.2.1 抗レトロウイルス活性の検討
12 wellプレートにHEK293T細胞を3×105個/ wellの密度で1 mlずつ播種し、翌日に
eLV-B感染性クローン 100 ng とTRIM発現ベクター 0 ~ 100 ng を共導入した。 トラ
はLipofectamine LTX（Life Technologies）を使用し、導入する総 nt Technologies）で200 ng に均等化した。 導入か
. .1と同様にqRT-PCRを うことで算定した。 検量線は FeLV に加え、データを補正するためにヒト GAPDH
GAPDHのプライマーを表4-1に示す。
4
F
ンスフェクション試薬
DNA量はpCMV-Tag2ベクター（Agile
ら48時間後に培養上清を回収し、450nm filter（Millipore）で濾過することにより細胞崩 壊物を除去した。培養上清中に含まれるウイルスRNAはQIAamp Viral RNA Mini Kit
（Qiagen）を用いて抽出し、DNaseI（Promega）によりDNAを消化した。 その後、Prime Script first strand cDNA Synthesize Kit（Takara Bio）を用いてcDNAを合成した。 これま での行程はそれぞれのKitの説明書に準じて行った。 ウイルス産生量はqRT-PCRにより 測定した。 qRT-PCR反応は2.2.7に従って行い、ウイルス量は検量線の作成による絶対 定量法にて算定した。 qRT-PCRにはFeLVのGag領域を増幅させるプライマーを使用し、
このプライマーにより増幅させたPCR産物をクローニングしたプラスミドを鋳型とし て検量線を作成した。 使用したプライマーを表4-1に示す。
4.2.2 細胞内ウイルスRNA量の測定
4.2.1に従ってFeLV感染性クローンとTRIM発現ベクターを共導入し、その24時間
後に2.2.5に準じてcDNAを合成した。 ウイルスRNA量は4 2
行
についても作成し、解析を行った。 ヒト
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4.2.3 細胞内ウイルスタンパクの検出
4.2.1に従ってFeLV感染性クローンとTRIM発現ベクターを共導入し、その48時間
に、細胞抽出液を回収した。その後、1次抗体として抗FLAG抗体（Sigma）, 抗β-actin 体（Sigma）, 抗FeLV抗体（Abcam）、2次抗体として抗マウス-HRP抗体（Southern
た。 細胞抽出液の回収とWestern blot法の方法
回収し、Protein Assay Rapid Kit（Wako）を使用してタンパク濃度 を測定した。それぞれのサンプルは濃度を統一し、SDS-Sample Buffer（0.624M Tris-HCl,
B, 5% Glycerol）および2-メルカプトタノールと混合後、95℃で5
4
に クター 100
g を共導入した。トランスフェクション試薬はLipofectamine LTX（Life Technologies）
NA量はpCMV-Tag2ベクター（Agilent Technologies）で350 ng 後
抗
Biotech）を用いたWestern blot法を行っ は4.2.4に示す。
4.2.4 Western blot
Protease Inhibitor Cocktail（Roche）を添加したCytobuster protein reagent（Novagen）を 用いて細胞抽出液を
10% SDS, 0.05% BP
分間インキュベートした。その後、タンパク5 μg をSDS-PAGEにて電気泳動し、PVDF メンブレン（GE Healthcare）に転写後、1次抗体および2次抗体で反応させ、ECL system
（GE Healthcare）およびEz-Capture MG（ATTO）により検出を行った。
.2.5 Luciferase assay
24 wellプレートにHEK293T細胞を2×105個/ wellの密度で0.5 mlずつ播種し、翌日 TRIM発現ベクター 100 ng とLTR、またはAP-1, NFκBルシフェラーゼベ
n
を使用し、導入する総D
に均等化した。 導入から24時間後にDual-Glo luciferase assay system（Promega）と蛍
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光プレートリーダー Centro LB960（Berthold Technologies）を用いてルシフェラーゼ活 性を測定した。 LTR およびNFκB, AP-1 ルシフェラーゼ活性は、pRL-TK（Promega）
からTK領域を欠損させたpRL-0ルシフェラーゼベクターを導入することにより標準化 した。 尚、LTR ルシフェラーゼベクターは、FeLV 感染性クローンを鋳型としてLTR
クローニングし、シークエンスにより塩基配列を確認した。 その後、3.2.3と同様の ブクローニングした。 ΔRの
したが、独立 た。
領域をPCRにより増幅後、pGLベクターにサブクローニングすることにより作製した。
4.2.6 TRIM25 RING欠損体（ΔR）発現ベクターの作製
ΔR（54 - 608 aa）を増幅させるために、設計したプライマーを用いて3.2.3で作製し
たネコTRIM25発現ベクターを鋳型としてPCRで増幅した。 PCR産物を3.2.1に準じ
て
方法によりΔRをpCMV-TAG2（Agilent Technologies）にサ 増幅に用いたプライマーを以下に示す。
Forward：GAATTCCGCGCCAGCTATCAGGAGCGGCCGCAGCTCCACA Reverse：GAATTCCTACTTGCAGGAGCAGATGGAGAGCGTGGCACCC
本章におけるすべての実験データはtriplicateで得た代表的結果を記載 した3回の実験で同様の結果を得ている。 統計処理は2.2.8に準じて行っ
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