表6 胎子心臓に対する使用抗体一覧
実験2で用いた抗体の種類,希釈倍率と希釈溶液を示した。
表7 胎子脳に対する使用抗体一覧
実験3で用いた抗体の種類,希釈倍率と希釈溶液を示した。HIF1α抗体とOlig.2抗体 の二重染色を行い,SVZにおけるHIF1αタンパク質の局在の検出に用いた。
表８ 胎子脳に対する使用プライマイー一覧
HIF1αとmTORの発現量を HPRT1をハウスキーピング遺伝子として相対的発現量
を評価した。
表9 母体低タンパク質食負荷により発現が増加したHIF1α下流遺伝子 HK1を含む21遺伝子のmRNA発現量が増加した。
表10 母体低タンパク質食負荷により発現が減少したHIF1α下流遺伝子 19遺伝子のmRNA発現量が減少した。
表11 母体低タンパク質食負荷により発現が増加したHIF1α下流遺伝子のまとめ 10遺伝子のmRNA発現量が増加した。低酸素状態における発現量増加に関する引用 文献を右側に示した。
表12 母体低栄養により発現が増加したmTOR下流遺伝子のまとめ
4 遺伝子の mRNA 発現量が増加し，１遺伝子の mRNA 発現量が減少した。mTOR
図1 母体低タンパク質食負荷による胎子数への影響および胎子数による胎子体重へ の影響評価
一腹あたりの胎子数は母体低タンパク質食負荷によって有意な変化を認めず(a)，一腹 あたりの胎子数が 6−9 匹の範囲で母体の栄養条件に関係なく胎子の体重はほぼ一定 の値（N: 0.8026 ± 0.01021, L: 0.8205 ± 0.009915） を示した（b）。
N: N群, L: L群
(a) 各カラム内の数値は母体数を表す。
(b) 数値は各群の胎子数を表す。
図2 実験処置の概要
実験処置の概要を経時的に示した。上段が母体の週齢，中段が胎齢，線を挟んだ下段 が処置内容を表す。
図3 E15における母体腟の炎症評価
各パネルは(a) N-PBS群, (b) N-LPS群, (c) L-PBS群 , (d) L-LPS群を示す。LPSま たはPBS(-)を経腟投与24時間後の膣組織像。LPS 投与群(N-LPS, L-LPS)で好中球 およびマクロファージ（白矢印）が観察された。スケールバーは100 µmを表す。
N: N群, L: L群, PBS: PBS投与群, LPS: LPS投与群
図 4 妊娠状態の評価および胎子と新生子の成長 (a) 妊娠中の母体体重増加
4群は同様の体重増加を示した。
(b) 母体タンパク質摂取量
毎日の餌の摂取量に各餌のタンパク質含有量を掛けて算出した。L群の母体のタンパ ク質摂取量はN群と比べて約半分に制限された。括弧内の数字は母体数を表す。
(c) 胎齢17日目の胎子体重 (d) 7日齢の新生子体重
実験1では胎子期および新生子期共に母体低タンパク餌負荷で体重が減少した。
N: N群, L: L群, PBS: PBS投与群, LPS: LPS投与群
各カラム内の数字は胎子または新生子数を表し,棒グラフは平均値 標準誤差で表し た。
†1: p値 < 0.05二元配置ANOVAでN群と比較
図5 オリゴデンドロサイト前駆細胞(赤)とアポトーシス(緑)の検出
胎齢17日目胎子脳の白質をOlig.2 抗体(赤)とTUNEL法(緑)によって染色した。核 はDAPIを用いて青色に染色した。
(a) N-PBS群, (b) N-LPS群, (c) L-PBS群 , (d) L-LPS群を示す。TUNEL陽性を示 すアポト-シス細胞は観察されず, Olig.2陽性細胞(オリゴデンドロサイト前駆細胞)の 染色性に差を認めなかった。ケールバーは50 µ mを表す。
図6 オリゴデンドロサイト分化の評価
7日齢の新生子脳の白質をMBP 抗体（赤）によって染色した。核はDAPIを用いて 青色に染色した。
(a) N-PBS群, (b) N-LPS群, (c) L-PBS群 , (d) L-LPS群, (e) MBP陽性細胞数
パク食負荷と LPS 投与の相互作用によって MBP 陽性細胞数は減少した。スケール バーは100 µmを表す。N: N群, L: L群, PBS: PBS投与群, LPS: LPS投与群
*: p値 < 0.05 Dunnett’s Testで N-PBS, N-LPS, L-PBSと比較。
各カラム下の数字は胎子または新生子数を表し,棒グラフは平均値 標準誤差で表し た。
図7 新生子脳の炎症評価
7日齢の新生子脳の白質をnestin 抗体(赤)とGFAP抗体(緑)によって染色した。核は DAPIを用いて青色に染色した。
(a) N-PBS群, (b) N-LPS群, (c) L-PBS群 , (d) L-LPS群, (e) GFAP抗体陽性細胞, (f) GFAP抗体- nestin 抗体二重陽性細胞がGFAP抗体陽性細胞に占める割合
4群間でアストロサイトの細胞数には有意差がなかったが、LPS投与によって反応性 アストロサイトを示す黄色い繊維（白矢印:特に白破線の楕円形内に注目）の割合が 増加した。スケールバーは100 µmを表す。
N: N群, L: L群, PBS: PBS投与群, LPS: LPS投与群, SVZ: 大脳腹側側脳室周囲胚細 胞層
*; p値 < 0.05二元配置ANOVAでPBS投与群と比較。
各カラム下の数字は胎子または新生子数を表し,棒グラフは平均値 標準誤差で表し た。
図8 実験処置の概要
実験処置の概要を経時的に示した。上段が母体の週齢，中段が胎齢，線を挟んだ下段 が処置内容を表す。
図9 妊娠状態の評価
実験2. 3の妊娠中の母体体重増加およびタンパク質摂取量は実験1と同傾向を示した。
括弧内の数字は母体数を表す。
図10 胎子体重と臓器重量
(a) 雄胎子体重, (b) 雌胎子体重, (c) 雄心臓重量比, (d) 雌心臓重量比
実験2, 3では実験1と異なり,母体低タンパク餌負荷による胎子重量減少が見られな
かった。雌では母体低タンパク餌負荷によって相対的な心臓重量の増加を認めた。
N: N群, L: L群
各カラム内の数字は胎子または新生子数を表し,棒グラフは平均値 標準誤差で表し た。
*: p 値 < 0.05 Mann Whitney testでN群と比較。
図11 母体低タンパク質食負荷による胎子心臓のmRNA発現量の変化
マイクロアレイ解析による7,242遺伝子の有意mRNA発現量変化をvolcano plotに て表した。X軸はN群と比較したL群のmRNA発現量の変化率を表し,Y軸はp値 を表す。HIF1αとPHD1 (HIF1α抑制因子), HK1 （解糖系調整遺伝子）を赤色で表 示した。
図12 HIF1αとPHD１のmRNA発現量におよぼす母体低タンパク質食負荷の影響 (a) 雄心臓HIF1α発現量, (b) 雌心臓HIF1α発現量, (c) 雄心臓PHD1発現量, (d) 雌
雄はL群のHIF1α, PHD1のmRNA発現量が有意に増加したが,雌ではmRNA発現 量に有意な差を認めなかった。相対的な発現量は2-∂Ct法で計算し、GAPDHのmRNA 発現量との相対値で表示した。
各カラム内の数字は胎子を表し,棒グラフは平均値 標準誤差で表した。
*: p 値 < 0.05 Mann Whitney testでN群と比較。
図13 HIF1αとPHD１のmRNA発現量の相関 (a) N群の雄, (b) N群の雌, (c) L群の雄, (d) L群の雌
N群では両性でHIF1αとPHD１のmRNA発現量の間で強い正の相関関係を示した
（雄: R2=0.6666, p=0.0022, 雌： R2= 0.6167, p= 0.0071)。L群では両性でHIF1α とPHD１のmRNA発現量の間に有意な相関関係を認めなかった。各パネルの数字は サンプル数を表す。
図14 胎子心臓の病理像
(a, e) N群の雄, (b, f) N群の雌, (c, g) L群の雄, (d, h) L群の雌
HIF1α抗体(赤) によって染色した。核はDAPIを用いて青色に染色した。
(a, b) N群では両性共に心室中隔にHIF1αタンパク質の蓄積を認めなかった。(c, d) L群では両性共に心室中隔にHIF1αタンパク質の蓄積を認めた。(g) HE染色でL群の 雄にのみ空胞変性（黒矢印）が出現し,他の群と比べて高い細胞密度を観察した。ス ケールバーは100 µmを表す。
図15 母体低タンパク質食負荷による胎子脳一般状態への影響 (a) 雄脳重量比, (b) 雌脳重量比
脳重量が体重に占める割合に母体低タンパク餌負荷による変化は認められなかった。
hypoxyprobe染色を用いて低酸素状態を評価した。両性の染色性に違いを認めなかっ
たので雄の染色像を提示した。
(c) N群雄のhypoxyprobe染色像, (d) N群雄のhypoxyprobe染色像, (e) 陽性対照の hypoxyprobe染色像
N群, L群共に低酸素状態を示すhypoxyprobe陽性細胞は殆ど観察されなかった。陽 性細胞を白矢印で示す。陽性対照には5分間低酸素状態を負荷した胎子脳を使用した。
スケールバーは100 µmを表す。
図16 胎子脳遺伝子発現量に対する母体低タンパク質食負荷の影響
(a) 雄脳HIF1α発現量, (b) 雌脳HIF1α発現量, (c) 雄脳mTOR発現量, (d) 雌脳
mTOR発現量
性別に両性共にL群のHIF1αとmTORのmRNA発現量が有意に増加した。
相対的な発現量は2-∂Ct法で計算し、HPRT1のmRNA発現量との相対値で表示した。
各カラム内の数字は胎子を表し,棒グラフは平均値 標準誤差で表した。
*: p 値 < 0.05 Mann Whitney testでN群と比較 (e) HIF1αとmTORのmRNA発現量の相関
性別や母体栄養条件に関係なくHIF1αとmTOR のmRNA発現量の間に強い正の相 関(R2=0.7700, p < 0.0001)が確認された。
(f) 母体低栄養によるHIF1α下流遺伝子の発現量に対する影響
PAGE 法にて検出した有意な増加を示した遺伝子群を機能ごとに分類し,N 群と比較 した発現量の変化率で表した。