実験方法

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2. 実験方法

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キサーで撹拌した．再び16000 ×g, 4 ˚Cの条件で5分間遠心分離することで2層に分 離させ，下層200 μLを新しいチューブに回収した．回収した下層は混合溶液 (メタノ ール:クロロホルム=2:1, v/v) 600 μLを添加することで希釈した．

2‒4. 脂質標準品のフローインジェクション分析条件

カラムスクリーニングおよび分析法の堅牢性の検証を実施するために，各脂質クラ

スが 1 μM となるよう混合溶液を調製した．SFC-MS は ACQUITY UltraPerformance

Convergence Chromatography (UPC²) system (Waters, Milford, MA) とXevo TQ-S micro tandem mass spectrometer (Waters) を用い，MassLynxソフトウェアversion 4.1 (Waters) により制御した．イオン化効率を向上させるためにHPLC 515 pump (Waters) をメイク アップポンプとして使用し，手動で制御した．まず，コーン電圧や衝突エネルギーな ど対象化合物の測定条件を決定するため，カラムを使用せずに分析を行うフローイン ジェクション分析によって最適化した．フローインジェクション分析条件を以下に記 す．移動相 (A) は超臨界二酸化炭素を使用し，移動相 (B) は0.1% (w/v) の酢酸アン モニウムを添加したメタノールを使用した．インジェクション量は2 μLに設定した．

流速は1.0 mL min^‒1に設定し，メイクアップポンプの流速は0.1 mL min^‒1に設定した．

移動相 (B) は 40%のアイソクラティック条件で実施した．カラムオーブン温度は 40

˚Cに設定した．背圧制御装置 (Active back pressure regulator, ABPR) は1500 psiに設定 した．分析条件は1分間に設定した．Xevo TQ-S microにはエレクトロスプレーイオ ン化法を接続した．また，MSの分析条件を以下に記す．キャピラリー電圧は3.0 kV に設定した．脱溶媒温度は500 ˚Cに設定した．コーンガス流速は50 L h^‒1，脱溶媒ガ

ス流速は50 L h^‒1に設定した．コーン電圧と衝突エネルギーは最小値を10 V，最大値

を80 Vに設定し，MSスペクトルを10 Vごとに取得した．

2‒5. SFC/QqQ-MS の分析条件

SFC の分析条件を以下に記す．移動相 (A) は超臨界二酸化炭素を使用し，移動相

(B) は0.1% (w/v) の酢酸アンモニウムを添加した混合溶媒 (メタノール:水=95:5, v/v)

を使用した．インジェクション量は1 μLに設定した．流速は1.0 mL min^‒1に設定し，

メイクアップポンプの流速は 0.2 mL min^‒1 に設定した．移動相 (B) は 1% (1 min), 1‒65% (11 min), 65% (6 min), 65‒1% (0.1 min), 1% (1.9 min) のグラジエント条件で実施 した．カラムオーブン温度は50 ˚Cに設定した．ABPRは1500 psiに設定した．分析 条件は20分間に設定した．カラムはACQUITY UPC^2TM エチレン架橋型ハイブリッド

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粒子 (Ethylene bridged hybrid, BEH)，2-エチルピリジン (2-ethylpyridine, 2-EP)，2-ピコ リルアミン (2-picolylamine, 2-PIC)，ジエチルアミン (Diethylamine, DEA)，ジオール (DIOL)，1-アミノアントラセン (1-aminoanthracene, 1-AA) カラム (100 × 3.0 mm i.d., particle size: sub 1.7 μm, Waters) を使用した (図15)．また，MSの分析条件を以下に記 す．キャピラリー電圧は3.0 kVに設定した．脱溶媒温度は500 ˚Cに設定した．コー ンガス流速は50 L h^‒1，脱溶媒ガス流速は50 L h^‒1に設定した．

図15 検討した6種類のカラムの構造

2‒6. 分析法の堅牢性の検証

最終濃度が1, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 100000 nMの合成脂質標 準品の混合溶液を調製し，各脂質クラスに特有な内部標準物質を添加することで検量 線を作成した．WHHLMI ウサギの血漿サンプル抽出時に内部標準物質を添加し，各 脂質分子と内部標準物質のピーク面積値の比率を検量線に乗せることで各脂質分子 の濃度を定量した．さらに，算出された濃度と同濃度の合成脂質標準品を血漿脂質抽 出溶液に添加して再度測定することで分析における回収率を算出した．

2‒7. データ解析

脂質分子の同定と定量はMassLynxソフトウェアversion 4.1 (Waters) を用いた．各 脂質分子の m/z や RT，検出する MRM トランジションを設定し，各クロマトグラム のベースラインを引くことでピーク面積値を算出した．リン脂質や DAGなど 2種類 のMRM トランジションを設定している化合物については，2つのクロマトグラムの ピーク面積値を合算した．

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2‒8. 統計解析

カラムスクリーニングの結果は，AIoutput2ソフトウェアversion 1.29を用い⁷²⁾，主 成分分析 (Principal component analysis, PCA) により解析した．