第 3 章の検討において、実験動物（ラット）に幼若期から性成熟期に至るまで肝毒 性物質を曝露することによって内分泌系に影響が認められた。Phenobarbital（PB）投 与では性ホルモンの変動として血中テストステロンの低値および甲状腺影響、Di
(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)投与では甲状腺影響が認められた。いずれも肝臓にお
ける薬物代謝酵素誘導に起因した変化であると考えられた。また、血中テストステロン の低値の作用機序については、肝臓におけるテストステロンの代謝亢進の可能性を肝 臓S9画分を用いたex vivo実験において直接的に証明した。
PBおよびDEHPともに先行報告と同じく肝臓影響が発現したものの、DEHPでは生 殖器関連への影響が認められなかった。DEHP を含めたフタル酸類では、生殖器関 連の影響に関する先行研究の報告事例が多い。DEHP は内分泌かく乱物質（ED 物 質）であると一般的に認知されているが、本研究で生殖器に影響は認められていない 要因として、生殖器よりも肝臓の方が高感度で毒性変化を発現した可能性、あるいは 胎児期、乳児期、幼若期といった成長ステージ間で DEHP 曝露による感受性が異な る可能性があるかもしれない。実験に供試する動物種、系統、投与期間、投与経路な ども先行研究との結果乖離の原因として推測され得る。DEHP の投与量（500 mg/kg） は、ヒトに対する安全性を確保するリスク評価を考慮する上で極めて高曝露条件であり、
一般環境においては実現し得ない曝露量である。世界中で汎用されているフタル酸 類を適切に管理／規制していくためには、今後とも継続した研究成果の蓄積が求めら れ、適切にリスク評価していく必要性が高いと考えられた。
DEHPのように複数の核内受容体を活性化させることで毒性を発現する化学物質の 評価では、甲状腺影響の作用機序として甲状腺ホルモンの代謝だけではなく、合成
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阻害、輸送あるいは生体変換への影響を考慮した解析を進める必要がある。また、PB については医療用医薬品として長期にわたって臨床現場でてんかんなどの精神疾患 患者に投薬されている実績がある。しかしながら、男性生殖器に影響が認められたと の信頼性の高い根拠データは報告されていない。実験動物で認められた血中テストス テロン低値がヒトにおいて毒性学的意義を持つかどうかの判断は難しい。特に化学物 質曝露による肝臓中の薬物代謝酵素誘導の感受性は、種差も考慮されるべきであり、
実験動物で認められた所見（生体内ホルモンレベルの変動）が必ずしもヒトで認められ ないかもしれない。
第2章と第3章の結果から 7日間という短期曝露（幼若期のみ）でも十分に肝臓に おいて薬物代謝酵素誘導は認められており、性成熟期にあるラットと同様の肝臓影響 が幼若ラットでも確認できたことから、幼若期においても異物に対する反応は十分に 機能していると考えられた。また、本研究の検討結果からは、7 日間の短期曝露の方 が薬物代謝酵素誘導の程度が強く、異物代謝に対する反応は 31 日間の曝露期間
（幼若期から性成熟期）の間に減弱する傾向にあることが示された。さらに、DEHP 群 の幼若期において認められた軽微なCYP2B および CYP3A の誘導が性成熟期には 消失していた点にも注目すべきである。DEHP 投与群では、短期曝露の方が薬物代 謝酵素を強く誘導していることから、短期的にはステロイドホルモンの代謝亢進を惹起 する可能性もあるかもしれない。研究計画においては、成長ステージ、投与期間を精 査する重要性は高いと考えられる。
以上、本研究の成果として肝毒性物質曝露による肝臓影響（直接影響）を介した内 分泌系への影響（間接影響）は、生体内で容易に生じ得る現象であることが示唆され た。化学物質曝露において最も毒性が頻発する組織は肝臓である（Roberts ら、2015）。
化学物質曝露による影響を評価する際には、肝毒性の有無、各毒性所見が肝臓を介 した影響であるかどうかの判断が重要になると思われた。世界的に安全に対する意識
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は高まってきており、化学物質曝露によって惹起された毒性所見においては、毒性発 現経路（Adverse outcome pathway；AOP）を理解して作用機序を明らかにする必要性 がある。本研究の成果は、ホルモン変動要因を解明するための一助になることが期待 される。ヒトは頑健なホルモン調節機構を有していると考えられるため、肝臓影響を介 したホルモン代謝亢進に伴う間接影響を受けても正常な生理状態を維持できるかもし れない。一方、精巣におけるステロイド産生阻害のような直接的に生殖器官に影響す るような場合には、生殖機能への影響を示唆する報告事例も多いことから、ホルモン 調節機構が破綻しやすい傾向にあるかもしれない。ホルモンレベルの軽微な変化を 含め、本研究のように肝臓影響を介した二次的変化の作用機序および毒性学的意義 を追究するような報告事例が今後とも蓄積されていくことが期待される。
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引用文献
Akingbemi, B. T., Ge, R., Klinefelter, G. R., Zirkin, B. R., Hardy, M. P. (2004): Phthalate-induced Leydig cell hyperplasia is associated with multiple endocrine disturbances. Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A., 101, 775-780.
Akingbemi, B.T., Youker, R.T., Sottas, C.M., Ge, R., Katz, E., Klinefelter, G. R., Zirkin, B. R., Hardy, M. P. (2001): Modulation of rat Leydig cell steroidogenic function by di(2-ethylhexyl)phthalate. Biol. Reprod., 65, 1252–1259.
Barakat, R., Lin, P. P., Rattan, S., Brehm, E., Canisso, I. F., Abosalum, M. E., Flaws, J.
A., Hess, R., Ko, C. (2017): Prenatal Exposure to DEHP Induces Premature Reproductive Senescence in Male Mice. Toxicol. Sci., 156 (1), 96-108.
Barter, R.A., Klaassen, C.D. (1992): Rat liver microsomal UDP-glucuronosyltransferase activity toward thyroxine: characterization, induction and form specificity. Toxicol. Appl.
Pharmacol., 115, 261-267.
Breedlove, S. M., Cooke, B. M., Jordan, C. L. (1999): The orthodox view of brain sexual differentiation. Brain Behav Evol., 54 (1), 8-14
Cappon, G. D., Chapin, R. E., Hurtt, M. E., Wajnrajch, M. P., Burns-Naas, L. A. (2011):
Impaired reproduction in adult male, but not female, rats following juvenile treatment with the aromatase inhibitor, exemestane. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol., 92(4), 304-313.
Cha, S., Jung, K., Lee, M. Y., Hwang, Y. J., Yang, E., Lee, S. H., Jung, H. I., Cheon, Y. P.
(2018): Nonmonotonic effects of chronic low-dose Di(2-ethylhexyl) phthalate on gonadal weight and reproductive. Dev. Reprod., 22 (1), 85-94.
Colborn, T., Dumanoski, D., Myers, J. P. (1996): Our Stolen Future. Dutton/Penguin Books.
Coulson, M., Gibson, G. G., Plant, N., Hammond, T., Graham, M. (2003): Lansoprazole increases testosterone metabolism and clearance in male Sprague-Dawley rats:
implications for Leydig cell carcinogenesis. Toxicol Appl Pharmacol., 192, 154-163.
67
Damassa, D. A., Kobashigawa, D., Smith, E. R., Davidson, J. M. (1976): Negative feedback control of LH by testosterone: a quantitative study in male rats. Endocrinology., 99 (3), 736-742.
Day, P., Green, R. M., Gross, M., Weltje, L., Wheeler, J. R. (2018): Endocrine Disruption:
Current approaches for regulatory testing and assessment of plant protection products are fit for purpose. Toxicol Lett., 296, 10-22.
Döhler, K.D., Wong, C. C., von zur Mühlen, A. (1979): The rat as a model for the study of drug effects on thyroid function: consideration of methodological problems. Pharmacol Ther. [B], 5, 305-318.
Dong, J., Cong, Z., You, M., Fu, Y., Wang, Y., Wang, Y., Fu, H., Wei, L., Chen, J. (2019):
Effects of perinatal di (2-ethylhexyl) phthalate exposure on thyroid function in rat offspring. Environ Toxicol Pharmacol., 67, 53-60.
Dong, X., Dong, J., Zhao, Y., Guo, J., Wang, Z., Liu, M., Zhang, Y., Na, X. (2017): Effects of Long-Term In Vivo Exposure to Di-2-Ethylhexylphthalate on Thyroid Hormones and the TSH/TSHR Signaling Pathways in Wistar Rats. Int J Environ Res Public Health., 14, 44.
Duty, S. M., Singh, N. P., Silva, M. J., Barr, D. B., Brock, J. W., Ryan, L., Herrick, R. F., Christiani, D. C., Hauser, R. (2003): The relationship between environmental exposures to phthalates and DNA damage in human sperm using the neutral comet assay. Environ Health Perspect., Jul 111(9), 1164-9.
Ema, M., Miyawaki, E. (2001): Adverse effects on development of the reproductive system in male offspring of rats given monobutyl phthalate, a metabolite of dibutyl phthalate, during late pregnancy. Reprod Toxicol., 15, 189–194.
Eveillard, A., Mselli-Lakhal, L., Mogha, A., Lasserre, F., Polizzi, A., Pascussi, J. M., Guillou, H., Martin, P. G., Pineau, T. (2009): Di-(2-ethylhexyl)-phthalate (DEHP) activates the constitutive androstane receptor (CAR): a novel signalling pathway sensitive to phthalates. Biochem Pharmacol., 77 (11), 1735-1746.
68
EPA OPPTS 890.1400 (2009): Endocrine Disruptor Screening Program Test Guidelines;
Hershberger Bioassay.
https://www.regulations.gov/document?D=EPA-HQ-OPPT-2009-0576-0008 (accessed 30.06.2019)
European Chemical Agency (ECHA) and European Food Safety Authority (EFSA) with the technical support of the Joint Research Centre (JRC) (2018): Guidance for the identification of endocrine disruptors in the context of Regulations (EU) No 528/2012 and (EC) No 1107/2009.EFSA Journal, 2018;16(6):5311.
Fukuta, Y., Fukuda, Y., Higashino, R., Yoshida, K., Ogishima, M., Tamaki, H., Takei, M. (1999): Z-350, a novel compound with α1-adrenoceptor antagonistic and steroid 5α-reductase inhibitory actions: pharmacological properties in vivo. J Pharmacol Exp Ther., 290, 1013-1018.
Ghisari, M., Bonefeld-Jorgensen, E. C. (2009): Effects of plasticizers and their mixtures on estrogen receptor and thyroid hormone functions. Toxicol Lett., 189 (1), 67-77.
Gupta, C., Yaffe, S. J., Shapiro, B. H. (1982): Prenatal exposure to phenobarbital permanently decreases testosterone and causes reproductive dysfunction. Science, 216 (4546), 640–642.
Ha, M., Guan, X., Wei, L., Li, P., Yang, M., Liu, C. (2016): Di-(2-ethylhexyl) phthalate inhibits testosterone level through disturbed hypothalamic-pituitary-testis axis and ERK-mediated 5α-Reductase 2. Sci Total Environ., 563-564, 566–575.
Haines, C., Chatham, L. R., Vardy, A., Elcombe, C. R., Foster, J. R., Lake, B. G. (2019):
Comparison of the hepatic and thyroid gland effects of sodium phenobarbital and pregnenolone-16α-carbonitrile in wild-type and constitutive androstane receptor (CAR)/pregnane X receptor (PXR) knockout rats. Xenobiotica., 49, 227-238.
69
Hu, G. X., Zhou, H. Y., Li, X. W., Chen, B. B., Xiao, Y. C., Lian, Q. Q., Liang, G., Kim, H. H., Zheng, Z. Q., Hardy, D. O., Ge, R. S. (2009): The (+)- and (-)-gossypols potently inhibit both 3β-hydroxysteroid dehydrogenase and 17β-hydroxysteroid dehydrogenase 3 in human and rat testes. J Steroid Biochem Mol Biol., 115, 14-19.
International Agency for Research on Cancer (IARC) (2001): IARC MONOGRAPHS ON THE EVALUATION OF CARCINOGENIC RISKS TO HUMANS, Phenobarbital and sodium salt, Volume 79.
International Agency for Research on Cancer (IARC) (2013): IARC MONOGRAPHS ON THE EVALUATION OF CARCINOGENIC RISKS TO HUMANS, Di(2-ethylhexyl) phthalate, Volume 101.
Jahnke, G. D., Choksi, N. Y., Moore, J. A., Shelby, M. D. (2004): Thyroid Toxicants:
Assessing Reproductive Health Effects. Environ Health Perspect., 112 (3), 363-368.
Jo, J. Y., Kim, T. H., Jeong, H. Y., Lim, S. M., Kim, H. S., Im, D. S. (2011): Effect of Di-(2-ethylhexyl)-phthalate on Sphingolipid Metabolic Enzymes in Rat Liver. Toxicol.
Res., 27 (3), 185-190.
Kandel, S. E., Han, L. W., Mao, Q., Lampe, J. N. (2017): Digging Deeper into CYP3A Testosterone Metabolism: Kinetic, Regioselectivity, and Stereoselectivity Differences between CYP3A4/5 and CYP3A7. Drug Metab Dispos., 45(12), 1266-1275.
Korenbrot, C. C., Huhtamiemi, I. T., Weiner, R. W. (1977): Preputial Separation as an External Sign of Pubertal Development in the Male Rat. Biol. Reprod., 17, 298-303.
Kortenkamp, A., Evans, R., Martin, O., Mckinlay, R. (2012): STATE OF THE ART ASSESSMENT OF ENDOCRINE DISRUPTERS. European Commission/
Environment/Chemicals/Endocrine Disruptors.
http://ec.europa.eu/environment/chemicals/endocrine/pdf/annex1_summary_state_of_sc ience.pdf (Accessed 21.01.2019)
70
Lin, H., Lian, Q. Q., Hu, G. X., Jin, Y., Zhang, Y., Hardy, D. O., Chen, G. R., Lu, Z. Q., Sottas, C. M., Hardy, M. P., Ge, R. S. (2009): In utero and lactational exposures to diethylhexyl-phthalate affect two populations of Leydig cells in male Long-Evans rats.
Biol Reprod., 80, 882-888.
Liu, C., Zhao, L., Wei, L., Li, L. (2015): DEHP reduces thyroid hormones via interacting with hormone synthesis-related proteins, deiodinases, transthyretin, receptors, and hepatic enzymes in rats. Environ Sci Pollut Res Int., 22, 12711-12719.
Lottrup, G., Andersson, A. M., Leffers, H., Mortensen, G. K., Toppari, J., Skakkebaek, N.
E., Main, K. M. (2006): Possible impact of phthalates on infant reproductive health. Int J Androl., 29, 172–180, discussion, 181-185.
Martinez-Arguelles, D. B., Campioli, E., Culty, M., Zirkin, B. R., Papadopoulosa, V.
(2006): Fetal origin of endocrine dysfunction in the adult: the phthalate model. J Steroid Mol Biol. 137, 5–17.
Masubuchi, N., Hakusui, H., Okazaki, O. (1997): Effects of pantoprazole on xenobiotic metabolizing enzymes in rat liver microsomes: a comparison with other proton pump inhibitors. Drug Metab Dispos., 25 (5), 584-589.
Meek, M. E., Bucher, J. R., Cohen, S. M., Dellarco, V., Hill, R. N., Lehman-McKeeman, L. D., Longfellow, D. G., Pastoor, T., Seed, J., Patton, D. E. (2003): A Framework for Human Relevance Analysis of Information on Carcinogenic Modes of Action. Crit Rev Toxicol., 33, 591-653.
OECD TG441 (2009): OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS;
Hershberger Bioassay in Rats: A Short-term Screening Assay for (Anti)Androgenic Properties.
https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-441-hershberger-bioassay-in-rats_9789264076334-en (accessed 30.06.2019)
71
OECD TG458 (2016): OECD GUIDELINE FOR THE TESTING OF CHEMICALS;
Stably Transfected Human Androgen Receptor Transcriptional Activation Assay for Detection of Androgenic Agonist and Antagonist Activity of Chemicals.
https://www.oecd-ilibrary.org/environment/test-no-458-stably-transfected-human- androgen-receptor-transcriptional-activation-assay-for-detection-of-androgenic-agonist-and-antagonist-activity-of-chemicals_9789264264366-en (accessed 30.06.2019)
Palmer, C. N., Hsu, M. H., Griffin, K. J., Raucy, J. L., Johnson, E. F. (1998): Peroxisome proliferator activated receptor-alpha expression in human liver. Mol Pharmacol., 53 (1), 14-22.
Papineni, S., Marty, M. S., Rasoulpour, R. J., LeBaron, M. J., Pottenger, L. H., Eisenbrandt, D. L. (2015): Mode of action and human relevance of pronamide-induced rat thyroid tumors. Regul Toxicol Pharmacol., 71, 541–551.
Picut, C. A., Remick, A. K. (2017): Impact of Age on the Male Reproductive System from the Pathologists Perspective. Toxicol Pathol., 45(1), 195-205.
Pilutin, A., Misiakiewicz-Has, K., Kolasa, A., Baranowska-Bosiacka, I., Marchlewicz, M., Wiszniewska, B. (2014): The immunoexpression of androgen receptor, estrogen receptors alpha and beta, vanilloid type 1 receptor and cytochrome p450 aromatase in rats testis chronically treated with letrozole, an aromatase inhibitor. Folia Histochem Cytobiol., 52 (3), 206-217.
Pinot, F., Benveniste, I., Salaün, J. P., Durst, F. (1998): Methyl jasmonate induces lauric acid ω-hydroxylase activity and accumulation of CYP94A1 transcripts but does not affect epoxide hydrolase activities in Vicia sativa seedlings. Plant Physiol., 118, 1481-1486.
Qatanani, M., Zhang, J., Moore, D. D. (2005): Role of the constitutive androstane receptor in xenobiotic-induced thyroid hormone metabolism. Endocrinology, 146 (3), 995-1002.
Rasoulpour, R. J., Andrus, A. K., Marty, M. S., Zhang, F., Thomas, J., LeBaron, M. J., Papineni, S., Pottenger, L. H., Eisenbrandt, D. L. (2015): Pronamide: Human relevance of liver-mediated rat leydig cell tumors. Regul Toxicol Pharmacol., 72 (2), 394–404.
72
Ren, H., Aleksunes, L. M., Wood, C., Vallanat, B., George, M. H., Klaassen, C. D., Corton, J. C. (2010): Characterization of peroxisome proliferator-activated receptor alpha--independent effects of PPARalpha activators in the rodent liver: di-(2-ethylhexyl) phthalate also activates the constitutive-activated receptor. Toxicol Sci., 113(1), 45-59.
Rice, D., Barone, S. Jr. (2000): Critical Periods of Vulnerability for the Developing Nervous System: Evidence from Human and Animal Models. Environ Health Perspect., 108, 511-533.
Richthoff, J., Rylander, L., Jonsson, B. A., Akesson, H., Hagmar, L., Nilsson-Ehle, P., Stridsberg, M., Giwercman, A. (2003): Serum levels of 2,2',4,4',5,5'-hexachlorobiphenyl (CB-153) in relation to markers of reproductive function in young males from the general Swedish population. Environ Health Perspect., 111(4), 409-13.
Roberts, R., Callander, R., Duffy, P., Jacobsen, M., Knight, R., Boobis, A. (2015): Target organ profiles in toxicity studies supporting human dosing: Does severity progress with longer duration of exposure? Regul Toxicol Pharmacol., 73(3), 737-46.
Rusyn, I., Peters, J., Cunningham, M. (2006): Effects of DEHP in the Liver: Modes of Action and Species-Specific Differences. Crit Rev Toxicol., 36, 459-479.
Saito, M., Okutomi, T., Shimizu, M., Matsumoto, Y., Yamazaki, H., Hoka, S. (2006):
Activities of rat cytochrome P450 3A and 2C isoforms are increased in vivo by magnesium sulfate as evidenced by enhanced oxidation of bupivacaine and testosterone in liver microsomes. Drug Metab. Pharmacokinet., 21, 201-207.
Smith, J. L., Garry, V. F., Rademaker, A. W., Martin, R. H. (2004): Human sperm aneuploidy after exposure to pesticides. Mol Reprod Dev., Mar 67(3), 353-9.
Stump, D. G., O’Connor, J. C., Lewis, J. M., Marty, M. S. (2014): Key lessons from performance of the U.S. EPA Endocrine Disruptor Screening Program (EDSP) Tier 1 male and female pubertal assays. Birth Defects Res B Dev Reprod Toxicol., 101(1), 43-62.
73
Turan, V. K., Mishin, V. M., Thomas, P. E. (2001): Clotrimazole is a Selective and Potent Inhibitor of Rat Cytochrome P450 3A Subfamily-Related Testosterone Metabolism. Drug Metab Dispos., 29(6), 837-842.
U.S. EPA (2011): ENDOCRINE DISRUPTOR SCREENING PROGRAM, Weight-of-Evidence: Evaluating Results of EDSP Tier 1 Screening to Identify the Need for Tier 2 Testing.
https://www.regulations.gov/document?D=EPA-HQ-OPPT-2010-0877-0021 (accessed 30.06.2019)
U.S. EPA (1998): Endocrine Disruptor Screening Program; Proposed Statement of Policy.
Federal Register, Vol. 63, No. 248
Waxman, D. J., Azaroff, L. (1992): Phenobarbital induction of cytochrome P-450 gene expression. Biochem. J., 281, 577–592.
WHO/IPCS (2002): Global Assessment of the State-of-the-Science of Endocrine Disruptors. World Health Organization/International Programme on Chemical Safety.
WHO/IPCS/EDC/0.2.2.
http://www.who.int/ipcs/publications/new_issues/endocrine_disruptors/en (accessed 30.06.2019)
Wieneke, N., Neuschäfer-Rube, F., Bode, L. M., Kuna, M., Andres, J., Carnevali, L. C.
Jr., Hirsch-Ernst, K. I., Püschel, G. P. (2009): Synergistic acceleration of thyroid hormone degradation by phenobarbital and the PPAR alpha agonist WY14643 in rat hepatocytes.
Toxicol Appl Pharmacol., 240 (1), 99-107.
Wilson, V. S., LeBlanc, G. A. (1998): Endosulfan Elevates Testosterone Biotransformation and Clearance in CD-1 Mice. Toxicol Appl Pharmacol., 148, 158-168.
Yamada, T., Okuda, Y., Kushida, M., Sumida, K., Takeuchi, H., Nagahori, H., Fukuda, T., Lake, B.G., Cohen, S.M., Kawamura, S. (2014): Human hepatocytes support the hypertrophic but not the hyperplastic response to the murine nongenotoxic hepatocarcinogen sodium phenobarbital in an in vivo study using a chimeric mouse with humanized liver. Toxicol Sci., 142, 137-157.
74
環境省（2016）: 化学物質の内分泌かく乱作用に関する今後の対応― EXTEND 2016 ―.
https://www.env.go.jp/chemi/end/extend2016/HP_EXTEND2016re3.pdf (accessed 30.06.2019)
産業技術総合研究所 化学物質リスク管理研究センター（2005）：詳細リスク評価書 フタル酸ジ(2-エチルヘキシル)
https://unit.aist.go.jp/riss/crm/mainmenu/zantei_0.4/DEHP_0.4.pdf (accessed 30.06.2019)
南 健太、於勢 佳子、山口 尊史（2016）：米国環境保護庁の内分泌かく乱物質スクリ ーニング計画に対する取り組み. 住友化学 技術誌., 総説, 18-27.
https://www.sumitomo-chem.co.jp/rd/report/files/docs/2016J_2.pdf (accessed 30.06.2019)