実験材料
[14C]citrate (specific activity: 116.4 mCi/mmol) は、PerkinElmer (Boston, MA, USA) より購入した。
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)、antibiotic/antimycotic solution for tissue culture、Sepasol-RNA I Super G は、ナカライテスク (京都) より、Fetal bovine serum (FBS) は、Life Technologies (Carsbad, CA, USA) より購入した。ReverTra Ace は、TOYOBO Co., Ltd. (大阪) より購入した。
実験方法 1) 実験動物
6週齢の雄性 C57BL/6J マウス (日本エスエルシー、静岡) を用い、未処理マウスと1型糖尿病 マウス (STZ-treated) の2群に分けた (n=20 in each group)。1型糖尿病モデルマウスは、生理食塩 水 (pH 7.0) に溶解したstreptozotocin (STZ：フジフィルム和光純薬、大阪) をマウス腹腔内に200
mg/kg で単回投与することにより作成した74。一方、未処理マウスでは、STZ の代わりに生理食
塩水を腹腔内に単回投与した。また、STZ 投与後4日目に血糖値を測定し、その時の空腹時血糖
値が400 mg/dL となったマウスを1型糖尿病モデルマウスと判定し、以降の検討に用いた。
2) Real-time reverse transcription (RT)-PCR 解析
未処理マウス、およびSTZ 処理マウスの肝臓からSepazol RNA I (ナカライテスク、京都) を用 いて、定法に従い total RNA を抽出した。抽出した total RNA 2 μg に対し、逆転写酵素ReverTra Ace (TOYOBO、大阪) および oligo(dT)20 プライマーを用いて逆転写を行い、1st strand cDNAを得 た。得られたcDNA 2 μgについて、mouse NaCT (mNaCT)、mouse NaDC3 (mNaDC3)、GAPDH に 特異的なプライマーセット (Table 3) および PowerUp SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) を 用 い て 、Applied Biosystems StepOne Real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) により Real-time RT-PCR を行った。95 °C、10 min、95 °C、15 sec、60 °C、60 secの増幅反応を45サイクル繰り返し、60 °C、60 sec の最終増幅を1回行った。
目的遺伝子の mRNA 量は、GAPDH のmRNA 量で標準化した。各々の mRNA の相対量を STZ 処理マウスでの mRNA 量と未処理マウスでの mRNA 量の比率 (STZ/ non-treated (NT)) で表し た。
Table 3 Primer sequences used in Real-time RT-PCR reaction
cDNA Primer sequence (5’ – to - 3’) PCR Product
size (bp)
Accession No.
mNaDC3
forward primer: 5’- CTTCCTCGACACCAACTTCC -3’
reverse primer: 5’- CTTGTTCTGCACGTTTGCCA -3’ 800 NM_054055
mNaCT
forward primer: 5’- GTCAGTCTCCCTTTCACGCG -3’
reverse primer: 5’- CTCCACAGCTGTATTGGCGG -3’ 521 NM_001004148.4
GAPDH
forward primer: 5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3’
reverse primer: 5’-CCTGGTTCACCACCTTCTTG-3’
576 X02231
3) Western blotting
マウスから肝臓を切り出し、RIPA buffer (0.1% TritonX-100, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% sodium dodecyl sulphate, 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl) を加え、ポリトロンホモジナイザーで氷冷しなが ら破砕し、タンパクを回収した。回収したタンパクをBCA protein assay kit (ナカライテスク) を 用いて、定量した。サンプル (20 µg protein) を2 × SDS sample buffer (20 mM Tris-HCl、2 mM EDTA、
10% 2-mercaptoethanol、2% SDS、20% glycerol、0.2% bromophenol blue; pH 6.8) で可溶化し、100 °C で5分間熱変性処理した。その後、10% SDS PAGEで分離後、polyvinylidene difluoride (PVDF) 膜 に転写した。PVDF 膜を5% スキムミルク、1% BSA を含有 Tween tris buffered saline (TBS-T) buffer (20 mM Tris、150 mM NaCl、0.2% tween-20; pH7.5) を用いて、室温で2時間ブロッキング処理を 行った。ブロッキング処理後、一次抗体anti-NaCT antibody (1:250) (#PA5-60679, SIGMA-Aldrich)、
anti-β-actin (1:1,000) (#4967, Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, USA) をそれぞれ4 °Cで 一晩反応させた。一次抗体を反応させたPVDF 膜をTBS-T buffer で洗浄し、二次抗体anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody (1:1,000;cat. no. 7074; Cell Signaling Technology, Inc) を室温で 1 時間処理 した。その後、再び TBS-T buffer にて洗浄し、ImmunoStar LD (フジフィルム和光純薬) を用いて 化学発光させ、Gel Doc XR+ Gel Documentation System (BioRad) にて可視化した。
4) 取り込み実験
マウスの肝臓を0.5 mg/mL collagenase solution (collagenase 0.25mg in 50mL enzyme buffer solution) で灌流を行い、初代肝培養細胞を単離した。単離した初代肝培養細胞を1 × 105 cells/mL となるよ うに、Na+-containing transport buffer (25 mM HEPES/Tris (pH 7.4)、140 mM NaCl、5.4 mM KCl、1.8 mM CaCl2、0.8 mM MgSO4、5 mM glucose) に懸濁させた。一方、Na+ 非存在下でのクエン酸輸送 については、NaCl を等濃度のN-methyl-D-glucamine (NMDG) chloride に置換した transport buffer
(Na+-free transport buffer) を 用 い た 。 細 胞 懸 濁 液 1 mL に [14C]citrate (specific activity: 116.4 mCi/mmol) 含有 transport buffer (0.43 μM) 1 mL を加え、37 °Cで浸透させながら15分間培養した。
15分後、混合液を Whatman® glass microfiber filter (GF/F) (Buckinghamshire, UK) を用いて吸引濾 過し、氷冷したtransport buffer 1 mLで2回洗浄した。その後、filter を測定用のバイアルに移し、
5 mLのクリアゾルI を加えて、液体シンチレーションカウンター (Model LSC6000, Beckmann) に て放射活性の測定を行った。Na+ 依存的な[14C]citrate の取り込み量については、Na+-containing transport buffer における細胞内への取り込み量から Na+-free transport buffer での取り込み量を差 し引くことで算出した。また、相対的な [14C]citrate 取り込み量については、STZ 処理マウスにお け る Na+ 依 存 的 な [14C]citrate の 取 り 込 み 量 と 未 処 理 マ ウ ス に お け る 取 り 込 み 量 の 比 率 (STZ/NT) で表した。
5) Oil Red O 染色
肝細胞における脂質蓄積を評価するために、STZ 処理後1、2、4、6、および8週目にOil Red O 染色を行った。STZ 処理マウス、未処理マウスから採取した肝臓を4% パラホルムアルデヒド
(ナカライテスク) で固定し、Tissue-Tek O.C.T. Compound (サクラファインテックジャパン、東京)
で包埋し、-80°Cで凍結させて組織切片を作製した。一方、Oil red O 保存液はイソプロパノール
100 mL に、Oil Red O (フジフィルム和光純薬) を0.3 g 加え、作製した。その保存液を保存液 :
イオン交換水 = 6 : 4 となるように混合し、30分攪拌した後、混合液を0.45 μm フィルター (ア ドバンテック東洋、東京) で濾過して染色液を作製した。肝臓の組織切片をOil Red O 染色液を用 いて、染色した。
6) 血液中の生化学データの測定
STZ 投与後0、1、2、4、6、8週目に、STZ 処理マウス、および未処理マウスから血液を採取
した。血液を3,000 × g、4 °Cで 15 分間遠心分離し、血漿を回収した。回収した血漿サンプルの 血漿中グルコース、トリグリセリド、コレステロール、および遊離脂肪酸 (nonesterified fatty acid:
NEFA) について、それぞれ LabAssay Glucose、LabAssay Triglyceride、LabAssay Cholesterol、
LabAssay NEFA (フジフィルム和光純薬) を用いて、定法に従い測定を行った。
7) 統計学的解析
それぞれのデータは、平均 ± 標準偏差 (SD) で示した。統計学的有意差は、ANOVA を用いて 評価を行った。2群間の比較は Student’s t test を、対照群と他群間の多重比較には Dunnett’s test を用いて検定を行った。