk2 Hexokinase2 0.88 0.72 0.94 0.44

Hk3 Hexokinase3 0.61 0.59 0.72 0.63

Fpgt Fucose-1-phosphate guanylyltransferase 1.16 0.68 0.92 1.04

Fuca Fucosidase, alpha-L-1 0.94 0.59 0.50 0.74

Fuk L-fucose kinase 0.51 0.33 0.32 0.44

Mpi Mannose phosphate isomerase 0.74 0.56 0.55 1.01

Pmm1 Phosphomannonutase 1 0.83 0.45 0.77 0.33

GMD GDP-mannose 4,6-dehydratase 1.05 0.74 0.78 0.89

Fut1 Fucosyltransferase 1 0.46 0.18 0.36 0.27

Fut8 Fucosyltransferase 8 0.29 0.04 0.18 0.12

ースの消費にともなって低浸透圧を実現する（ Fig ． 12 A, 記号）．上げ方向の制御 はグルコースを培養 6 日目に添加することで実現した（ Fig. 12 , 白抜き記号）．浸透 圧一定の制御はグルコースほか栄養物を添加することで達成された（塗りつぶし記号）．

11 日目に回収された抗体の deFuc%は期待通りの逆相関が示された（ Fig ． 12 B, C ）．

低浸透圧で，最大の deFuc%を得た．これらの結果は，浸透圧の制御によって deFuc%を制 御した抗体糖鎖を工業レベルのフェドバッチ培養でも獲得できることを示した．

全世界で開発中のバイオ医薬品のうち 70%が糖蛋白であるとされる(Sethuraman, Stadheim, 2006)．一般に糖鎖のバラエティは，糖鎖の付加数（マクロなばらつき）と糖 の分岐数など単糖の付加構造（ミクロなばらつき）に大別される(Butler, 2006)．糖鎖は 上市している糖タンパク医薬品の有効性を左右しうる critical なな品質特性である (Hossler et al., 2009)．例えばアンチトロンビン製剤のヘパリン結合活性にフコースの 有無が影響することが知られている(Louise Garone et al., 1996)．現段階では，糖鎖合 成経路の一連のすべての酵素を制御することは不可能である．しかし，グルコース溶液に よる培地浸透圧の制御は， YB2/0 細胞で生産する抗体が有効な ADCC 活性を保有するに必 要な deFuc%をデザインするのに十分である．本 deFuc%制御は同様の性質を持つ細胞株に 広く使えることから，安定な deFuc%の製造を広く達成することを実現し，これまで工業 利用をあきらめていた細胞株の継続利用に道を開くかもしれない．

Figure 12. Defucosylation levels (deFuc%) of MAbs produced with different methods to regulate medium osmolality. Open symbols, hyperosmotic; cross symbols, hypoosmotic;

closed symbols, constant osmotic conditions. Cells were cultured in a 5-L fed-batch bioreactor with custom-made medium containing low NaCl. Osmolality was adjusted by supplementing with NaCl. (A) glucose concentration in the medium, (B) medium osmolality, (C) deFuc% MAbs harvested on day 11, and (D) viable cell density. Independent experiments under similar conditions exhibited similar initial results in 1-L bioreactors.