37
38
図 1 定量 PCRによる validation：口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）に おける chemokine（C-X-C motif） ligand 9（CXCL9）の mRNA発現
健常者（healthy control： HC）（n=6）、IgG4関連疾患（IgG4-related disease： IgG4-RD）
患者（n=12）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者（n=15）のLSG におけるCXCL9のmRNA発現を定量PCRにより比較した。SS患者、IgG4-RD患
者のLSGでは、それぞれHCよりもCXCL9のmRNA発現が有意に上昇していたが、
SS患者とIgG4-RD患者に有意差は認められなかった。
NS: not significant. *p<0.05（Kruskal-Wallis検定による）
C XC L9 / G APD H
NS
*
*
0 2 4 6 8 10 12
HC IgG4-RD SS
39
図 2 定量 PCRによる validation：口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）に おける nuclear receptor subfamily 4, group A, member 2（NR4A2）の mRNA発 現
健常者（healthy control: HC）（n=6）、IgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD）
患者（n=12）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者（n=15）のLSG におけるNR4A2のmRNA発現を定量PCRにより比較した。SS患者のLSGでは、
IgG4-RD患者よりもNR4A2のmRNA発現が有意に上昇していた。
*p<0.05（Kruskal-Wallis検定による）
0 1 2 3 4
HC IgG4-RD SS
N R 4A2 / G APD H
*
40
図 3 定量 PCRによる validation：口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）に おける CD26（dipeptidyl peptidase-4: DPP4）の mRNA発現
健常者（healthy control: HC）（n=6）、IgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD）
患者（n=12）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者（n=15）のLSG におけるCD26のmRNA発現を定量PCRにより比較した。SS患者とIgG4-RD患 者のLSGにおけるCD26のmRNA発現に有意差は認められなかった。
NS: not significant.（Kruskal-Wallis検定による）
0 1 2 3 4 5 6 7 8
HC IgG4-RD SS
C D 26 /G APD H
NS
41
図 4 定量 PCRによる validation：口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）に おける serum and glucocorticoid-regulated kinase 1（SGK1）の mRNA発現 健常者（healthy control: HC）（n=6）、IgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD）
患者（n=12）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者（n=15）のLSG におけるSGK1のmRNA発現を定量PCRにより比較した。SS患者とIgG4-RD患 者のLSGにおけるSGK1のmRNA発現に有意差は認められなかった。
NS: not significant.（Kruskal-Wallis検定による）
0 2 4 6 8 10 12
HC IgG4-RD SS
SGK1/GAPDH NS
42
図 5 定量 PCRによる validation：口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）に おける interferon regulatory factor 4（IRF4）の mRNA発現
健常者（healthy control: HC）（n=6）、IgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD） 患者（n=12）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者（n=15）のLSG におけるIRF4のmRNA発現を定量PCRにより比較した。SS患者のLSGでは、
IgG4-RD患者、HCよりもIRF4のmRNA発現が有意に上昇していた。
NS: not significant. *p<0.05（Kruskal-Wallis検定による）
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07
HC IgG4-RD SS
IR F 4/ G APD H
NS
*
*
43
図 6 定量 PCRによる validation：口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）に おける phosphoinositide-dependent kinase-1（PDK1）の mRNA発現
健常者（healthy control: HC）（n=6）、IgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD）
患者（n=12）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者（n=15）のLSG におけるPDK1のmRNA発現を定量PCRにより比較した。SS患者とIgG4-RD患 者のLSGにおけるPDK1のmRNA発現に有意差は認められなかった。
NS: not significant.（Kruskal-Wallis検定による）
0 5 10 15 20
HC IgG4-RD SS
PDK1/GAPDH
NS
44
図 7 口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）の蛍光免疫染色：NR4A2、CD3 シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者とIgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD）患者のLSG切片を用い、NR4A2とCD3の二重染色を行った。
NR4A2は、SS患者のLSGに浸潤したCD3陽性T細胞の核内において特異的に発
現がみられた。
破線で囲まれた領域につき、右に拡大図を示した。
Scale bar = 25 µm. DAPI: diamidino-2-phenylindole.
NR4A2
Isotype
CD3
Isotype
DAPI
DAPI
Merge
Merge
SS SS IgG4-RDIgG4-RD NR4A2
Isotype
CD3
Isotype
DAPI
DAPI
Merge
Merge
CD3陽性T細胞における共染色
45
図 8 口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）の蛍光免疫染色：NR4A2、CD4 シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者とIgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD）患者のLSG切片を用い、NR4A2とCD4の二重染色を行った。
NR4A2は、SS患者のLSGに浸潤したCD4陽性T細胞の核内において特異的に発
現がみられた。
破線で囲まれた領域につき、右に拡大図を示した。
Scale bar = 25 µm. DAPI: diamidino-2-phenylindole.
SS
NR4A2 CD4 DAPI Merge
NR4A2 CD4 DAPI Merge
Isotype Isotype DAPI Merge
Isotype Isotype DAPI Merge
SS IgG4-RDIgG4-RD
CD4陽性T細胞における共染色
46
図 9 口唇唾液腺（labial salivary gland: LSG）の蛍光免疫染色：NR4A2、IL-17 シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）患者とIgG4関連疾患（IgG4-related disease: IgG4-RD）患者のLSG切片を用い、NR4A2とIL-17の二重染色を行った。
NR4A2は、SS患者のLSGに浸潤したIL-17産生細胞の核内において特異的に発現
がみられた。
破線で囲まれた領域につき、右に拡大図を示した。
Scale bar = 25 µm. DAPI: diamidino-2-phenylindole.
SS SS IgG4-RDIgG4-RD
NR4A2 IL-17 DAPI Merge
Isotype Isotype DAPI Merge
NR4A2 IL-17 DAPI Merge
Isotype Isotype DAPI Merge
IL-17陽性細胞における共染色
47
図 10 末梢血 CD4陽性 T細胞における NR4A2の mRNA発現
健常者（healthy control: HC）（n=10）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）
患者（n=22）の末梢血CD4陽性T細胞におけるNR4A2のmRNA発現を定量PCR により比較した。SS患者の末梢血CD4陽性T細胞では、NR4A2のmRNA発現が HCよりも有意に上昇していた。
*p<0.05（Mann-Whitnety検定による）
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
0 0.5 1 1.5 2
*
NR4A2/GAPDH
HC SS
48
図 11 末梢血 CD4陽性 T細胞の Th17分化誘導
健常者（healthy control: HC）（n=3）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）
患者（n=5）の末梢血CD4陽性T細胞をTh17分化条件、Th0条件で7日間培養後、
フローサイトメトリーによりIL-17、IFN-γ発現を検討した。
A：HC、SS患者の末梢血CD4陽性T細胞をTh17分化条件、Th0条件で7日間培 養後、フローサイトメトリーによりCD4陽性T細胞ゲートにおけるIL-17、IFN-γ発 現を比較した（代表的な症例のドットプロット図）。
B：Th17分化条件、Th0条件で培養後のCD4陽性T細胞中のIL-17+IFN-γ-細胞の割 合（%）をHC（n=3）とSS患者（n=5）で比較した。SS患者において、Th17分化 誘導後のCD4陽性T細胞におけるIL-17+IFN-γ-細胞の割合（%）はHCよりも有意に 高値であった。一方、Th0条件では両者に有意差を認めなかった。
NS: not significant. *p<0.05（Mann-Whitnety検定による）
A
Th17 condition!
IL-17!
IFN-γ!
0 102 103 104 105
0 102 103 104 105
SS13 Th17 sample.fcs…FSC-A, SSC-A subset
<APC-A>: IFN-g APC-A
<FITC-A>: IL-17 FITC-A
3.07 0.34
2.47 94.1
0 102 103 104 105
0 102 103 104 105
SS13 Th0 sample.fcs…FSC-A, SSC-A subset
<APC-A>: IFN-g APC-A
<FITC-A>: IL-17 FITC-A
1.74 0.51
11 86.7
0 102 103 104 105
0 102 103 104 105
HC1 Th17 sample.fcs…FSC-A, SSC-A subset
<APC-A>: IFN-g APC-A
<FITC-A>: IL-17 FITC-A
1.3 0.086
6.15 92.5
0 102 103 104 105
0 102 103 104 105
HC1 Th0 sample.fcs…FSC-A, SSC-A subset
<APC-A>: IFN-g APC-A
<FITC-A>: IL-17 FITC-A
0.68 0.059
3.38 95.9
Th0 condition!
SS!
HC! B
1.3 0.086
92.5 6.15
3.07 0.34
94.1 2.47
0.68 0.059
95.9 3.38
1.74 0.51
86.7 11
*
NS
IL-17+IFN-γ- / CD4+ (%)
0 1 2 3 4 5 6 7
HC SS Column
AO
HC SS
Th0 condition Th17 condition
49
図 12 ベースラインにおける NR4A2の mRNA発現量と Th17分化誘導後の IL-17産生細胞数との相関
健常者（healthy control: HC）（n=3）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）
患者（n=5）の末梢血CD4陽性T細胞をTh17分化誘導した後のCD4陽性T細胞に おけるIL-17+IFN-γ-細胞の割合（%）とベースラインのCD4陽性T細胞における
NR4A2のmRNA発現量につき、相関解析を行った。両者には有意な正相関がみられ
た（Spearman R=0.87）。 0 1 2 3 4 5 6 7
0 0.2 0.4 0.6 0.8
NR4A2/GAPDH baseline Spearman R = 0.87
p < 0.01
○ HC
● SS IL-17+IFN-γ- / CD4+ (%)
50
図 13 Th17分化誘導における NR4A2のタンパク質発現
ナイーブCD4陽性T細胞（健常者）をTh17分化条件、Th0条件で培養したときの
NR4A2のタンパク質発現の推移を蛍光免疫細胞染色により検討した（全て倍率200
倍、露光時間1/5秒で観察した）。
A：Th17分化条件、Th0条件の各時間におけるNR4A2の蛍光免疫細胞染色を比較し た。
Scale bar = 25 µm.
B：Th17分化条件、Th0条件の各時間におけるNR4A2の蛍光強度をBZ-X analyzer
（Keyence）を用いて定量化し、比較した。Th17分化条件、Th0条件のいずれにお
いても、NR4A2のタンパク質発現は0hと比較し、経時的に有意な増加を示した。一
方、各時間においてTh17分化条件とTh0条件に差は認められなかった。
NS: not significant. *p<0.05（Mann-Whitney検定による）
0h
Cell fluorescence intensity
NS
*
* *
*
* *
0 2 4 6 8 10 12 14
Th0 Th17 Column H Th0 Th17 Column K Th0 Th17 Column N Th0 Th17
1h 24h 7d
NS
NS
NS
Th17 condition
Th0 condition
A B
0h 1h 24h 7d
51
図 14 Th17分化誘導における NR4A2の細胞内局在
ナイーブCD4陽性T細胞（健常者）をTh17分化条件、Th1分化条件、Th0条件で 培養したときのNR4A2の細胞内局在（培養4日目）を蛍光免疫細胞染色により検討 した（全て倍率1000倍、露光時間1/15秒で観察した）。
A：Th17分化条件、Th1分化条件、Th0条件（培養4日目）におけるNR4A2の蛍光 免疫細胞染色を比較した。Th17分化条件において、特異的にNR4A2の核内への局 在が認められた。▲はNR4A2の発現部位を示す。
DAPI: diamidino-2-phenylindole. Scale bar = 5 µm.
B：Th17分化条件、Th1分化条件、Th0条件（培養4日目）におけるNR4A2の核内 発現率（%）をBZ-X analyzer（Keyence）を用いて自動定量化し、比較した。Th17 分化条件において、Th1分化条件、Th0条件と比較し、NR4A2の核内発現率が有意 に亢進した。
NS: not significant. *p<0.05（Kruskal-Wallis検定による）
A
0 102 103 104 105
0 102 103 104 105 Th0 condition.fcs…FSC-A, SSC-A subset
APC-A: IFN-g APC-A
PE-A: IL-17 PE-A
0.047 0
2.54 97.4
0 102 103 104 105
0 102 103 104 105 Th1 condition.fcs…FSC-A, SSC-A subset
APC-A: IFN-g APC-A
PE-A: IL-17 PE-A
0.037 4.77e-3
20.3 79.7
IFN-γ
IL-17
2.1%
0.24%
0.0%
20.3%
0.0%
2.5%
NR4A2 / DAPI
Th17Th1Th0
Polarization condition (day4)
B
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Th0 Th1 Th17
*
*
NS
% of nuclear fluorescence
Polarization condition (day4)
52
図 15 SS患者の Th17分化誘導における NR4A2の細胞内局在
健常者（healthy control: HC）（n=3）、シェーグレン症候群（Sjögren's syndrome: SS）
患者（n=5）のナイーブCD4陽性T細胞をTh17分化条件、Th0条件で培養したとき
のNR4A2の細胞内局在（培養4日目）を蛍光免疫細胞染色により検討した（全て倍
率1000倍、露光時間1/15秒で観察した）。
A：Th17分化条件、Th0条件（培養4日目）におけるNR4A2の蛍光免疫細胞染色を
HC、SS患者で比較した。
DAPI： diamidino-2-phenylindole. Scale bar = 5 µm.
B：Th17分化条件、Th0条件（培養4日目）におけるNR4A2の核内発現率（%）を HC（n=3）、SS患者（n=5）で比較した。SS患者では、Th17分化条件におけるNR4A2 の核内発現率がHCと比較し有意に亢進した。
なお、HCとSS患者の比較はMann-Whitney検定により行い、Th17分化条件とTh0 条件の比較はWilcoxonの符号順位検定により行った。
NS: not significant. *p<0.05
SS
Th17Th0
Polarization condition (day 4)
HC
NR4A2 / DAPI
A B
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0 1 2 3 4 5 6
*
NS
% of nuclear fluorescence (average)
○ HC
● SS
Th0 Th17
Polarization condition (day 4) NS
*
53
図 16 Importazole（IPZ）による NR4A2の核内移行阻害
ナイーブCD4陽性T細胞（健常者）をTh17分化条件、Th0条件で培養し、dimethyl sulfoxide（DMSO）（コントロール）またはIPZを添加したときのNR4A2の細胞内 局在（培養4日目）を蛍光免疫細胞染色により検討した（全て倍率1000倍、露光時 間1/15秒で観察した）。
A：Th17分化条件、Th0条件において、DMSOまたはIPZを添加したときのNR4A2 の蛍光免疫細胞染色（培養4日目）を比較した。▲はNR4A2の発現部位を示す。
DAPI: diamidino-2-phenylindole. Scale bar = 5 µm.
B： Th17分化条件、Th0条件において、DMSOまたはIPZを添加したときのNR4A2 の核内発現率（%）（培養4日目）を自動定量化し、比較した。Th17分化条件におい て、NR4A2の核内発現率はIPZにより有意に抑制された。
NS: not significant. *p<0.05（Mann-Whitney検定による）
Th0 condition 0
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
DMSO IPZ Column
U DMSO IPZ
IPZ
Th17Th0
Polarization condition (day 4)
DMSO
NR4A2 / DAPI
*
NS
% of nuclear fluorescence
A B
*
NS
Th17 condition