付属実験  ラット胆汁の採取

 25（0H）D。（！mg），25（0H）D2（0．5mg），D。（1mg）又はD。（1mg）をd㎞cthy1su1foxidc（O．1 m1）に溶解，生理食塩水（0．7m1）とTw㏄n80（0．2m1）で懸濁後，ラットに経口投与．

エーテル麻酔下，ラット腹部を切開，胆管にポリエチレンチューブを挿入，投与後 24h胆汁を採取．

 ラット胆汁中25（OH）D，G及びD，3Gの検索

 25（0H）D。又はD。投与ラットより得た胆汁試料（各12m1）をO．5M NaH，p0、一NもHP0，

buffer（PH7・0，480m1）で希釈後，Bond E1ut C18カートリッジに吸着、H，0（！0m1）で洗 浄後・ステロイドをMcOH（5m1）で溶出．溶出液にH，0（0．56m1）を加え，90％McOH 溶液としたものをPHP−LH−20カラムに通導．90％McOH（5m1），0，1MAcOH／90％

McOH（5m1）で順次洗浄後，0．2M HC00H／90％MeOH（！0m1）でクルクロニド画分を 溶出，溶媒留去．残溢をprcp．UV旧PLC｛TSKgc10DS−80TM；McCN−2％NaC10、（pH

3・0）（1：1）；cR17−19min［25（0H）D33Gl，！4−！6min［25（OH）D325G1又はMcOH−2％NaC10、

（PH3・0）（！2：1）；c．！0・5−11・5min（D．3G）｝に付した．各画分を5％NaHC0。で中和しH，O

で希釈後，Bond E1utC18カートリッジにより脱塩．McOH溶出液を減圧下留去後，

MeOHに再溶解し，HPLC｛JlsphcreODS−M80；MeOH−2％NaC10、（PH3．0）（4：1），c．！5．6 min［25（0H）D33G］，！4．7min［25（0H）D325G］，McCN−2％Naα04（pH3．0）（！：1），cR！4．2 min［25（0H）D33G］，MeCN−2％NaC10。（pH13．0）（9：10），CR！6．4㎡n［25（OH）D325G］又は McOH−2％NaC10、（pH3．0）（！4：！）；c．8．9min（D．3G）；検出，UV及びフォトダイオードア

レイUV｝に付した．

 得られたクルクロニド画分125（0H）D33G，cα．3！ng；25（0H）D．25G，cα．27ng；D．3G，

cα．！5ng1にMBOTAD［cα．60叫9／AcOEt（100μ1）1を加え，室温で1h放置．McOH（3 drops）を加えて過剰の試薬を分解，溶媒留去．90％McOH（1m1）に溶解し，PHP−LH−

20カラムに通導．先と同様に洗浄後，0．1M AcONH、／90％MeOH（4m1）でクルクロニ ドを溶出．得られた画分をFLHPLC｛YMC・GEL C。；McOH−0．5％AcONH、（PH5．0）

（3：1），cR12．7，！4・5 （ma㎞）mh ［25（0H）D33G−MBOTAD］，10・0，！2．6 （main）min

［25（OH1）D325G−MBOTAD1，McCN−0・5％ AcONH4（PH 5．0）（7：10），cR 17．6 min

［25（0H）D33G−MBOTAD］，McCN−O・5％AcONH、（PH5・0）（7：！1），cR！5・4，工8．6（main）min

［25（0H）D325G−MBOTADl，McOH−0・5％AcONH4（PH5・O）（5：1），cR11・4，13．5（main）min

（D33G−MBOTAD），MeCN−0・5％AcONH、（PH5．0）（8：5），c，g．6min（D，3G−M二BOTAD）｝に 付した．

 得られた25（OH）D，G及びD，3G画分［cα．0．25nmo肥tOH（20μ1）1をacctatc buffcr（0．2 m1）で希釈・β一G1u㎝ronidasc（且。o〃，500Fishman unib）のacctatc buffcr（0．8m1）溶液と

混合し37℃，2h incubation後，氷冷下AcOEt（！m1）を加えて反応を停止．反応液を AcOEtで抽出，溶媒を留去後，残澄をMcOHに溶解し，UV旧PLC｛Jlsphcrc ODS−M80；

McOH−O・5％AcONH4（PH5・0）（5：！）；cR7．3min［25（0H）D33Gl，6．5m㎞［25（OH）D325Gl，

20．8㎞n［25（0H）D3】，McCN−H20（8：3），cR17．0min［25（OH）D3］，McOH−2％NaC1O、（pH

3．0）（14：1），c．10．2min（D．3G），20．6mh（D。），McCN−H．0（29：！），c．20．6m㎞（D。）｝により

ゲニンの生成を確認．なお，ピークの同定はいずれも標品との。o−chromatographyに

よった．

 ラット胆汁中25（OH）D．G及びD．3Gの検索

 25（0H）D。又はD。投与ラットより得た胆汁試料（各12m1）をD。系と同様の固相抽出，

PHlP−LH−20カラムに付し，得られたクルクロニド画分をPrcp．UV旧PLC｛TSKgc10DS−

80TM；McCN−2％NaC104（pH3．0）（10：9）；ごR15．5−16．5min［25（OH）D23G］，！2．5−！4．0min

［25（0H）D．25G1又はMcOH−2％NaC10、（PH3．0）（！2：1）；c，10．5−11．5m㎞（D．3G）｝により 精製．各画分を先と同様に脱塩後UV旧PLC｛Jlsphcre ODS−M80；M・0H−2％NaC10、（PH 3．0）（4：！），CR18．9mh〔25（0H）D23G］，！7．2min［25（0H）D225G】，McCN−0．5％AcONH、

（pH5．0）（2：3），CR！4．9min［25（0H）D23G］，9．7min［25（0H）D225G］，McOH−2％Naα04

（PH3．0）（12：！）；CR！1．5min（D23G）又はMcOH−0．5％AcONH、（PH5．O）（！2：1），cR8．5min

（D．3G）｝に付した．なお，ピークの同定は標品との。o−chromatographyによった、

 得られたクルクロニド画分［25（0H）D，3G，ω．140㎎；25（OH）D，25G，ω．200ng；D．3G，

cα．！60n4Mc0H（20叫1）1をLc／APcI−Ms＜Jlsphcrc0Ds−H80；Ac0NH、（65mM）含有

McCN−H．O（2：3），c．13・8mh［25（0H）D．3Gl，7．7min［25（OH）D．25G1，AcONH、（65mM）含 有McOH−H．0（19：！），c．4．9min（D．3G）；ドリフト電圧，一80V；べ一パライザー温度，2！0℃

［25（0H1）D．G1，170℃（D．3G）；検出，SIM｛25（0H）D．Gm／z：587［M−Hl一，D，3Gmた：57リM−

Hr｝又は全イオン検出（m／z：！00−700）〉に付した．

 さらに得られたクルクロニド画分［25（0H）D23G，cα．！700ng；25（OH）D，25G，cα．800 ng；D．3G，cα．500ng／McOH（20μ1）1をCH．N。のEら0溶液（適当量）と混和，室温で！h放 置．溶媒を留去後McOH1に再溶解し，LC／APCI−MS＜Jlsphcrc ODS−H80；AcONH、（65

mM）含有McOH−Hl．0（17：3），c．6．6min［25（0H）D．3G mcthy1cstc「］，6 4min［25（OH）D225G mcthy1cstcr1，AcONH、（65mM）含有McOH−H．0（97：3），c，6−3mh（D．3G mcthy1cstcr）；ドリ

フト電圧，15V；べ一パライザー温度，180℃；検出，SIM｛25（0H）D．G mcthy1cster，mた：

620［M＋NH，1＋，D23Gmethy1cstcr，m／z：604［M＋NH，1＋｝〉に付した・

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18）舳・1…M・，∫∫舳〃β1・・ん・m．，26，369−373（1987）．

19）C・1dw・11R・D・，T・・ff・・dD・J・H。，舳㎞H−L．J．，・Vit・mi・D．M．1。。、1、、，C，11，I、、、、d

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20）0k…T・・K…d・E・・N・k・・H・，K・d・m・S．，M・t…T．，M・mi・hiY．，M．jim．K．，

   Hi…N・lK・b・y・・hiT・，∫舳．∫・川舳1・・ム，32，449−462（1986）．

2！）H・11i・B・W・・R…B・A・，D・・p・・H・H・，しmb・・P．W．，∫！V〃グ．，111，384−390（！98！）．

22）L・V・・L・W・・S・㎞…H・K・，D・L…H．F．，肋・1肥m卿，20，222−226（1981）．

23）山田幸子，ビタミン，70，43−55（1996）．

24）Litwi11・・R・D・，M・tt・・V・R．，J・・dh・1．，K・m・・R．，∫肋ムα肥m．，257．749！．7494    （1982）．

25）K・m・・R・lN・g・b・・diS・，M・tt・・V．R．，L・・d・w・kiJ．M．，∫α加．〃〃舳，65，277−284    （！980）．

26）Be11P．A．，KodicekE．，励。c加肌∫，115，663−669（！969）．

27）K・m・・R・・N・g・b・・diS・，L・・d・w・kiJ．M．，几αわ．αj・．M以，96，278−284（！980）．

28）Pr6szynska K．，Lukaszkicwicz J．，Jaro㏄wicz N．，Lor㎝c R．S．，α加．C〃m．一4伽，153，

  85−92（1985）．

29）K・b・y・・hiN・lU・d・K・・晴t・h・・iJ・，Shim・d・K．，∫1ぴ舳，57，488−493（1992）．

30）S・・m・・kD・A・・T・・ff・・dD・J・H・・舳hH・L・J・，Clj・一C〃m＿伽，106，51−62（！980）．

3！）Shcpard R．M．，Horst R．L．，Hamstra A．J．，DcLuca H．F．，別。cノ比m．∫，182，55−69   （1979）．

32）Shimi・・M・1互w…kiY・・1・hid・H・・Y・m・d・S・，∫αげ・舳・gグβ，672，63−71（1995）．

33）Niwa T．，Fujita K．，Goto J．，Nambara T．，∫〃ワ．αげ。m〃。肝，16．2531−2544（！gg3）．

34）G・t・J・lH…g・w・M・lK・t・H・・N・mb・mT・，αj・・C〃・1一αα，87，141−！47（1978）．

35）Shim・d・K・・M・・g・・hi・・，∫αげ・舳肝，60・，1・・一！・・（1・9・）．

36）Shimセ・M・・Y・・洲・・，・・・・・…，励・・1・舳・ん・・！．ム鮒，・，1…一1・！・（1…）．

37）Shim・d・K・・Mit・・…K・，Mi…M。，Miy・m・t・A．，丸々．Cル。舳。。ブ．，18，288。．。893   （1995）．

38）Shim・d・K・・Mit・m・1・K・，K・jiH．，M・ht・M．，∫σげ・舳・gκ∫。止，32，l07−1！！

  （1994）．

39）Shim・d・K・・Mit・㎜・・K・・晴t・m・N・，肋m♂Cル・舳gグ，9，229−232（！995）、

40）Wi11㎞・M・C・・G・1d・i・h・・J・W．，∫1ぴ舳，36，255−282（1980）．

41）B・・k・・J・F・・肋・んj肌肋ル）吻，100，574−58！（1965）．

42）Fu・・tA・・園b1・・L・，M・i・・W・，舳．C〃m．一4・吻，66．2093−2！02（！983）．

43）B・ggi・阯E・G・・1…b・11iJ・A・ヲH・・・…yB．M．，U・k・k・・i・M．R．，∫一4m．α肥m．∫。。，

  104．2945−2948（1982）．

44）B・i・・D・H・R・，S㎞・㎞T・，Widd・w…D．A．，∫α肥m．∫・・．ρ，1971．！968．1974．

45）Tsuji M・・YokoyamaS・・TachibanaY・，肋〃・α肥肌∫oc．ψ〃．，62．3132−3！37（！989）．

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47）Sh㎞・d・K・・Mt㎝・工・K・，S・it・K・，0ht荻・Y．，N・k・t・・iL，∫肋舳．肋m・ 。αム，i．

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